侯 曉，吳 潤，蒲萬霞

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新獸藥工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

隨著各種抗菌藥物層次不窮的出現(xiàn)，使臨床上的大多數(shù)感染性疾病得到控制。但同時(shí)也使人類和畜禽對抗菌藥物產(chǎn)生了依賴，從而增加了抗菌藥物的使用。從2004年人類使用抗菌藥藥物的總消費(fèi)已經(jīng)增長了20%。在丹麥，2013的抗菌藥物總消費(fèi)比2012年的高出1.2%，特別是四環(huán)素和青霉素[1]。我國目前抗菌藥物使用最多的還是頭孢霉素類和青霉素類，多集中在華東地區(qū)。在巨大的選擇壓力下，細(xì)菌產(chǎn)生出廣泛的機(jī)制來抵抗抗菌劑的作用，致使各種耐藥菌不斷出現(xiàn)。同時(shí)耐藥菌從細(xì)菌發(fā)展到真菌，病毒，寄生蟲，如耳念珠菌最初出現(xiàn)在日本，目前在美國疾病控制中心發(fā)布了將所有真菌的病例報(bào)告給該機(jī)構(gòu)的臨床警報(bào)[2]。耐藥菌的出現(xiàn)不僅危害人類的健康，還是重要的生態(tài)環(huán)境污染問題。加快研究新型抗耐藥菌藥物是解決問題的關(guān)鍵。

1 超級(jí)細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)

超級(jí)細(xì)菌并不是指一種細(xì)菌，而是對多重耐藥細(xì)菌的總稱，是對抗現(xiàn)有絕大多數(shù)抗生素的細(xì)菌。超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)并不是突然的，而是在漫長的歷史中累積和演變來的，抗生素的長期使用和濫用則加快了這一進(jìn)程。常見的超級(jí)細(xì)菌主要有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusaureus，MRSA)、耐多藥肺炎鏈球菌(multi drug resistantStreptococcuspneumoniae，MDRSP)、耐萬古霉素腸球菌(vancomycin resistant Enterococcus，VRE)、產(chǎn)超廣譜β 內(nèi)酰胺酶細(xì)菌(extended-spectrumβ lactamases，ESBLs)、碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC)、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multi-drug-resistantAcinetobacterbaumannii，MDRAB)、多重耐藥性結(jié)核桿菌(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和多重耐藥銅綠假單胞菌(multiple-drug resistantPseudomonasaeruginosa，MDR-PA)及攜帶有NDM-1的新型超級(jí)細(xì)菌等。目前，危害最嚴(yán)重的就是攜帶有NDM-1的新型超級(jí)細(xì)菌,因?yàn)樗幕钚圆课皇墙饘匐x子，首先在印度新德里被發(fā)現(xiàn)，因此將這種超級(jí)細(xì)菌稱為“新德里-金屬-β內(nèi)酰胺酶-1”(New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1)，它能水解幾乎所有含β內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的抗生素，主要存在于大多數(shù)細(xì)菌的DNA和質(zhì)粒中，從而使細(xì)菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性[3]。

2 超級(jí)細(xì)菌的耐藥性

細(xì)菌的耐藥性正是細(xì)菌對藥物產(chǎn)生了抗性基因，使細(xì)菌對藥物的敏感性降低甚至消失。超級(jí)細(xì)菌耐藥性的形成其實(shí)是細(xì)菌適應(yīng)生存和不斷發(fā)展的過程，某些細(xì)菌對一些抗生素天生就不敏感，即天然耐藥性；還有一部分耐藥性是細(xì)菌在環(huán)境、藥物等選擇壓力下，通過基因突變或轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的，即獲得耐藥性。例如，NDM-1超級(jí)細(xì)菌就是通過外源轉(zhuǎn)移獲得新的DNA片段，能夠在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移傳播。超級(jí)細(xì)菌的耐藥性可在不同菌屬之間水平傳播，通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和噬菌體等，并且可攜帶一種或多種抗性基因。如劉建華等[4-6]發(fā)現(xiàn)了對多黏菌素具有耐藥性的MCR-1基因；MCR-1基因存在于質(zhì)粒，在不同菌種間擴(kuò)增和轉(zhuǎn)移速度極快，陽性樣本比例逐年增加。耐藥菌通過耐藥基因的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散、傳播、傳代、變異形成高度和多重耐藥菌。

