單安山，田昊天，邵長軒，譚 鵬，來振衡

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030）

2010年南亞發(fā)生“超級細(xì)菌”事件，2016年美國出現(xiàn)首例“超級細(xì)菌”感染者，標(biāo)志細(xì)菌耐藥性危機在世界范圍內(nèi)爆發(fā)。從公眾到國家政策，“禁抗”呼聲越來越高，一個一般性生產(chǎn)技術(shù)問題已經(jīng)演變成公共安全問題?？股蒯槍?xì)菌特定靶點或代謝通路發(fā)揮抗菌作用，細(xì)菌易發(fā)生突變獲得耐藥性，威脅人類健康。因此，尋找新抗菌策略成為亟待解決問題[1]。抗菌肽（Antimicrobial pep?tides,AMPs）抗菌機理與抗生素不同，不易產(chǎn)生耐藥性。AMPs由生物體內(nèi)特定基因轉(zhuǎn)錄翻譯生成，是宿主抵抗病原微生物入侵，清除體內(nèi)變異細(xì)胞或致癌物質(zhì)一類小分子蛋白。在眾多抗生素替代劑中，AMPs分布廣泛、有廣譜抗菌活性、抗病毒和免疫增強等作用，備受關(guān)注[2-3]。AMPs通過物理性破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌內(nèi)容物外滲而死亡，細(xì)菌突變某一特定結(jié)合靶點較容易，而難以改變其全部細(xì)胞膜組成與結(jié)構(gòu)，細(xì)菌不易對非特異性識別菌膜的破膜機制產(chǎn)生耐藥性，此即AMPs有望解決耐藥菌問題并替代抗生素成為新型抗菌劑重要原因[4]。AMPs種類繁多，針對不同種類細(xì)菌抑菌機理不同，人工模擬脂質(zhì)環(huán)境與菌膜環(huán)境存在差異，研究方法不同，結(jié)論亦不同。目前尚無涵蓋所有AMPs作用機理的理論成果，加深對AMPs抑菌機理研究有助于天然AMPs改造及AMPs全新設(shè)計，對于預(yù)防AMPs產(chǎn)生耐藥性也有重要意義。文章重點闡述AMPs與細(xì)菌膜、細(xì)菌生物被膜、胞內(nèi)物質(zhì)作用產(chǎn)生抗菌效果作用機理。

1 AMPs與細(xì)菌膜作用

AMPs在宿主體內(nèi)發(fā)揮作用的主要原因是細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)與宿主體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)存在差異。細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)中帶有陰離子脂質(zhì)部分暴露于表面，在宿主體細(xì)胞中，陰離子脂質(zhì)部分被分解為單層，朝向細(xì)胞內(nèi)側(cè)[5]。因此，具有陽離子性特征的AMPs對細(xì)菌膜具有高細(xì)胞選擇性[6]。Teixeira等報道與細(xì)菌膜相互作用的AMPs結(jié)構(gòu)特性[7]。目前，開發(fā)有效作用于細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的AMPs是未來研究方向，對此，Shao等將β轉(zhuǎn)角單元插入α-螺旋結(jié)構(gòu)AMPs中，成功提高了AMPs細(xì)胞選擇性[8]。

1.1 革蘭氏陽性菌與陰性菌不同細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)

有些種類AMPs可直接靶向作用于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜質(zhì)膜組分，其中很多環(huán)形或鎖套形結(jié)構(gòu)AMPs，具有可結(jié)合脂質(zhì)組分剛性結(jié)合位點。這種特異性結(jié)合使AMPs可靶向作用于細(xì)胞膜，而對宿主體細(xì)胞無毒性。革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜與革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的分子組成和分層形態(tài)均有差異。

如圖1所示，兩種類型細(xì)菌細(xì)胞壁均由肽聚糖組成[9]。除細(xì)胞壁外，革蘭氏陰性菌被位于細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)和外側(cè)細(xì)胞質(zhì)膜及外膜兩層膜包圍。膜外層含作為主要脂質(zhì)成分的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），也是革蘭氏陰性菌特有脂質(zhì)物質(zhì)，越來越多抗菌劑被發(fā)現(xiàn)可抑制該脂質(zhì)合成，動態(tài)光散射試驗證明AMPs可解離LPS膠束[10]。

圖1 革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌菌膜Fig.1 Schematic diagram comparing Gram-positive and Gram-negativebacterial cell membranes

