干華磊，蘇 鵬，葉乃瑋，王承芳，曠文峰，毛偉力

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木霉菌制劑防治藏紅花枯萎病研究

干華磊，蘇 鵬，葉乃瑋，王承芳，曠文峰，毛偉力*

（上海萬力華生物科技有限公司，上海 201203）

將木霉（Spp）菌株TR121、TR358、TL09制成含2x108個(gè)/g孢子可濕性粉劑(WP)，用于防治藏紅花枯萎病的室內(nèi)生測(cè)。結(jié)果顯示，經(jīng)TL09 WP處理的藏紅花，枯萎病情指數(shù)(DS)顯著地低于（≤0.05）經(jīng)TR121、TR358和化學(xué)藥劑75%百菌清以及清水對(duì)照處理的DS。將TL09 WP繼續(xù)用于2015和2016年防治藏紅花枯萎病的田間藥效試驗(yàn)。經(jīng)TL09 WP 1kg/畝（TR1）和2 kg/畝（TR2）處理的藏紅花，其DS和防治效果（ERDC）分別顯著地（≤0.05）低于或高于化學(xué)藥劑75%百菌清（TR3，僅在2015年）和空白處理（TR4）。同時(shí)，經(jīng)TR1和TR2處理藏紅花的產(chǎn)量，也分別顯著地（≤0.05）高于TR3(僅在2015年)和TR4。

木霉菌；藏紅花；生物防治；防治效果

藏紅花(L)又稱番紅花、西紅花或撒馥蘭，屬鳶尾科番紅花屬多年生草本植物[1]?；ńz中含有活血化瘀、涼血解毒、安神健胃等功效的成分，有疏經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛、涼血解毒的作用，長(zhǎng)期服用可提高人體的免疫力[2-3]。此外，藏紅花還可大量用于日用化工、食品、染料工業(yè)，是美容化妝品與香料制品的原料，其球莖可做作為觀賞花卉[4]。藏紅花的主產(chǎn)國(guó)是伊朗，我國(guó)藏紅花的主要種植基地在河南、浙江和上海崇明等地[5]。由于藏紅花的資源有限，產(chǎn)量低，導(dǎo)致價(jià)格昂貴，已被國(guó)家中醫(yī)藥管理局列為重點(diǎn)發(fā)展的中藥材品種[4]。

近年來，由于農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的不斷惡化和植物病原菌對(duì)多種化學(xué)藥劑的抗藥性不斷增強(qiáng)，枯萎病已成為對(duì)藏紅花生產(chǎn)影響最大的病害之一。在藏紅花種球儲(chǔ)存期和定植期，發(fā)病率可高達(dá)30%~70%，嚴(yán)重影響了球莖、柱頭的品質(zhì)和產(chǎn)量，經(jīng)濟(jì)損失巨大[6]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾先后對(duì)該病害的致病性病原菌作過報(bào)道[7-8]，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征和分子學(xué)的鑒定方法，引起藏紅花枯萎病的病菌主要有尖孢鐮刀菌（)[9]、青霉菌（）、叢花青霉（）[10]和腐皮鐮刀菌（)[11]。目前對(duì)藏紅花枯萎病的防治主要采用化學(xué)藥劑，包括代森錳鋅、多菌靈、甲基托布津、多得清等[6,12]。但過多使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留和土壤、地下水污染等問題[13-15]。

為了減少和解決化學(xué)農(nóng)藥所引起的諸多問題，越來越多的科研工作者和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司開發(fā)和利用微生物農(nóng)藥產(chǎn)品，對(duì)多種作物病害開展生物防治[16-17]。郭榮君等[16]利用假單胞桿菌、芽孢桿菌等來防治大豆根腐病，防效達(dá)56.1%，增產(chǎn)7.6%；陳雪和趙克明[17]利用綠粘帚霉、鐮刀菌、木霉菌等防治棉花、水稻、小麥以及蔬菜等多種農(nóng)作物上的根部病害并取得了很好的防治效果。積極地推廣和應(yīng)用微生物農(nóng)藥，不僅對(duì)環(huán)境安全，同時(shí)不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，是確保我國(guó)未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展行之有效的措施之一。但目前使用生物農(nóng)藥防治藏紅花枯萎病的研究還不多見。本研究將篩選出的木霉菌株TL09制成可濕性粉劑，進(jìn)行大田藏紅花枯萎病防治試驗(yàn)，為生物防治藏紅花枯萎病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 木霉菌（spp）：菌株Tr85、Tr90、Tr121、Tr178B、Tr234C、Tr266B、Tr297A、Tr319、TR358、TL09，由上海萬力華生物科技有限公司（上海萬力華）提供。

