楊麗麗，李 姝，張麗華，蘇 燕

（包頭醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，內(nèi)蒙古包頭014040）

輸血是臨床重要的搶救和治療措施，紅細胞(red blood cells，RBCs)是輸血治療中使用最廣、用量最多的血液成分。存儲RBCs的能量和ATP消耗所導致RBCs形態(tài)及生物化學等方面的變化稱為RBCs存儲損傷。存儲損傷會影響血液保存質(zhì)量，降低RBCs運輸和釋放氧氣的能力，產(chǎn)生潛在有害物質(zhì)，給臨床輸血帶來安全隱患。了解影響RBCs存儲損傷的因素對于安全輸血具有重要意義。

1 存儲前變異

存儲前變異是從血液采集到血液儲存階段所涉及的變異，包括獻血者的個體差異和血液采集及成分制備過程的變異，是影響RBCs存儲損傷最復雜、最難測量的因素。

1.1 獻血者的個體差異

獻血者個體差異是影響RBCs質(zhì)量的主要原因[1]。首先獻血者的生活方式會影響RBCs存儲損傷：飲食、體育鍛煉、吸煙、酗酒等會影響RBCs抗氧化能力；患高脂血癥獻血者的RBCs溶血率明顯增加 、膜流動性改變、氧化應激和炎癥標志增加；高脂飲食可能不會引起血漿脂質(zhì)增高，但可能會引起RBCs功能障礙；體育鍛煉的頻率、強度也會影響RBCs存儲損傷。其次獻血者所患遺傳病也會影響RBCs存儲損傷：例如遺傳性血色病(hereditary haemochromatosis，HH)獻血者體內(nèi)鐵超載容易導致RBCs氧化損傷[2]；鐮狀RBCs病癥獻血者的RBCs溶血率和輸注后RBCs清除率增加[3]；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏的獻血者由于RBCs受氧化應激影響易發(fā)生溶血[4]。另外，獻血者的個體差異也可能會影響輸血效果。有研究認為女性獻血者的RBCs彈性好，溶血率低[5]，然而加拿大的縱向隊列研究發(fā)現(xiàn)輸注女性或年齡在30歲以下年輕獻血者的RBCs會增加死亡率[6]，但是瑞典和丹麥的回顧性研究沒有發(fā)現(xiàn)獻血者年齡對受血者30 d或1年死亡率有影響[7]；法國的回顧性隊列研究也沒有發(fā)現(xiàn)獻血者年齡、性別和存儲時間對受血者1年死亡率有影響[8]。Matthews K等[9]對存儲RBCs的變形性進行分析，結(jié)果表明RBCs初始質(zhì)量及變形能力與獻血者個體差異相關(guān)。

1.2 血液采集和成分制備的過程

不同血液采集和成分分離的過程會影響RBCs存儲損傷。血液采集后英國、加拿大和澳大利亞等國要求血液中白細胞應該在室溫保存24 h內(nèi)濾除，然而美國則要求血液中白細胞應在8 h內(nèi)濾除，否則必須冷凍。白細胞在血液內(nèi)保留時間過長會影響RBCs的生化特性[10]。加拿大的研究發(fā)現(xiàn)不同血液成分分離過程會影響RBCs特性及輸血效果[11]。Eckstein M等[12]比較了從室溫(RTH)保存24 h的全血中分離的RBCs與從快速冷卻(RC)全血中分離的RBCs，測試了它們的經(jīng)典代謝和氧化損傷標記，結(jié)果顯示，與RC-RBCs相比，RTH-RBCs第1天鉀(1.98±0.26對5.23±65.5 mmol/l)和2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG)濃度降低；RTH-RBCs第42天的溶血率高于RC-RBCs(0.52±0.13對0.37±0.12%)；RTH-RBCs的磷脂酰絲氨酸表達量為0.25±20.20%，而RC-RBCs的為0.07±0.12%；血紅蛋白修飾在兩組間沒有差異；RTH-RBCs在第29天和第42天丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度略高。因此，RC-RBCs和RTH-RBCs只有經(jīng)典體外參數(shù)的微小差異，抗氧化能力和氧化血紅蛋白修飾間無明顯差異。Patel R M等[13]用Nordion Gamma輻射器，以每袋25Gy的劑量照射RBCs，比較了6組RBCs照射和非照射后，其代謝模式的改變，結(jié)果顯示，存儲7 d內(nèi)照射組與對照組RBCs的代謝組型相似，而存儲大于10 d的RBCs則顯示出不同的代謝組型(以儲存時間和照射為函數(shù))。照射使這些差異隨血液存儲時間的延長而明顯。在生化水平，照射加速了存儲RBCs的代謝老化，細胞膜的代謝物受到顯著影響，這可能成為評價RBCs存儲損傷的有用生物標志。

2 存儲過程

作為RBCs保存的外部環(huán)境和營養(yǎng)成分的主要來源，RBCs保護液的組成成分及理化性質(zhì)的微小變化均可以影響RBCs代謝，進而引起RBCs內(nèi)和保護液中代謝產(chǎn)物的組成發(fā)生改變，進一步影響RBCs代謝和保存質(zhì)量。

