王相玉，胡貿(mào)英，吳云飛，李 嵐，任國莉*

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枯草芽孢桿菌β-BS01誘變株對(duì)東北溫室常見真菌病害的抑制

王相玉1，胡貿(mào)英2，吳云飛2，李 嵐1，任國莉2*

(1. 佳木斯大學(xué) 理學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大學(xué) 農(nóng)業(yè)與環(huán)境生物技術(shù)研究所，黑龍江 佳木斯 154007)

利用效價(jià)測定法通過枯草芽孢桿菌β-BS01誘變和篩選實(shí)驗(yàn)，探究枯草芽孢桿菌β-BS01及其誘變株對(duì)東北溫室常見真菌病害的抑制效果。采用培養(yǎng)基優(yōu)化和紫外線誘變兩種方法對(duì)枯草芽孢桿菌β-BS01進(jìn)行突變，運(yùn)用隨機(jī)篩選法挑選出對(duì)東北溫室常見真菌病原菌抑制性增強(qiáng)的突變株并傳代10次驗(yàn)證突變株的遺傳穩(wěn)定。獲得了1株抑制東北溫室常見真菌病害能力增強(qiáng)的枯草芽孢桿菌突變株UBS-A29，其效價(jià)提高到34 AU/mL，提升了約1.7倍。經(jīng)過處理后的枯草芽孢桿菌進(jìn)一步加強(qiáng)了對(duì)真菌病害的抑制能力，具有控制和削弱溫室真菌病害的應(yīng)用潛力。

枯草芽孢桿菌；抑制作用；東北溫室；紫外線誘變；效價(jià)

枯草芽孢桿菌是我國建議推廣使用的微生物生防菌[1]，因其無毒無害，可分泌多種酶類，并具有強(qiáng)抗逆性、優(yōu)良的抑菌效果，在植物生防方面被認(rèn)為是較理想的生物防治菌株[2]，常被用于促進(jìn)植物生長和預(yù)防植物病害[3]。然而，從自然界中篩選純化的菌種通常抑菌效果和遺傳性狀穩(wěn)定較差，單獨(dú)依賴微生物群體的自然突變來選育特異性菌株難以滿足研究和生產(chǎn)需要[4]，因此本實(shí)驗(yàn)通過改變培養(yǎng)基成分及紫外誘變的方法篩選高效菌株[5]，采用誘變育種不僅可以增強(qiáng)芽孢桿菌對(duì)東北溫室常見真菌病害的抑制能力，而且還可以改進(jìn)菌種質(zhì)量，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，開發(fā)新品種[6]。為了進(jìn)一步控制和削弱東北溫室常見的真菌病害，本試驗(yàn)通過以枯草芽孢桿菌β-BS01為原始菌株，進(jìn)行紫外誘變，測定突變株對(duì)指示菌效價(jià)的改變，最終獲得一株高效抑制東北溫室常見真菌病害的生防菌株，旨在為后續(xù)工廠化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 實(shí)驗(yàn)菌株為枯草芽孢桿菌β-BS01()；指示菌為番茄晚疫病(黃瓜枯萎病(sp.Owen)、辣椒炭疽病()、辣椒晚疫病()、茄褐紋擬莖點(diǎn)霉((Sacc. Et Syd.)Harter.)均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基的配方 活化培養(yǎng)基配方采用BPY培養(yǎng)基[7]：牛肉膏4.6 g/L，酵母膏4.4 g/L，蛋白胨9.6 g/L，葡萄糖4.5 g/L，NaCl 4.5 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH調(diào)至7.2；菌種優(yōu)化培養(yǎng)基：牛肉膏4.5 g/L，蛋白胨9.5 g/L，NaCl 4.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MnSO4·H2O 0.4 g/L，瓊脂17.5 g/L，pH調(diào)至7.0；細(xì)菌蛋白胨液體誘變培養(yǎng)基(LBS)：牛肉膏2.9 g/L，NaCl 0.9 g/L，蛋白胨5.2 g/L，pH調(diào)至7.0；細(xì)菌蛋白胨培養(yǎng)基(LB)：牛肉膏2.9 g/L，NaCl 0.9 g/L，蛋白胨5.2 g/L，瓊脂18.5 g/L，pH調(diào)至7.0；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖19.2 g/L，瓊脂19.0 g/L，pH自然。

1.1.3 主要試劑 醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、0.80%生理鹽水和吐溫-80溶液(121 ℃滅菌20min)。

1.2 方 法

1.2.1 抑菌譜的測定 以實(shí)驗(yàn)室保藏的5種植物病原真菌為指示菌，采用杯碟法測定枯草芽孢桿菌β-BS01發(fā)酵上清液對(duì)真菌病原菌的抑菌效果。