病原菌：尖孢鐮刀菌(，F(xiàn)O16)，由上海萬力華從上海崇明島藏紅花種植基地的感病球莖中分離得到，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA，Difco）。

麥麩培養(yǎng)基（WBM）：麥麩4L、土豆560g、葡萄糖56g、V8混合蔬菜汁200mL。

1.1.3 藏紅花苗和供試基地 藏紅花苗（美麗）和供試基地都由上海崇明建設(shè)鎮(zhèn)上海市藥材有限公司提供。

1.1.4 供試藥劑 75%百菌清WP（先正達(dá)蘇州作物保護(hù)有限公司）；TL09 WP (上海萬力華)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 平皿對(duì)峙試驗(yàn) 采用平皿對(duì)峙培養(yǎng)法[18-20]，從保存在4 ℃恒溫冰箱里的FO16的平板上取直徑為5 mm的菌塊接種至PDA平板上，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25 ℃）5 d，在其菌落邊緣取5 mm的菌塊，置于PDA平板一側(cè)約2 cm處，取同樣大小的木霉（Tr85、Tr90、Tr121、Tr178B、Tr234C、Tr266B、Tr297A、Tr319、TR358、TL09）菌塊，置于平板對(duì)側(cè)相同位置。單個(gè)病原菌做空白對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)。將平板放置在培養(yǎng)箱中（25 ℃）進(jìn)行培養(yǎng)，5d后計(jì)算抑菌率[21-22]。

抑菌率=（對(duì)照病原菌落直徑-處理病原菌落直徑）/對(duì)照病原菌落直徑×100%

1.2.2 室內(nèi)生測(cè)篩選實(shí)驗(yàn) （1）固體病原菌接種體培養(yǎng)。從長(zhǎng)有FO16菌落的PDA平板中，取直徑為10 mm的菌塊5~10塊，接種至裝有1 L WBM培養(yǎng)基的3L三角瓶?jī)?nèi)，放置在室溫條件下（25±2 ℃）培養(yǎng)10 d，然后將FO16接種體晾干，用粉碎機(jī)研磨成碎屑狀，按含有1×106個(gè)/g FO16活孢子的比例與細(xì)沙混合，制成沙土混合接種體。

（2）室內(nèi)生測(cè)實(shí)驗(yàn)。在藏紅花基地，取未發(fā)生過枯萎病區(qū)域的土壤，晾干后，用80目網(wǎng)過篩并裝入直徑為15 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽裝入500g土和10 g混合接種體，混拌均勻后，將藏紅花苗移栽到營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)。實(shí)驗(yàn)處理包括：Tr121、Tr358、TL09 各菌株的WP稀釋200倍，75%百菌清稀釋1 000倍，以及清水空白對(duì)照。每個(gè)處理藥劑分別對(duì)藏紅花苗進(jìn)行灌根處理，每株灌藥水100mL。每個(gè)處理10缽，重復(fù)3次。苗缽放置在室溫條件下（25±2 ℃）生長(zhǎng)，采用藏紅花常規(guī)種植的水肥管理。25 d后進(jìn)行病情指數(shù)和防治效果調(diào)查。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：健全；1級(jí)：僅在葉片部小量失綠變黃或小斑點(diǎn)，病斑占整株的10%；3級(jí)：病斑部位占整株11%~25%；5級(jí)：病斑部位占整株26%~40%，且有呈現(xiàn)輕度矮化和扭曲癥；7級(jí)：病斑部位占整株41%~65%，有明顯矮化和扭曲癥，小部分葉片變褐枯；9級(jí)：病斑部位占整株65%以上，以至整株變褐枯或矮化、扭曲癥[23]。

病情指數(shù)=100×[Σ(各級(jí)病株數(shù)×病害級(jí)別數(shù))]/(調(diào)查總株數(shù)×9)