AMPs可結(jié)合革蘭氏陰性菌外膜，阻止周質(zhì)和細(xì)胞外部溶質(zhì)通過，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。革蘭氏陽性菌僅有一層細(xì)胞質(zhì)膜，但其細(xì)胞壁較厚并含磷壁酸，主要細(xì)菌脂質(zhì)組分磷脂酰甘油可通過細(xì)菌酶化學(xué)修飾，將脂質(zhì)從陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)殛栯x子或兩性離子形式，該過程中細(xì)菌對陽離子抗菌藥物抗性增加，而AMPs酶抑制作用可抵抗由此產(chǎn)生的耐藥性。細(xì)菌單層膜結(jié)構(gòu)主要脂質(zhì)成分包括磷脂酰甘油（Phos?phatidylglycerol，PG），磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl?ethanolamine，PE）和心磷脂（Cardiolipin，CL）[11]。不同種類細(xì)菌3種脂質(zhì)成分含量和比例不同。除其他少量脂質(zhì)成分，有些種類細(xì)菌還有大量糖基甘油二酯（Glycosyl diglycerides）。

AMPs作用機制與細(xì)菌菌膜結(jié)構(gòu)關(guān)系緊密，天然AMPs大多數(shù)有一定比例正電荷氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基，幾乎全部生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)均由磷脂類物質(zhì)和膜蛋白組成，但細(xì)菌菌膜與宿主細(xì)胞膜組分存在差別，菌膜特殊結(jié)構(gòu)為AMPs作用提供靶向目標(biāo)。

1.2 AMPs與膜吸附結(jié)合與破壞外膜滲透性

AMPs在水溶液中不顯示α-螺旋或β-折疊等典型結(jié)構(gòu)，而在模擬菌膜陰性SDS溶液中則可螺旋、折疊成兩親性構(gòu)象[12]，AMPs與菌膜由于靜電吸引作用而結(jié)合[13]，這種吸引作用因革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌菌膜結(jié)構(gòu)不同而存在差異，可解釋不同細(xì)菌對AMPs敏感性不同[14]。這種菌膜與AMPs吸附結(jié)合作用，AMPs需借助菌膜多聚糖莢膜和其他結(jié)構(gòu)組分，與革蘭氏陰性菌外膜及革蘭氏陽性菌質(zhì)膜作用[15]，對于革蘭氏陰性菌，外膜比細(xì)胞膜更易滲透，因孔蛋白存在可滲透500Da分子[16]。AMPs首先競爭性替換與LPS相關(guān)Mg2+和Ca2+，打破菌膜結(jié)構(gòu)骨架超分子組裝體原有穩(wěn)定性，內(nèi)外膜打通。AMPs對細(xì)菌殺滅作用可能因革蘭氏陰性細(xì)菌外膜滲透性反向變化引起，一般來說，所有細(xì)菌菌膜均維持一定程度滲透性，使細(xì)菌內(nèi)部與細(xì)菌外介質(zhì)之間交換離子和小分子，Epand等研究表明某些AMPs可通過阻斷外膜滲透性從而殺滅細(xì)菌[17-18]。對于革蘭氏陽性菌，其外膜結(jié)構(gòu)不含LPS，而是含有帶負(fù)電性磷壁酸與較厚肽聚糖層與AMPs作用。

1.3 閾濃度與構(gòu)象遷移

AMPs與菌膜結(jié)合后在局部不斷聚集，AMPs在細(xì)胞膜表面必須達閾濃度才能發(fā)揮殺菌作用[19]。閾濃度是指AMPs在靶目標(biāo)表面發(fā)揮其生物學(xué)活性所需最低濃度，閾濃度根據(jù)不同細(xì)菌不同AMPs氨基酸組成、序列及空間構(gòu)型等因素影響而變化。當(dāng)小于閾濃度時，AMPs在脂質(zhì)頭基聚集并發(fā)揮作用，同時AMPs折疊吸附于脂質(zhì)雙分子層表面，與之成平行狀態(tài)。當(dāng)AMPs濃度增高，AMPs逐漸垂直插入、分配入雙分子層疏水核心，其分配過程受AMPs濃度、菌膜組成、菌膜流動性、多聚體或自我裝配偏好性、頭基尺寸與化學(xué)性質(zhì)、跨膜電位與pH等因素影響[20]。當(dāng)高于閾濃度時，AMPs無論是深入膜定位還是連接狀態(tài)下，均可促進構(gòu)象變化，同樣在雙層拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上也能發(fā)生間接變化，如形成孔洞或衰變。當(dāng)AMPs在膜表面達到破膜閾濃度時，即為最小抑菌濃度（Minimal inhibitory con?centration,MIC）。