1.2.2 生長曲線的測定 將4 ℃保存的枯草芽孢菌株β-BS01通過BPY培養(yǎng)基活化，活化后的菌株用接菌環(huán)接種于LBS培養(yǎng)基中，于32 ℃下160 r/min恒溫培養(yǎng)24~48 h，以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量移取至250 mL液體培養(yǎng)基中。取樣間隔2 h，經(jīng)3倍稀釋后，以蒸餾水做對(duì)照在波長600 nm下使用紫外分光光度計(jì)測OD值，橫坐標(biāo)時(shí)間，縱坐標(biāo)OD值作圖，即為枯草芽孢桿菌β-BS01的生長曲線。

1.2.3 枯草芽孢桿菌上清液的處理及病原體孢子懸液的制備 （1）上清液的處理：取10.0 mL培養(yǎng)48 h的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液加入無菌離心管，12 000 r/min離心12 min，用無菌注射器抽取上清液，0.22 μm無菌濾膜重復(fù)過濾3次。

（2）病原菌孢子懸液的制備：病原菌接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)。當(dāng)病原真菌孢子形成時(shí)，無菌水沖洗，無菌脫脂棉過濾，得到病原菌孢子懸液。血球計(jì)數(shù)板觀察孢子數(shù)，將其濃度稀釋到1×104cuf/mL移至無菌瓶中，封口備用。

1.2.4 上清液效價(jià)的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 （1）抗菌物質(zhì)效價(jià)的確定。以pH為6.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行倍數(shù)稀釋，即取樣200 μL進(jìn)行1、1/2、1/3、1/4、1/5梯度抑菌實(shí)驗(yàn)，將觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最低稀釋濃度定義為1個(gè)活力單位(1AU)，其倒數(shù)即原液的抗菌肽效價(jià)(AU/mL)。

（2）效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。將已知效價(jià)發(fā)酵液等比稀釋成9種濃度：1×10-1、2×10-1、3×10-1、4×10-1、5×10-1、6×10-1、7×10-1、8×10-1、9×10-1和1.0。分別取200 μL加入間隔的6個(gè)牛津杯于已制備好的平板A1~A10中。同時(shí)另取比例為5×10-1濃度的200 μL加入另外間隔的6個(gè)牛津杯于平板B1、B2、B3為對(duì)照試驗(yàn)，每個(gè)濃度均重復(fù)3個(gè)平板。橫坐標(biāo)為抑菌圈直徑的差值，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的效價(jià)對(duì)數(shù)，繪制效價(jià)曲線。

1.2.5 菌株的紫外線誘變選育 （1）誘變菌懸液的制備：將活化好的菌株β-BS01以2%接種量接入牛肉膏誘變培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至指數(shù)生長期，取10.0 mL培養(yǎng)液，5 500 r/min離心15 min，棄去上清液，采集菌體，用0.80%生理鹽水反復(fù)沖洗沉淀后離心，重復(fù)3次，將得到的菌懸液加入0.05 mL吐溫-80，然后充分振蕩混勻即為108個(gè)/mL細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液。

（2）紫外線(UV)誘變處理：開啟紫外燈預(yù)熱20 min，提取已制備的菌懸液10 mL于平板中，置于暗室36 W紫外燈下30 cm處，打開上蓋分別照射20、30、45、60、75和120 s，分別進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用涂布器均勻涂布在LB培養(yǎng)基平板上，另做未經(jīng)紫外照射的菌懸液涂布平板每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3個(gè)平板，于32 ℃遮光條件下培養(yǎng)48~72 h，觀察每個(gè)平板中菌落數(shù)并記錄，所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.30處理，做出枯草芽孢菌株β-BS01致死率曲線。

式中：為對(duì)照每平板活菌數(shù)；為處理后每平板活菌數(shù)。

（3）致死率時(shí)間選擇：選擇死亡率在80%~90%下生長出的完整菌落，經(jīng)無菌水稀釋至適當(dāng)濃度，涂布在平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑選單菌落160 r/min下發(fā)酵初篩即挑選出長勢較好抑制性較強(qiáng)的菌株30株轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，以出發(fā)菌株為對(duì)照，再次進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，重復(fù)3次，最終計(jì)算其效價(jià)。

1.2.6 高產(chǎn)菌株傳代穩(wěn)定性試驗(yàn) 為研究誘變的高效抑制東北溫室常見真菌病原的菌株遺傳特性是否穩(wěn)定，將經(jīng)紫外誘變得到的菌株按平板接種的方法，傳代10次，將每代得到的性狀優(yōu)良菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，測定其抑菌圈的直徑，計(jì)算效價(jià)，檢測突變菌性能穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌β-BS01抑菌譜的測定

枯草芽孢桿菌β-BS01發(fā)酵上清液對(duì)5種植物病原真菌均具有抑制作用，其中對(duì)番茄晚疫病抑制作用最好，抑制圈直徑達(dá)到了(24.92±0.60) mm(圖1)。