防治效果=[(空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù)－藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù))]/空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù)]×100%

1.2.3 大田藥效試驗(yàn) 2015和2016年大田藥效試驗(yàn)的定植日分別為12月3日和12月2日。前茬種植作物為水稻，定植密度為20 000株/畝，采用藏紅花常規(guī)的水肥種植管理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：TL09 WP 1 kg/畝（TR1）和2 kg/畝（TR2）、75%百菌清WP 200 g/畝（TR3）和空白對(duì)照（TR4）。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有2 000株苗，隨機(jī)排列。定植7 d后進(jìn)行一次噴灌，隨后每隔20 d處理1次，共處理3次。

調(diào)查時(shí)間和方法：球莖收獲前一個(gè)月，以每小區(qū)對(duì)角線四點(diǎn)取樣, 每個(gè)點(diǎn)調(diào)查50株，進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查；待球莖收獲時(shí)按同樣的方法取50株進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、病情指數(shù)、防治效果的測(cè)定同上。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 平皿對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

通過5 d的平皿對(duì)峙試驗(yàn)，木霉菌株TL09、TR121、TR358可以有效的抑制FO16的生長(zhǎng)，并將FO16覆蓋（見圖1-A）。同時(shí)TL09、TR121、TR358對(duì)FO16的生長(zhǎng)抑制率都顯著地（≤0.05）高于其他菌株（表1），分別達(dá)到83.74%、73.17%、78.05%，因此，選擇此3個(gè)菌株進(jìn)行室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)。

A：木霉TL09與病原菌FO16的平皿拮抗圖片； B：病原菌FO16單獨(dú)接種的平皿照片。

表1 木霉菌株與FO16平皿拮抗篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表中相同小寫英文字母表示兩者間無顯著差異（≤0.05）。

2.2 室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)

結(jié)果顯示（表2），經(jīng)TL09 WP和75%百菌清WP灌根處理的藏紅花植株的 DS和ERDC，都分別顯著性地≤0.05）低于或高于經(jīng)TR121WP、TR358WP和清水對(duì)照處理藏紅花植株的DS或ERDC。根據(jù)此生測(cè)篩選結(jié)果，繼續(xù)選用TL09WP進(jìn)行大田藥效測(cè)試。

表2 木霉菌WP防治藏紅花枯萎病室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

病情指數(shù)是各處理3次重復(fù)的平均值，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（≤0.05，Ducan氏新復(fù)極差法）。

2.3 田間藥效實(shí)驗(yàn)

從表3可以看出，在2015和2016年的大田藥效實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)TL09 WP 1 kg/畝（TR1）和2 kg/畝（TR2）以及75%百菌清WP（TR3）處理的DS、ERDC 或產(chǎn)量（除2016年的TR3外）之間，均無顯著性差異，但都分別顯著性（≤0.05）低于或顯著性高于空白對(duì)照（TR4）處理的DS和產(chǎn)量。

另外，根據(jù)2015和2016年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2016年各處理的DS均低于2015年的DS，這可能是由多方面的原因，包括兩年試驗(yàn)期間的天氣情況的不同所致（表3）。

表3 TL09 WP防治藏紅花枯萎病田間藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表中各病情指數(shù)值是每個(gè)處理3次重復(fù)的平均值，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（≤0.05，Ducan氏新復(fù)極差法）。