2.1 保護液成分

不同保護液成分會影響存儲RBCs的質(zhì)量。

2.1.1 磷酸鹽- 腺嘌呤-葡萄糖-鳥苷-葡萄糖酸-甘露醇對存儲RBCs的影響 Lagerberg J W等[14]認為存儲在磷酸鹽- 腺嘌呤-葡萄糖-鳥苷-葡萄糖酸-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-gluconate-mannitol，PAG3M)、低滲添加液(Erythro-Sol5，E-Sol5)和添加劑溶液-7(additive solution，AS-7)中的RBCs乳酸鹽、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和總腺苷酸增加。在鹽水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇(saline-adenine-glucose-mannitol，SAGM)和磷酸鹽-腺嘌呤-葡萄糖-鳥苷-鹽水-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-saline-mannitol，PAGGSM)中儲存，RBCs內(nèi)2,3-二磷酸甘油酸(2,3-bisphosphoglycerate，2,3-BPG)水平迅速下降。在E-Sol 5和AS-7中儲存的RBCs內(nèi)2,3-BPG的下降被抑制，而在PAG3M中，2,3-BPG水平直到第35天仍然保持初始水平，到第56天仍可以檢測到。存儲在SAGM中的RBCs，其溶血率高于存儲在其他AS中的RBCs。 與SAGM相比，儲存在PAGGSM、PAG3M、E-Sol5和AS-7中的RBCs能夠更好地保持其形態(tài)特征。Radwanski K等[15]認為E-Sol5可以減緩RBCs存儲損傷，并提高整個儲存過程中RBCs的質(zhì)量。Burger P等[16]認為，在PAG3M中存儲的RBCs，35 d內(nèi)2,3-DPG和ATP水平穩(wěn)定，但是存儲的前21 d葡萄糖消耗量、乳酸產(chǎn)量、果糖-1,6-二磷酸酯和磷酸二羥丙酮水平均較高。

2.1.2 添加劑溶液7對存儲RBCs的影響 Cancelas J A等[17]發(fā)現(xiàn)，存儲在添加劑溶液7(additive solution，AS-7)中第42天和56天，RBCs溶血率和含蛋白質(zhì)微泡的脫落與存儲在AS-1中的RBCs相比顯著降低。存儲在AS-7中的RBCs自體體內(nèi)回收率在第42天(n=27)為88±5%，在第56天(n=27)為82±3%，超過了目前所使用溶液的RBCs回收率。 因此，AS-7可以改善長期儲存損傷,使體內(nèi)RBCs活力顯著增加。Veale M F等[18]認為AS-7可以改善ATP和2,3-DPG水平，保持較高pH，增加耐滲透性，減少血型糖蛋白A(glycophorin A，GPA)和微粒(microparticles,MPs)的數(shù)量。D'Alessandro A等[19]將RBCs重新懸浮于對照組AS-3或試驗組AS-7中，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜對229種代謝物進行分析和相對定量檢測，結(jié)果表明，RBCs在AS-3和AS-7中有許多類似的存儲代謝趨勢，AS-7中儲存的RBCs在儲存第1周內(nèi)代謝活性更高，AS-7可以加速磷酸戊糖途徑，使總谷胱甘肽含量增高。此外，AS-7由于無氯化物和碳酸氫鹽負荷，因此在存儲早期可以改善存儲RBCs能量和氧化還原代謝，但在第42天，差異雖然減少，但仍然比較顯著。

2.1.3 鹽水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇對存儲RBCs的影響 能量代謝和游離脂肪酸可能成為存儲RBCs結(jié)構(gòu)和功能的重要決定因素。在檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖中收集的RBCs可以在4℃的鹽水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇(saline-adenine-glucose-mannitol，SAGM)中儲存42 d。在這種受控的但仍然是人造的離體衰老過程中，RBCs積累了可逆或不可逆的損傷。Bardyn M等[20]在71 d內(nèi)每周追蹤RBCs 濃縮物、量化細胞外葡萄糖和乳酸濃度、檢測總抗氧化能力以及細胞內(nèi)還原和氧化型谷胱甘肽水平，評估微囊泡、溶血百分比和血液學參數(shù)，最后使用無標記數(shù)字全息顯微鏡記錄RBCs 形態(tài)學變化和膜波動。結(jié)果顯示，抗氧化能力以及細胞內(nèi)谷胱甘肽濃度首先升高，在1周和2周后分別達到最大值；在第5周出現(xiàn)不可逆形態(tài)學改變，細胞開始轉(zhuǎn)變?yōu)闀簳r的棘細胞和最終的球狀細胞；同時，囊泡和溶血率開始呈指數(shù)增長；6周(有效期)后，RBCs內(nèi)谷胱甘肽降低25%，說明氧化應激增加；膜波動顯示RBCs從棘狀向球狀細胞轉(zhuǎn)變時振幅降低。生物化學和細胞水平的各種病變在儲存過程中不斷積累，可能也會影響RBCs輸注后的體內(nèi)恢復。Mittag D等[21]研究發(fā)現(xiàn)與AS-1相比，存儲在SAGM中的RBCs對氧化和體外輸血相關(guān)應激的敏感性更高。