近年來，隨著抗菌藥物的大量使用，產(chǎn)生了多重耐藥菌、泛藥菌，甚至是全耐藥菌，同時(shí)出現(xiàn)了對消毒劑的耐藥性。目前，受認(rèn)可的關(guān)于NDM-1超級(jí)細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要為：首先NDM-1第34-37位氨基酸殘基形成了一段能夠識(shí)別、結(jié)合和催化水解底物的獨(dú)特環(huán)區(qū)，這也是NDM-1具有廣譜抗生素抗性的原因，其次活性中心較大、開放、與底物結(jié)合、釋放時(shí)能夠產(chǎn)生重排現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，NDM-1和MCR-1可以同時(shí)存在于同一個(gè)細(xì)菌中的不同質(zhì)粒上，且可以一起轉(zhuǎn)移。

3 超級(jí)細(xì)菌的新藥研發(fā)

3.1 抗生素的研發(fā)

一直以來，人們對抗生素的研究都是利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對傳統(tǒng)抗生素生產(chǎn)菌進(jìn)行改造和篩選，近年來隨著基因組學(xué)、代謝組學(xué)及高通量測序的快速發(fā)展，人們將注意力集中于從天然微生物中尋找新型菌株，研發(fā)新型抗生素。有科學(xué)家從土壤中篩選出一種新型抗生素teixobactin，通過與肽聚糖前體Lipid Ⅱ和磷壁酸的前體Lipid Ⅲ結(jié)合，抑制細(xì)胞壁的合成，并且細(xì)菌很難對該抗生素產(chǎn)生耐藥性[6]。這說明新型抗生素的研究具有較好的前景。

近年新批準(zhǔn)的用于治療難辨梭狀芽胞桿菌感染的口服抗生素非達(dá)霉素(fidaxomicin dificid)[7]，這種感染能導(dǎo)致腹瀉，并可能導(dǎo)致結(jié)腸炎和其他腸道疾病。Durata公司已經(jīng)公布了抗生素達(dá)巴萬星(dalbavancin)的Ⅲ期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用于治療皮膚組織感染[8]。

目前對于抗生素的研發(fā)有兩個(gè)方向：一是利用現(xiàn)代生物技術(shù)對抗生素生產(chǎn)菌進(jìn)行改造，提高菌的活性，改進(jìn)抗生素生產(chǎn)工藝，增加抗生素產(chǎn)量；二是新型抗生素產(chǎn)生菌的篩選，篩選研究方法主要有：①稀有放線菌篩選；②極端環(huán)境微生物篩選；③使用特殊培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；④海洋微生物。對已知的抗生素應(yīng)結(jié)合納米對抗超級(jí)細(xì)菌，納米粒子可以通過抑制減少吸收，增加外排，降解產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶，改變膜孔蛋白和生物膜形成的作用機(jī)制，作為細(xì)菌耐藥性的潛在調(diào)節(jié)劑[9]。藥物再利用的提出對已知的抗生素藥物可以進(jìn)行再利用或協(xié)同結(jié)合，而且藥物再利用篩選可以很快用于臨床試驗(yàn)或治療，避免了漫長的前期臨床研究和Ⅰ期臨床試驗(yàn)[10]。如近年用于治療肺結(jié)核的藥物delamanid,表現(xiàn)出對內(nèi)臟利什曼病的抵抗性[11]；抗蠕蟲藥氯硝柳胺具有抗寨卡病毒的活性，抑制寨卡病毒Zika virus(ZIKV)的復(fù)制[12]。利用超高通量篩選技術(shù)從已批準(zhǔn)的藥物中選出了25種化合物對多重耐藥肺炎克雷伯菌具有抗菌活性，但由于在人體血漿中濃度有限，不能在臨床上作為單一藥物使用，所以采取了協(xié)同藥物組合方式[13]。藥物再利用的缺點(diǎn)是從已批準(zhǔn)的藥物中發(fā)現(xiàn)的新活性物質(zhì)大多不能單一在臨床上應(yīng)用。此外，人們經(jīng)常只重視了最小抑菌濃度，忽略了防突變濃度(MPC)，所以應(yīng)該增加 MPC 的指標(biāo),重視挑選突變選擇窗(MPC和MIC差值)小的新藥進(jìn)行重點(diǎn)研究[14]。

3.2 疫苗的研發(fā)