AMPs與菌膜結(jié)合后，最重要過程之一是脂水界面間AMPs構(gòu)象重排，目前α-螺旋結(jié)構(gòu)AMPs這一過程最為清晰。根據(jù)基礎(chǔ)熱力學(xué)原理，可將AMPs與菌膜相互作用分為分配、折疊、遷移和耦合4個步驟。靜電吸引和平面定位后，AMPs在菌膜上作一步關(guān)鍵分配和構(gòu)象遷移，由此分配-折疊耦合過程形成二級結(jié)構(gòu)可使AMPs分配的吉布斯自由能較低，肽鍵形成也會降低其分配吉布斯自由能，有助于AMPs在菌膜分配與遷移。α-螺旋結(jié)構(gòu)形成受焓和ΔGhelix驅(qū)動，而熵和ΔShelix抑制α-螺旋結(jié)構(gòu)形成。受分子內(nèi)CO-NH中氫鍵形成影響，螺旋形成焓值與AMPs氨基酸序列無緊密關(guān)系。AMPs插入膜內(nèi)疏水核心區(qū)域，有助于吉布斯自由能總體降低，α-螺旋和β-折疊AMPs分子內(nèi)氫鍵能對肽鍵形成保護。還有其他重要因素需考慮，包括AMPs側(cè)鏈填充、側(cè)鏈對膜相對暴露、AMPs在膜上滲透程度等。相比之下，β-折疊AMPs通常在膜環(huán)境和水溶液中更加有序，原因在于二硫鍵束縛作用和β-折疊中存在固有剛性結(jié)構(gòu)，而α-螺旋AMPs無此結(jié)構(gòu)[21]。Catalina在兩項研究中，第一次運用原子力學(xué)詳細(xì)信息計算，確定地衣菌素與肽聚糖層脂質(zhì)Ⅱ結(jié)構(gòu)亞單位無偏相互作用途徑及Cat?helicidins與膜表面相互作用途徑[22]。

1.4 與磷脂作用造成膜物理損傷

AMPs可通過多種方式與菌膜磷脂作用，改變膜物理性質(zhì)[23]。如圖2所示，AMPs對磷脂作用方式主要有4種：①誘導(dǎo)膜物理曲率、固有曲率或流動性改變[24]；②造成脂質(zhì)聚集，菌膜脂質(zhì)組分在膜結(jié)構(gòu)中并非均勻分布，而在某些區(qū)域富集[25]。AMPs可改變脂質(zhì)富集域分布，如多個帶正電荷陽離子肽聚合陰離子脂質(zhì)[26-28]；③形成孔洞，破壞脂質(zhì)與細(xì)胞膜其他分子組分相互作用及結(jié)構(gòu)域，在聚集脂質(zhì)和膜主體結(jié)構(gòu)間形成界面斷層，局部甚至全面破壞滲透屏障；④直接靶向影響細(xì)菌特定脂類。不同種類細(xì)菌膜脂質(zhì)組分差別較大，細(xì)菌菌膜中CL、PG和PE與真核細(xì)胞中相應(yīng)脂質(zhì)有相同頭基結(jié)構(gòu)，但在細(xì)菌中，?；湼蹋呌陲柡?。此外，細(xì)菌菌膜陰離子脂質(zhì)和PE暴露在細(xì)菌膜外表面上，在真核細(xì)胞膜中，被大量隔離于胞質(zhì)表面。這些特征有助于設(shè)計針對細(xì)菌特定脂質(zhì)AMPs，針對特定脂質(zhì)AMPs可通過改變膜特性發(fā)揮作用。

圖2 AMPs對細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)成分作用方式Fig.2 Graphical representation of the different outcomes peptide antimicrobials can haveon propertiesof thebacterial cell membrane

AMPs對于菌膜脂質(zhì)成分可能多種作用方式同時發(fā)生，且作用方式之間存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。例如，菌膜物理曲率改變可引起脂質(zhì)聚集，形成膜孔洞，膜電位損失最終阻滯細(xì)胞新陳代謝，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[29]。

1.5 AMPs破膜理論模型

不同來源AMPs對不同細(xì)菌破膜理論可能不同，AMPs由于靜電吸引在細(xì)菌表面不斷聚集[30-31]，當(dāng)菌膜上AMPs濃度達閾濃度時發(fā)生重排，由平行變?yōu)榇怪庇诰顟B(tài)，AMPs由于菌膜誘導(dǎo)形成兩親性結(jié)構(gòu)，隨即插入菌膜結(jié)構(gòu)中疏水核心區(qū)域，AMPs進入脂質(zhì)雙分子層數(shù)量和程度逐漸增加，破壞菌膜完整性，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物滲出，最終死亡[32]。AMPs插入脂質(zhì)雙分子層，可與菌膜作用結(jié)合形成孔洞，孔洞為具導(dǎo)電性通道，可破壞菌膜內(nèi)外跨膜電位和離子梯度濃度，導(dǎo)致菌體內(nèi)容物滲出并死亡。

由于不同AMPs理化參數(shù)不同，機理也不同，目前有如下假說解釋其破膜機理（如圖3）。

①聚集通道模型：AMPs競爭性取代菌膜結(jié)構(gòu)上LPS結(jié)合Mg2+和Ca2+，細(xì)胞表面超分子組成穩(wěn)定性被破壞，AMPs可到達細(xì)菌外膜和內(nèi)膜作用靶點，此模型中AMPs與菌膜形成極特殊脂-肽域，陰性磷脂表面兩性離子被橫向隔離，出現(xiàn)非片層脂相，干擾細(xì)胞膜，形成聚集通道。

圖3 AMPs抑菌機理模型[38]Fig.3 Modelsof antimicrobial mechanism of antimicrobial peptides.