2.1.4 其他保護液對存儲RBCs的影響 Lagerberg J W等[14]認為在磷酸鹽-腺嘌呤-葡萄糖-鳥苷-鹽水-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-saline-mannitol ，PAGGSM)中儲存，RBCs內(nèi)2,3-二磷酸甘油酸(2,3-bisphosphoglycerate，2,3-BPG)水平迅速下降。在E-Sol 5中儲存的RBCs內(nèi)2,3-BPG的下降被抑制。 Radwanski K等[15]認為E-Sol5可以減緩RBCs存儲損傷，并提高整個儲存過程中RBCs的質(zhì)量。

2.2 存儲條件

保存液的pH會影響存儲RBCs的質(zhì)量。Chang A L等[22]研究了保存液pH對RBCs存儲損傷和輸注后RBCs存活的影響。將小鼠濃縮RBCs(packed RBCs，pRBCs)分別儲存在標準條件(pH 5.8)、酸性(pH4.5)或堿性(pH8.5)AS-3中，儲存期結(jié)束時測定血紅蛋白、微囊泡產(chǎn)生、磷脂酰絲氨酸外翻、乳酸蓄積和脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物。將羧基熒光素標記的RBCs 輸入健康小鼠以確定細胞存活，與標準AS-3中存儲的pRBCs相比，儲存在堿性溶液中的RBCs溶血率、磷脂酰絲氨酸外翻、微囊泡生成和脂質(zhì)過氧化均降低；而乳酸水平較高，說明pRBCs仍然具有較高的代謝活性。與標準AS-3儲存相比，堿性儲存增加RBCs 循環(huán)半衰期，而酸性儲存則降低RBCs 循環(huán)半衰期。

2.3 存儲時間

存儲RBCs大多數(shù)生物變量，例如細胞變形性、溶血、pH、乳酸鹽、丙二醛和8-異前列烷素等炎癥脂質(zhì)，在存儲期間隨時間延長而改變，所以儲存時間成為評價RBCs存儲損傷的主要參數(shù)。然而，對RBCs存儲損傷的評價不應僅局限于RBCs本身的損傷，更應該關(guān)注臨床輸注效果。但是由于方法上的限制，有關(guān)存儲RBCs損傷的臨床意義仍然有爭議。

2.3.1 存儲時間不影響輸血效果 來自新生兒和接受心臟手術(shù)患者的隨機對照試驗表明[23]，RBCs儲存時間與患者的不良臨床后果無關(guān)，但是由于方法上的限制，有關(guān)存儲RBCs損傷的臨床意義仍然有爭議。Halmin M等[24]通過觀察性研究發(fā)現(xiàn)RBCs的存儲時間與患者死亡率之間沒有關(guān)聯(lián)。Desmarets M等[25]通過回顧性隊列研究發(fā)現(xiàn)RBCs的存儲時間對受血者1年生存率沒有影響。

2.3.2 存儲時間影響輸血效果 與上述研究結(jié)果不同，Chadebech P等[26]抽取存儲3 d～8 d(稱為新鮮RBCs)和38 h～42 h(舊RBCs)的11個存儲RBCs樣本，并分別與嚴重膿毒癥患者和健康志愿者的血漿共同培養(yǎng)，37℃保存24 h或48 h，檢測衰老標記(磷脂酰絲氨酸暴露、鈣流入、活性氧以及RBCs體積)。結(jié)果證實，影響嚴重膿毒癥患者輸血效果的主要原因是RBCs存儲時間，而不是受血者的臨床狀態(tài)。Almizraq R J等[27]利用流式細胞儀(flow cytometer，F(xiàn)C)和動態(tài)光散射(dynamic light scatting，DLS)分別檢測存儲第3天、7天、21天、42天少白RBCs濃縮物(leukoreduced red cell concentrates，RCCs)中細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的含量和大小。TRPS檢測結(jié)果表明，<200 nm的EVs濃度在整個儲存期間顯著增加。FC或DLS受到分辨粒度能力<200 nm限制，不能用于EVs濃度檢測。 TRPS和FC檢測結(jié)果顯示，與存儲第3天EVs相比，存儲第42天/43天，≥200 nm的EVs濃度顯著增加。利用DLS測量懸浮液中顆粒的平均尺寸時，觀察到儲存期間EVs平均尺寸增加，說明存儲時間會影響 EV的大小和濃度。

3 展望

近年來對存儲損傷的不斷研究使人們越來越多地認識到存儲損傷不僅僅是“存儲”引起，存儲前的變異也會引起損傷，而且有理由認為存儲前變異是影響存儲損傷最重要也是最難測量的因素。雖然這方面已經(jīng)有大量的研究結(jié)果，但由于方法和地域的局限性，試驗結(jié)果仍無法達到共識。此外，由于臨床用血的需求量大，設立更多的獻血者篩選條件是不現(xiàn)實的，因此，今后將從改進成分分離工藝和保存液成分著手,將RBCs存儲損傷的危害降至最低，保障輸血安全。