面對超級(jí)細(xì)菌日益嚴(yán)重的流行趨勢，超級(jí)細(xì)菌疫苗的研發(fā)可能是解決這一難題的一個(gè)方向。WHO、歐美國家政府及輝瑞、諾華、葛蘭素史克等醫(yī)藥公司已經(jīng)重視了超級(jí)細(xì)菌疫苗的研發(fā)[15]。我國首個(gè)超級(jí)細(xì)菌疫苗——重組金黃色葡萄球菌疫苗，獲得了國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的臨床研究，標(biāo)志著該研究已取得階段性重要成果[16]。囊性纖維化的銅綠假單胞菌感染的疫苗已經(jīng)開發(fā)出來，雖然在于不同的臨床階段[17]，但已沒有推薦使用。

目前所研究的超級(jí)細(xì)菌疫苗主要有鮑曼不動(dòng)桿菌滅活全菌體疫苗、外膜囊泡、重組蛋白亞單位疫苗、莢膜多糖候選疫苗和聯(lián)合疫苗，今后的重要方向是研制包含多個(gè)優(yōu)勢抗原表位的多亞單位疫苗[18]。銅綠假單胞菌的外膜蛋白I(OmpI)疫苗、重組抗原疫苗、DNA疫苗、重組沙門菌疫苗和外膜蛋白F(OmpF)蛋白疫苗、合成肽疫苗、多表位核酸疫苗等[19-20。聯(lián)合疫苗將是超級(jí)細(xì)菌疫苗今后的一個(gè)研究方向，如水貂銅綠假單胞菌肺炎克雷伯菌二聯(lián)亞單位疫苗，奇異變形桿菌-金黃葡萄球菌-銅綠假單胞菌吸附聯(lián)合疫苗。隨著對超級(jí)細(xì)菌致病機(jī)制的不斷深入探索和研究，以及逆向免疫學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，超級(jí)細(xì)菌疫苗的研發(fā)將會(huì)被大力推動(dòng)和發(fā)展。

3.3 中草藥的研發(fā)

中藥的抗耐藥機(jī)制包括：①中藥改變細(xì)胞膜的通透性，研究發(fā)現(xiàn)黃芩的主要成分黃芩苷能夠抑制和破壞細(xì)菌的生物膜系統(tǒng)，與頭孢他啶合用時(shí)能夠增強(qiáng)對生物膜內(nèi)銅綠假單胞菌的抗菌活性。②抑制β內(nèi)酰胺酶的活性，劉坤友[21]研究表明雙黃連粉針劑、清開靈注射液抑制大腸埃希菌是通過降低廣譜-β內(nèi)酰胺酶實(shí)現(xiàn)的。通過抑制超廣譜β內(nèi)酰胺酶的活性而達(dá)到抗細(xì)菌耐藥性的作用的還有丹參素、重樓皂苷、大黃蒽醌、黃芩、黃酮等8種中藥成分[22]。③抑制外排汞，藥物外排汞是細(xì)菌耐藥機(jī)制之一，吲哚生物堿是目前研究最為廣泛的一類外排汞抑制劑，其中利血平是第一個(gè)被證實(shí)外排汞抑制劑[23]。④消除耐藥質(zhì)粒，寧官保等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩、大黃、金銀花、黃連、連翹等5種中草藥單劑和三黃湯、雙黃連2種方劑對雞源性大腸埃希菌耐藥性均表現(xiàn)出不同的消除結(jié)果。

此外，中草藥作為飼料添加劑使用與抗生素相比，具有毒性低、易被環(huán)境中的微生物分解、不易殘留和造成污染、不易產(chǎn)生耐藥性，對動(dòng)物機(jī)體具有保健和增強(qiáng)免疫保護(hù)機(jī)能。研究表明，益生菌的代謝活動(dòng)中可對中草藥的部分活性成分進(jìn)行加工，促進(jìn)益生菌的增殖；而某些中草藥的前體成分經(jīng)過益生菌的處理后在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮藥效，因此中草藥制劑和微生態(tài)制劑合用，更能提高治療效果。韓亞超等[25]將3 種益生菌制劑與黃芪和麥芽聯(lián)用于斷奶仔豬的養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)在仔豬日增重、料肉比和血液生化指標(biāo)方面，中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑的效果更好，防治腹瀉的效果也最佳。大多數(shù)中草藥制劑都具有非常強(qiáng)的抗細(xì)菌、真菌和支原體的作用，在豬疫病防控中可以替代抗生素的作用，此外，對于目前獸藥市場上的中草藥制劑產(chǎn)品，應(yīng)該規(guī)定中草藥使用的標(biāo)準(zhǔn)，完善制作工藝質(zhì)量監(jiān)控，提高各環(huán)節(jié)的生產(chǎn)質(zhì)量[26]。