上述幾種AMPs破膜理論模型假說并非完全不同，可能相互聯(lián)系，菌膜孔洞形成可能是菌膜結(jié)構(gòu)崩塌瓦解早期階段，不同破膜理論模型因是AMPs作用程度不同而劃分的幾個連續(xù)階段。

2 AMPs對細(xì)菌生物被膜抑制作用

細(xì)菌生物被膜（Bacterial Biofilm,BF）概念在1978年由Costerton等最早提出。通常情況下，單細(xì)菌以浮游菌形式存在，而在某些條件下，多細(xì)菌能以BF形式存在，BF指微生物群落附著于各種載體，形成多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抵抗惡劣外界環(huán)境，細(xì)菌產(chǎn)生基質(zhì)層可使更多細(xì)菌定植于其中，BF可附著于有機、無機物體表面，在臨床治療細(xì)菌感染上，由于BF產(chǎn)生抗生素耐藥性對人類具有巨大威脅。AMPs對BF有破壞和抑制作用，與此同時，BF也是細(xì)菌抵抗AMPs發(fā)揮作用主要因素之一[39]，近年眾多研究針對AMPs對BF抑制作用，如AMPs與大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa）、變形鏈球菌（Streptococcus mutans,S.mutans）、牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis）等菌種BF作用，對AMPs實際應(yīng)用與預(yù)防AMPs耐藥菌有重要意義，AMPs也有望成為治療BF感染理想藥物。

2.1 BF成因與組成

浮游細(xì)菌若附著在物體表面易形成BF，被細(xì)菌分泌的胞外黏質(zhì)物（Extracellular slime substance,ESS）包裹。BF是一種高度組織化的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中包含蛋白質(zhì)、核酸、多糖、肽聚糖、磷脂、水通道等[40]。BF基質(zhì)是胞外聚合物（Extracellular poly?meric substance,EPS），附著型微生物表面EPS由其自身分泌，可使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)、空氣、水等通過，EPS包括胞外蛋白、胞外多糖和eDNA，EPS能增強微生物抗性，也與BF穩(wěn)定性密切相關(guān)。其中胞外蛋白是EPS主要組分，使BF穩(wěn)固形成。胞外多糖是一種巨大網(wǎng)型高分子聚合物骨架，可讓蛋白質(zhì)、脂類、核酸及碳水化合物等附著在其表面[41]。溶解細(xì)胞分泌eDNA與BF附著作用緊密相關(guān)[42]。

2.2 BF形成影響因素

探究BF形成因素及影響結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性因素有助于設(shè)計對BF有抑制作用的AMPs。細(xì)菌與載體由于靜電吸引而發(fā)生黏附，多數(shù)產(chǎn)生與形成BF細(xì)菌帶有負(fù)電荷[43]，因此，帶有正電荷載體更易形成BF。細(xì)菌也可在帶有正電荷載體表面聚集，細(xì)菌通過胞外細(xì)胞器克服靜電排斥，如利用鞭毛等粘附于載體表面?，F(xiàn)實中，細(xì)菌附著載體普遍處于離子濃度較高的溶液環(huán)境中，這些離子和小分子物質(zhì)會吸附于載體表面，通過改變載體表面特性，影響細(xì)菌對載體表面靜電吸附作用。若溶液中離子和小分子物質(zhì)能夠通過擴散及質(zhì)量傳遞吸附使得載體帶正電荷，細(xì)菌和載體作用增強，若使載體帶負(fù)電荷，則吸附作用減弱。

載體表面疏水性也影響B(tài)F形成，但目前研究對此存在爭議，一般疏水性界面不利于細(xì)菌黏附，BF形成與成熟速度也較慢。也有與此相悖研究結(jié)果，Heistad等研究表明，BF形成及其發(fā)展成熟與載體界面疏水性無顯著關(guān)系[44]。不同研究結(jié)果與載體材料、菌種種類特性相關(guān)，應(yīng)在特定條件下判定親疏水性載體界面對BF形成及其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響。

載體界面形態(tài)結(jié)構(gòu)即粗糙度對BF形成影響較大，在納米與微米級條件下，增加載體界面與細(xì)菌接觸面積可增強粘附作用，在液體流動相中，粗糙相對接觸面使BF中細(xì)菌更加牢固，不易脫落。有些表面形態(tài)載體更不利于BF形成，如仿鯊魚皮納米級材料，細(xì)菌富集量甚至少于光滑界面載體，Hochbaum等研究也顯示，載體界面一定程度空間阻隔會抑制細(xì)菌粘附與BF形成，這種形態(tài)的載體界面對BF抑制作用極具研究價值[45]。