圖1 枯草芽孢桿菌β-BS01對(duì)部分植物病原真菌抑菌效果

圖2 枯草芽孢桿菌β-BS01的生長曲線

2.2 生長曲線的繪制

對(duì)枯草芽孢桿菌β-BS01的生長曲線進(jìn)行了測定，從曲線可以看出在培養(yǎng)4~10 h，細(xì)胞快速生長，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，而14 h后菌體吸光度不變即菌體生長速率減緩。因此，要采取培養(yǎng)10~14 h的枯草芽孢桿菌β-BS01進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖3 抑菌物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 紫外線誘變致死曲線

2.3 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過二倍系列稀釋法測定枯草芽孢桿菌β-BS01發(fā)酵上清液的效價(jià)，離心后稀釋1/4倍未出現(xiàn)抑菌圈，發(fā)酵上清液點(diǎn)樣量為200μL，說明該發(fā)酵上清液的一個(gè)活力單位為1/20其效價(jià)為20AU/mL。曲線回歸方程=0.192 9+0.885 7，回歸系數(shù)2=0.917 4?？芍r(jià)對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑差成良好的線性關(guān)系。因此該曲線可以作為標(biāo)準(zhǔn)曲線使用(圖3)。

2.4 紫外誘變處理

2.4.1 紫外誘變時(shí)間的選擇 出發(fā)菌株的致死率隨紫外線照射時(shí)間的增加不斷增大，照射30 s時(shí)，致死率為57.6%；照射60 s時(shí)，致死率增大至88.3%；照射120 s致死率高達(dá)97.7%。目前國內(nèi)原始菌株紫外誘變致死率大多選擇80%~90%，所以本實(shí)驗(yàn)選擇照射時(shí)間為60~75 s，作為最佳誘變時(shí)間(圖4)。

2.4.2 紫外誘變正突變株的篩選 利用紫外照射方法得到的枯草芽孢桿菌β-BS01突變菌株，隨機(jī)篩選30株接種于30 ℃下160 r/min搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，按照1.2.4的方法測量發(fā)酵液效價(jià)，從中選出3株效價(jià)最高的正突變菌株(表1)。

表1 紫外線(UV)誘變篩選結(jié)果

2.5 高產(chǎn)菌株傳代穩(wěn)定試驗(yàn)

將誘變后的高效突變株枯草芽孢桿菌UBS-A03與UBS-A29在平板上連續(xù)傳代10次，每一代平面培養(yǎng)均進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中UBS-A29的效價(jià)比較穩(wěn)定(表2)。

表2 菌種傳代穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明枯草芽孢桿菌β-BS01經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化和紫外線誘變后得到的一株高產(chǎn)突變種UBS-A29具有更高的抑菌效果，其效價(jià)由出發(fā)菌株的20 AU/mL提高到34 AU/mL，約是初始菌株枯草芽孢桿菌β-BS01的1.7倍且傳代10次較為穩(wěn)定，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。雖然本實(shí)驗(yàn)已在試驗(yàn)田塊做中試，但是對(duì)于大規(guī)模田間推廣需要做進(jìn)一步的研究，尤其是突變株對(duì)植物有益菌是否產(chǎn)生毒理作用尚未調(diào)查，對(duì)于上述問題有待于后續(xù)的研究。

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Mutation Breeding of Beta Bacillus Subtilis and Its Inhibitory Effectson Common Fungal Diseases in Northeast China

WANG Xiang-yu1, HU Mao-ying2, WU Yun-fei2, LI Lan1, REN Guo-li2*

(1. College of Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007, China; 2. Institute of Agricultural and Environmental Bio-technology, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007, China)

Mutagenesis and screening experiments on Bacillus subtilis β-BS01 were conducted by using the determination of titer, and the inhibitory effects of Bacillus subtilis β-BS01 and its mutants on common fungal diseases in Greenhouses in Northeast China were explored. Mutation of Bacillus subtilis β-BS01 was carried out by two methods of medium optimization and UV mutagenesis, and, a random screening method was used to prick off the mutant strains which could inhibit the growth of common fungal pathogens in the Northeast greenhouses and verified the genetic stability of the mutant 10 generations later. A Bacillus subtilis mutant UBS-A29 which could enhance the ability of common fungal diseases in Northeast greenhouses was obtained, and its titer was increased to 34 AU/mL, which was about 1.7 times higher. The treated Bacillus subtilis further enhanced the ability to inhibit fungal diseases, and had potentials for controlling and weakening the greenhouse fungal diseases.

Bacillus subtilis; inhibition; Northeast greenhouse; UV mutagenesis; titer

Q93-335

A

2095-3704（2018）01-0016-04

2017-11-08

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(201710222012)和黑龍江省教育廳基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2016-KYYWF-0546)

王相玉(1997—)，男，主要從事環(huán)境生物學(xué)研究，1251999795@qq.com；

通信作者：任國莉。

王相玉, 胡貿(mào)英, 吳云飛, 等. 枯草芽孢桿菌β-BS01誘變株對(duì)東北溫室常見真菌病害的抑制[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2018, 41(1): 16-19.