3.4 從動(dòng)物體內(nèi)提取抗菌藥物

在自然界中有一些動(dòng)物通過自身合成和釋放的有毒物質(zhì)，殺滅細(xì)菌、病毒和其他的微生物，以保護(hù)自己。其中在兩棲類動(dòng)物體內(nèi)含有生物胺、生物堿、蛋白質(zhì)和多肽等抗菌物質(zhì)，尤其是抗多重耐藥菌的抗菌肽，如臭蛙體內(nèi)提取odorranain-HP和從石斑蛙皮膚中提取的grahamin均對金黃色葡萄菌有抑制和殺滅作用。因此，兩棲類動(dòng)物抗菌肽的開發(fā)具有非常大的潛力，可用于替代抗生素。此外，還可用超聲提取和低溫浸提法從草魚腸道中提取抗菌活性物質(zhì)，有利于提高草魚腸道的利用價(jià)值[27]。

有研究報(bào)道，衛(wèi)生害蟲也具有防御微生物、真菌、細(xì)菌的的作用機(jī)制，這為尋找抗菌活性化合物提供了可能。即可以從昆蟲體內(nèi)尋找一種對人體健康有利的天然抗菌素，昆蟲抗菌素也稱為昆蟲抗菌肽。如僅在雙翅目黑腹果蠅的血淋巴中已發(fā)現(xiàn)7 種抗菌肽。蛆蟲治療法能成功的治療傷口感染和壞死，尤其是治療由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的創(chuàng)面?zhèn)?。因此?yīng)積極開展昆蟲抗菌活性物質(zhì)新化合物的研究，尋找具有抗菌活性的小分子化合物或昆蟲次生代謝物活性組分。如果能夠?qū)ζ渖钊胩剿骱脱芯?，這將是抗耐藥菌藥物研究的又一個(gè)方向。

3.5 微生態(tài)制劑的應(yīng)用

由于抗生素的大量使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性由單一耐藥變?yōu)槎嘀啬退?，所以很多抗生素被限制使用。而微生態(tài)制劑的研發(fā)與使用將可能代替抗生素作為飼料添加劑，促進(jìn)生長、預(yù)防和臨床治療等。微生態(tài)制劑的作用機(jī)制主要有：①提高腸道屏障功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；②維持腸道菌群平衡，促進(jìn)消化吸收能力；③提高飼料轉(zhuǎn)化率，改善養(yǎng)殖環(huán)境；④改善體內(nèi)外生態(tài)環(huán)境，減少有害物質(zhì)產(chǎn)生[28]。此外，還有不容易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格低、無殘留、無污染等特點(diǎn)。

微生態(tài)制劑分為動(dòng)物微生態(tài)制劑、植物微生態(tài)制劑、環(huán)境微生態(tài)制劑和人體微生態(tài)制劑[29]。微生態(tài)制劑目前在人體中的臨床應(yīng)用進(jìn)展包括與抗生素相關(guān)性腹瀉、腸易激綜合征、炎癥性腸病、幽門螺桿菌感染、乙型肝炎肝硬化等的治療相關(guān)。在動(dòng)物飼料應(yīng)用的國外微生態(tài)制劑產(chǎn)品有美國亞聯(lián)的 Bio-One、英國PIC 公司的Protexin、韓國的Duolac、日本的 EM 復(fù)合微生態(tài)制劑等。國內(nèi)市場主要有產(chǎn)酶益生素、芯源康、乳菌寶等。此外，我國研制的培菲康正在臨床試驗(yàn)期，“培菲康”CTA獲加拿大臨床準(zhǔn)入，是中國微生態(tài)制劑作為治療性藥物海外獲批臨床應(yīng)用的首例。由于動(dòng)物微生態(tài)制劑產(chǎn)品在市場上很多，應(yīng)選用多年來在市場應(yīng)用中具有正規(guī)認(rèn)同和良好口碑的產(chǎn)品。同時(shí)微生態(tài)制劑能夠抑制有害微生物的繁殖和凈化養(yǎng)殖廢水，是當(dāng)今漁業(yè)生物防治發(fā)展的一個(gè)方向[30]。微生態(tài)制劑的發(fā)展正從單一菌種制劑轉(zhuǎn)向復(fù)合菌種制劑，以合適的比例混合培養(yǎng)具有共生或互生關(guān)系的微生物，培養(yǎng)時(shí)注意提高活菌數(shù)，加強(qiáng)穩(wěn)定性，改進(jìn)加工工藝。同時(shí)還要挖掘新菌種，擴(kuò)大微生物制劑的來源。