2.3 AMPs對BF抑制機理

無耐藥性菌種遇不利環(huán)境若形成BF，BF深處細(xì)菌難以殺滅，產(chǎn)生耐藥性，說明多細(xì)胞結(jié)構(gòu)是BF耐藥性產(chǎn)生基礎(chǔ)。采用耗散粒子動力學(xué)研究方法（DPD），發(fā)現(xiàn)包含帶有正電荷并具兩親性的AMPs靜電相互作用吸附到帶有負(fù)電荷細(xì)菌細(xì)胞膜表面，結(jié)果顯示AMPs通過疏水作用插入細(xì)胞膜形成孔洞，轉(zhuǎn)移到BF內(nèi)壁。AMPs對細(xì)菌細(xì)胞膜破壞可能導(dǎo)致BF屏障作用受損從而增加BF通透性。AMPs破壞BF結(jié)構(gòu)，細(xì)菌從BF結(jié)構(gòu)中脫落，成為浮游菌，對AMPs敏感性明顯恢復(fù)。

當(dāng)液體介質(zhì)中AMPs濃度大于或等于最小抑菌濃度時，AMPs可殺死液體中懸浮細(xì)菌抑制BF形成，也可殺死液體流動相中由BF脫落的分離細(xì)菌。AMPs對BF形成影響可用結(jié)晶紫定量法與激光共聚焦染色法檢測。當(dāng)AMPs濃度低于最小抑菌濃度時，AMPs可通過與載體界面結(jié)合，或者與細(xì)菌表面、EPS組分結(jié)合抑制BF形成[46]。AMPs可通過干擾基因表達，如參與干擾修飾、基質(zhì)合成等基因表達，使控制BF生存類型基因調(diào)節(jié)異常，也能針對產(chǎn)生嚴(yán)禁反應(yīng)ppGpp信號分子等方式抑制BF形成[47]。

本實驗室觀察不同AMPs對大腸桿菌（Esche?richia coli,E.coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）等在載體表面粘附性影響，由此探究AMPs能否抑制BF形成。隨后分別利用結(jié)晶紫定量和激光共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope,CLSM）測定AMPs對BF的作用。結(jié)晶紫能夠與BF中胞外多糖及細(xì)胞壁物質(zhì)結(jié)合，由結(jié)晶紫含量測定BF含量。用掃描電子顯微鏡觀測BF細(xì)胞形態(tài)變化，研究表明，經(jīng)優(yōu)化AMPs序列抗BF活性較強[48]。

3 AMPs對細(xì)菌胞內(nèi)殺傷作用機制

目前，大部分天然和改造AMPs或AMPs衍生物對細(xì)菌作用靶點在細(xì)胞膜，AMPs抑菌機理研究主要關(guān)注AMPs對細(xì)菌細(xì)胞膜作用，盡管形成膜孔洞可致細(xì)菌死亡，但越來越多研究表明AMPs抑菌機理不僅局限于此。AMPs具有多種作用模式，隨研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)AMPs對菌膜作用只是第一步，近年有許多研究將AMPs作用靶位點指向胞內(nèi)[49]，包括抑制重要細(xì)胞功能，如作用于特異性酶或者抑制DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯[50]。有些AMPs影響胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用及酶促級聯(lián)和胞質(zhì)溶膠信號傳導(dǎo)途徑，或轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞并損害細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器[51]。AMP-jsa9有多重作用模式，既能靶向作用于蠟狀芽孢桿菌細(xì)胞壁和膜，破壞膜完整性，增加膜透性并增強細(xì)胞質(zhì)泄漏，此外，AMP-jsa9還可結(jié)合DNA并分解蠟狀芽孢桿菌生物膜[52]。

將來自牛的中性白細(xì)胞Bac7與大腸桿菌作用1～2 h，在活菌數(shù)減少2～5個數(shù)量級條件下，對大腸桿菌菌膜并無破壞作用。隨研究不斷深入，有些AMPs可通過膜轉(zhuǎn)運穿透細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)部與生物大分子結(jié)合并發(fā)揮抗菌作用[53]，如與核酸和蛋白質(zhì)作用，從而調(diào)控細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達[54]，或抑制某些蛋白酶活性及某些功能發(fā)揮殺死細(xì)菌[55]。也有一些富含脯氨酸AMPs通過與細(xì)胞質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致細(xì)菌死亡，人類β-防御素3可通過激活特定抗原提呈細(xì)胞（單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞），刺激適應(yīng)性免疫表達，人嗜中性粒細(xì)胞肽1（Human neutrophil peptide-1,HNP1）及人 β-防御素 3（Hu?man beta-defensin 3,HBD3）均有與細(xì)菌細(xì)胞壁前體結(jié)合能力[56]。