3 結(jié)論與討論

大力推廣和使用生物農(nóng)藥，既可以提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，又可以減少由化學(xué)農(nóng)藥所產(chǎn)生的各種污染。李衛(wèi)平等[24]利用木霉菌WP對(duì)黃瓜、番茄、莧菜、茄子等進(jìn)行苗期病害防治發(fā)現(xiàn)，經(jīng)木霉菌處理的幼苗病害防治效果明顯，發(fā)病率都低于15%，而對(duì)照處理的幼苗發(fā)病率高達(dá)53.6%。同時(shí)，經(jīng)木霉菌WP處理的黃瓜苗葉片濃綠、色深、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。楊春林等[25]研究表明，哈茨木霉不僅對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果可達(dá)64.5%，同時(shí)還能增加植株的株高、地莖、葉片數(shù)以及品質(zhì)等。臺(tái)蓮梅等[26]研究6株木霉菌株均能促進(jìn)大豆植株生長(zhǎng)，其株高、莖粗、根長(zhǎng)、干物質(zhì)積累均比對(duì)照增加，同時(shí)還可減輕根腐病的發(fā)生，當(dāng)濃度為5×108個(gè)/g時(shí)，防效均在70%以上。本研究開展的兩年田間試驗(yàn)結(jié)果表明，木霉菌TL09WP對(duì)藏紅花枯萎病有較好的防治效果。當(dāng)TL09WP用量為1 kg/畝時(shí)，對(duì)病害的防效能達(dá)到64%以上，防治效果好于化學(xué)農(nóng)藥75%百菌清WP。同時(shí)經(jīng)TL09WP處理的藏紅花球莖在產(chǎn)量上也顯著高于空白和化學(xué)對(duì)照處理。

圖2 2015、2016 年試驗(yàn)期間天氣對(duì)比

試驗(yàn)期間的天氣狀況對(duì)病害的發(fā)生與發(fā)展程度，有著直接的影響。陳娟等[27]在研究木霉菌防治草莓苗期炭疽病時(shí)發(fā)現(xiàn)，臺(tái)風(fēng)和雨水多的天氣會(huì)增加炭疽病發(fā)生的概率。李洪濤[28]在研究保護(hù)地的番茄灰霉病發(fā)生規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，灰霉病害發(fā)生與天氣狀況密切相關(guān)，當(dāng)有兩個(gè)以上連續(xù)陰雨日，有利于灰霉菌孢子大量產(chǎn)生、造成嚴(yán)重侵染，晴朗的天氣對(duì)灰霉病的傳播起到了抑制作用。王麗等[29]研究了近50年來以來不同的氣候條件包括氣溫、降雨、日照等對(duì)不同作物的病害發(fā)生有著明顯的影響。本研究結(jié)果表明，2015年試驗(yàn)期間的降雨天數(shù)比2016年試驗(yàn)期間多了9d，這樣的氣候環(huán)境更有利于藏紅花枯萎病病原菌的傳播和浸染。因此，這也許就是造成2015年的病情指數(shù)高于2016年的原因之一。

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Study ofspp. Preparation Against Saffron Blight

GAN Hua-lei1, SU Peng2, YE Nai-wei3, WANG Cheng-fang4, KUANG Wen-feng5, MAO Wei-li*

(Shanghai Wanlihua Biological Technology Co., LTD, Shanghai 201203, China)

An indoor screening test was conducted with wettable powder (WP) formulations containing 2x108/g conidial spores of strain TR121, TR358 or TL09 ofspp. to prevent and control Saffron blight. The results showed that the disease severity (DS) of the saffron plants (SP) treated with TL09 WP was significantly lower (≤0.05) than that of the treatments of TR121 WP, TR358 WP, 75% chemical chlorothalonil and water controls. The formulation of TL09 WP was continually used in a field efficacy test to control the disease of Saffron blight in 2015 and 2016. The results revealed that the DS and the efficacy rate of disease control (ERDC, %) of the SP treated with TL09 WP of 15 kg/Hm2(TR1) and 30 kg/Hm2(TR2) were significantly lower or higher (≤0.05), respectively, than that of 75% chlorothalonil WP (TR3, only in 2015) and the control treatment (TR4). Meanwhile, the yields of the SP in TR1 and TR2 were significantly higher（≤0.05） than that in TR3 (only in 2015) and TR4.

spp.; Saffron blight; biological control; efficacy rate of disease control

S436.421.1+3

A

2095-3704（2018）01-0020-05

2017-12-04

2017-12-16

上海市科技發(fā)展基金“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”醫(yī)學(xué)與農(nóng)業(yè)領(lǐng)域（16391902400）

干華磊(1987—)，男，農(nóng)藝師，主要從事生物農(nóng)藥的研發(fā)與推廣，hlgan1026@163.com；

通信作者：毛偉力，博士，weilimao@hotmail.com。

干華磊, 蘇鵬, 葉乃瑋, 等. 木霉菌制劑防治藏紅花枯萎病研究[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2018, 41(1): 20-24.