3.6 利用微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)

群體感應(yīng)(quorum sensing)系統(tǒng)是在微生物界廣泛存在的細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊系統(tǒng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)極少部分的細(xì)菌產(chǎn)生的信號(hào)小分子就能夠?qū)е抡麄€(gè)菌群耐藥[31]。細(xì)菌群體可通過細(xì)胞間協(xié)調(diào)基因的表達(dá)和互相通信聯(lián)系，對周圍不斷變化的環(huán)境條件做出反應(yīng)，是細(xì)胞之間進(jìn)行信息交流和調(diào)控的機(jī)制，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞所分泌的信號(hào)分子在細(xì)菌之間達(dá)到一定濃度和閾值時(shí)，就能調(diào)控細(xì)菌的生活習(xí)性和生理功能，影響細(xì)菌與環(huán)境之間的交流與聯(lián)系。

群體感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌耐藥機(jī)制的形成中發(fā)揮了一定的作用，主要是通過調(diào)控生物被膜的形成和直接參與藥物外排泵的調(diào)控。研究表明，QS系統(tǒng)還有增強(qiáng)PA的致病性和耐藥性的作用，這一作用通過調(diào)控PA毒力因子的產(chǎn)生和生物被膜的形成以及耐藥基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[32]。細(xì)菌抗生素耐藥形成的重要原因之一是過量表達(dá)RND家族外排汞，QS系統(tǒng)影響外排汞的基因表達(dá)，而外排汞影響群體感應(yīng)的傳輸，這一現(xiàn)象為RND家族外排汞的調(diào)控機(jī)理研究提供了新的方向。研究表明sRNA 和 QS 系統(tǒng)可以相互作用，sRNA 是 QS 系統(tǒng)調(diào)控子的重要組成部分，通過調(diào)控 QS 系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)和對信息整合精確形成廣泛的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近年來發(fā)現(xiàn)群體淬滅病害防治策略為解決微生物耐藥性問題提供了新的思路[33]。群體淬滅的方式主要有：①降解或修飾信號(hào)分子；②干擾信號(hào)分子與受體蛋白的識(shí)別結(jié)合；③阻斷群體感應(yīng)信號(hào)的合成通路[34]。群體猝滅劑能夠降低微生物的感染，通過抑制微生物群體感應(yīng)，同時(shí)不會(huì)影響微生物的生長，也不會(huì)對細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力，降低了耐藥性的產(chǎn)生，因此可能作為一種高效長久的藥物使用[35]。 應(yīng)用QS系統(tǒng)可以抑制疾病的傳播。

4 結(jié)語

超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)給人類帶來了新的挑戰(zhàn)，使人們感受到了極大的威脅，其實(shí)超級(jí)細(xì)菌本身并不可怕，真正有威脅的是不斷產(chǎn)生新的超級(jí)細(xì)菌，它們會(huì)對更多新的抗生素產(chǎn)生耐藥性。抵抗超級(jí)細(xì)菌刻不容緩，需要加快步伐。目前，美國一家公司將有可能取得第一個(gè)裂解酶藥物批件，目前正在進(jìn)行采用裂解酶治療MRSA敗血癥的臨床一期試驗(yàn)[36]。在2016年9月5號(hào)的二十國集團(tuán)領(lǐng)導(dǎo)人(G20)杭州峰會(huì)上，已經(jīng)將抗生素耐藥問題與氣候變化和恐怖主義問題等同并列，引起了高度重視。據(jù)華爾街日報(bào)報(bào)道，美國聯(lián)邦政府財(cái)政激勵(lì)措施使得至少有7種“超級(jí)細(xì)菌”新藥進(jìn)入后期研發(fā)階段，這些新藥將可能用于對付危險(xiǎn)的“超級(jí)細(xì)菌”。相信隨著醫(yī)學(xué)和科技的發(fā)展，新藥的研發(fā)一定能夠取得進(jìn)一步的成功。