3.1 AMPs對細(xì)菌核酸大分子作用

AMPs與胞內(nèi)核酸大分子（DNA和RNA）靶點結(jié)合，是AMPs胞內(nèi)作用最重要模式之一，可破壞細(xì)菌遺傳系統(tǒng)，影響其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程。不同AMPs對核酸大分子具體作用也不相同。

來源于牛的嗜中性粒細(xì)胞Indolicidin可與細(xì)菌DNA作用，有效阻斷胸腺嘧啶結(jié)合，抑制DNA復(fù)制與合成，使大腸桿菌絲狀化?；贗ndolicidin改造得衍生肽IN3、IN4有更強DNA結(jié)合能力，同時抗菌活性更高[57]。

來源于新疆家蠶Cecropin-XJ可與金黃色葡萄球菌染色體DNA作用，使DNA紫外吸收值顯著升高，且熒光強度顯著增強，能夠與溴化乙錠競爭性結(jié)合DNA，抑制金黃色葡萄球菌DNA復(fù)制。由此推測，Cecropin-XJ通過靜電引力與DNA磷酸基團結(jié)合，由于結(jié)合體空間發(fā)生改變，與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)小凹槽結(jié)合，可全嵌入或半嵌入DNA中，產(chǎn)生增色效應(yīng)[58]。本實驗室應(yīng)用凝膠阻滯試驗檢測AMPs能否與DNA結(jié)合，進而影響DNA在瓊脂糖凝膠電泳中遷移率[59]?？膳c核酸作用AMPs種類較多，詳見表1[60]。

表1 AMPs對細(xì)菌核酸作用Table 1 Action of AMPs against thenucleic acids of bacterium

3.2 AMPs對細(xì)菌胞內(nèi)功能蛋白和酶作用

AMPs對胞內(nèi)功能蛋白或酶作用可分為直接作用和間接作用兩類。一類是AMPs與胞內(nèi)核酸作用，影響功能蛋白或酶合成與修飾，最終影響其功能。例如來源于大腸桿菌編碼細(xì)菌素MccJ25、Mukhopadhyay等被發(fā)現(xiàn)能夠與RNA聚合酶結(jié)合，阻斷RNA聚合酶中一條通道，此通道具有用來合成RNA所需堿基、排出合成代謝副產(chǎn)物雙向運輸作用，由于底物與酶活性中心無法結(jié)合，最終抑制RNA聚合酶活性。MccJ25還可抑制琥珀酸脫氫酶與NADH脫氫酶活性，這兩種酶在呼吸鏈中發(fā)揮重要作用，改變氧消耗速率。

apidaecin、drosocin和pyrrhocoricin等一類富含脯氨酸AMPs與細(xì)菌胞內(nèi)熱休克蛋白Dnak靶向結(jié)合，并抑制其ATPase活性，分子伴侶協(xié)助功能蛋白質(zhì)不能折疊，細(xì)菌最終死亡。

histatin5能穿透細(xì)胞質(zhì)膜，在線粒體內(nèi)聚集，破壞F1F0-ATPase活性，使線粒體內(nèi)ATP合成減少[61]。另外發(fā)現(xiàn)apidaecin在抑制細(xì)胞分裂蛋白酶FTSH的同時增強UDP-3-O-酰基-N-乙酰氨基脫乙?；富钚裕蚱屏?脂比例平衡，造成細(xì)菌代謝狀態(tài)紊亂[62]。AMPs可與酶或功能性蛋白直接作用，此類AMPs種類較多，代表性AMPs見表2[63]。

表2 AMPs對細(xì)菌酶作用Table 2 Action of AMPs against theenzymes of bacterium

4 小結(jié)與展望

綜上所述，AMPs與抗生素相比有不同抗菌機理，細(xì)菌難以對AMPs產(chǎn)生耐藥性。不同來源AMPs對于不同種類、不同狀態(tài)菌種抑菌機理不同。有些AMPs可在菌膜模擬環(huán)境螺旋、折疊成兩親性構(gòu)象，靜電吸引使AMPs聚集于菌膜，在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌菌膜結(jié)構(gòu)中分別特有脂多糖和磷壁酸為AMPs作用提供靶向目標(biāo)，而后AMPs可與磷脂作用造成膜物理損傷。有些種類AMPs可穿過菌膜，與胞內(nèi)核酸、酶等生物大分子結(jié)合從而發(fā)揮抗菌作用。AMPs殺滅細(xì)菌也可通過胞內(nèi)與胞外協(xié)同模式發(fā)揮作用。某些AMPs可破壞或抑制細(xì)菌生物被膜形成，對解決耐藥性危機具有重要意義。

進一步探究AMPs抗菌機理有助于更深入理解不同類型AMPs發(fā)揮作用的微觀過程，有助于解釋組成AMPs蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，有助于改造與設(shè)計殺菌效果好、細(xì)胞選擇性高、難以產(chǎn)生耐藥性應(yīng)用型AMPs。AMPs作為新一代抗菌藥物、飼料添加劑與食品添加劑應(yīng)用前景廣闊，有望與抗生素協(xié)同使用或全面替代抗生素，在醫(yī)藥衛(wèi)生、畜牧、食品等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

[參考文獻]

[1] Reardon S.USvows to combat antibiotic resistance[J].Nature,2014,513(7519):471.

[2] 單安山,馬得瑩,馮興軍,等.新型抗生素替代品-重組抗菌劑類蛋白的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(8):117-122.

[3] Da C J P,Cova M,Ferreira R,et al.Antimicrobial peptides:An alternative for innovative medicines?[J].Applied microbiology and biotechnology,2015,99(5):2023-2040.

[4] Deslouches B,Steckbeck JD,Craigo JK,et al.Engineered cationic antimicrobial peptides to overcome multidrug resistance by ES?KAPEpathogens[J].Antimicrobial agents and chemotherapy,2015,59(2):1329-1333.

[5] Alves D,Olívia PM.Mini-review:Antimicrobial peptides and en?zymes as promising candidates to functionalize biomaterial surfac?es[J].Biofouling,2014,30(4):483-499.

[6] Golbek T W,Franz J,Elliott F J,et al.Identifying the selectivity of antimicrobial peptides to cell membranes by sum frequency generation spectroscopy[J].Biointerphases,2017,12(2):406-419.

[7] Teixeira V,Feio M J,Bastos M.Role of lipids in the interaction of antimicrobial peptides with membranes[J].Progress in lipid research,2012,51(2):149-177.

[8] Shao C,Tian H,Wang T,et al.Centralβ-turn increases the cell selectivity of imperfectly amphipathicα-helical peptides[J].Acta Biomaterialia,2018,69:243-255.

[9]Epand R M,Walker C,Epand R F,et al.Molecular mechanisms of membrane targeting antibiotics[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes,2016,1858(5):980-987.

[10] Shen M,Dong W,Qian J,et al.Antimicrobial activity and mem?brane interaction mechanism of the antimicrobial peptides derived from Rana chensinensis with short sequences[J].Biologia,2017,72(9):1-13.

[11] Epand R M,Epand R F.Bacterial membrane lipids in the action of antimicrobial agents[J].Journal of Peptide Science,2011,17(5):298-305.

[12] Zhu X,Dong N,Wang Z,et al.Design of imperfectly amphipathic α-helical antimicrobial peptides with enhanced cell selectivity[J].Acta Biomaterialia,2014,10:244-257.

[13] Travkova OG,Brezesinski G.Adsorption of theantimicrobial pep?tide arenicin and its linear derivative to model membranes-A maximum insertion pressure study[J].Chemistry and Physics of Lipids,2013,167(1):43-50.

[14] Yount N Y,Yeaman M R.Peptide antimicrobials:Cell wall as a bacterial target[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2013,1277(1):127-138.

[15] 單安山,呂希婷,馬清泉,等.豬凝血酶C端衍生肽抑菌活性和膜作用機制研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(4):1-9.

[16] Lam N H,Ma Z,Ha B Y.Electrostatic modification of the lipo?polysaccharide layer:Competing effects of divalent cations and polycationic or polyanionic molecules[J].Soft Matter,2014,10(38):7528-7544.

[17]Epand RF,Mowery BP,Lee SE,et al.Dual mechanismof bacte?rial lethality for a cationic sequence-random copolymer that mim?ics host-defense antimicrobial peptides[J].Journal of Molecular Biology,2008,379(1):38-50.

[18] Epand R F,Sarig H,Mor A,et al.Cell-wall interactions and the selective bacteriostatic activity of a miniature oligo-acyl-lysyl[J].Biophysical Journal,2009,97(8):2250-2257.

[19] Melo M N,Ferre R,Castanho M A R B.Antimicrobial peptides:linking partition,activity and high membrane-bound concentra?tions[J].Nature Reviews Microbiology,2009,7(3):245.

[20] Teixeira V,Feio M J,Bastos M.Role of lipids in the interaction of antimicrobial peptides with membranes[J].Progress in Lipid Research,2012,51(2):149-177.

[21] Bechinger B.Rationalizing the membrane interactions of cationic amphipathic antimicrobial peptides by their molecular shape[J].Current Opinion in Colloid and Interface Science,2009,14(5):349-355.

[22] Catalina D M A.Elucidating the mechanism of action of antimi?crobial peptides by means of computational approaches[J].Tech?nische Universit?t Berlin,2017.

[23] Marquardt D,Kuc?erka N,Katsaras J,et al.α-Tocopherol's loca?tion in membranes is not affected by their composition[J].Lang?muir,2014,31(15):4464-4472.

[24] Epand R M,D'Souza K,Berno B,et al.Membrane curvature mod?ulation of protein activity determined by NMR[J].Biochimica ET Biophysica Acta,2015,1848(1):220-228.

[25]Epand R M,Epand R F.Domains in bacterial membranes and the action of antimicrobial agents[J].Molecular Biosystems,2009,5(6):580-587.

[26] Epand R M,Epand R F.Bacterial membrane lipids in the action of antimicrobial agents[J].Journal of Peptide Science,2011,17(5):298-305.

[27] Epand R F,Wang G,Berno B,et al.Lipid segregation explains selective toxicity of a series of fragments derived from the human cathelicidin LL-37[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2009,53(9):3705-3714.

[28] Epand R M,Rotem S,Mor A,et al.Bacterial membranes as pre?dictorsof antimicrobial potency[J].Journal of the American Chem?ical Society,2008,130(43):14346-14352.

[29] Vineethkumar T V,George S.a review of the mechanism of ac?tion of amphibian antimicrobial peptides focusing on peptide-membrane interaction and membrane curvature[J].Current Pro?tein and Peptide Science,2017,18(12):1263-1272.

[30] Bugg T D H,Braddick D,Dowson C G,et al.Bacterial cell wall assembly:Still an attractive antibacterial target[J].Trends in Biotechnology,2011,29(4):167-173.

[31] Hanson B R,Neely M N.Coordinate regulation of Gram-positive cell surface components[J].Current Opinion in Microbiology,2012,15(2):204-210.

[32] Lai P K,Kaznessis Y.Insights into protegrin antimicrobial pep?tides membrane translocation by multistep molecular dynamics simulations[J].Bulletin of the American Physical Society,2018.

[33] Irudayam SJ,Berkowitz M L.Binding and reorientation of melit?tin in a POPC bilayer:Computer simulations[J].Biochimica et Biophysica Acta,2012,1818(12):2975-2981.

[34] Brogden K A.Antimicrobial peptides:Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?[J].Nature Reviews Microbiology,2005,3(3):238.

[35] Jenssen H,Hamill P,Hancock R E W.Peptide antimicrobial agents[J].Clinical microbiology reviews,2006,19(3):491-511.

[36] Manzini M C,Perez K R,Riske K A,et al.Peptide:lipid ratioand membrane surface charge determine the mechanism of action of the antimicrobial peptide BP100.Conformational and functional studies[J].Biochimica ET Biophysica Acta,2014,1838(7):1985-1999.

[37] Wimley W C.Describing the mechanism of antimicrobial peptide action with theinterfacial activity model[J].ACSchemical biology,2010,5(10):905-917.

[38] Jenssen H,Hamill P,Hancock R E W.Peptide antimicrobial agents[J].Clinical Microbiology Reviews,2006,19(3):491-511.

[39] Fuente-Nú?ez CDL,Reffuveille F,Fernández L,et al.Bacterial biofilm development as amulticellular adaptation:antibiotic resis?tance and new therapeutic strategies[J].Current Opinion in Micro?biology,2013,16(5):580-589.

[40] Rabin N,Zheng Y,Opoku-Temeng C,et al.Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents[J].Future,2015,7(4):493-512.

[41] Nwodo U U,Green E,Okoh A I.Bacterial exopolysaccharides:functionality and prospects[J].International Journal of Molecular Sciences,2012,13(11):14002-14015.

[42] Das T,Sharma P K,Busscher H J,et al.Role of extracellular DNA in initial bacterial adhesion and surface aggregation[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,76(10):3405-3408.

[43] Soni K A,Balasubramanian A K,Beskok A,et al.Zeta potential of selected bacteria in drinking water when dead,starved,or exposed to minimal and rich culture media[J].Current Microbi?ology,2008,56(1):93-97.

[44] Heistad A,Scott T,Skaarer A M,et al.Virus removal by unsatu?rated wastewater filtration:effects of biofilm accumulation and hydrophobicity[J].Water Science and Technology,2009,60(2):399-407.

[45] Hochbaum A I,Aizenberg J.Bacteria pattern spontaneously on periodic nanostructure arrays[J].Nano Letters,2010,10(9):3717-3721.

[46] 徐博成,王家俊,丑淑麗,等.細(xì)菌對AMPs的抗性及機理[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2017,29(6):1874-1883.

[47] Batoni G,Maisetta G,Esin S.Antimicrobial peptides and their interaction with biofilms of medically relevant bacteria[J].Biochi?mica ETBiophysica Acta,2016,1858(5):1044-1060.

[48]Xu W,Zhu X,Tan T,et al.Design of Embedded-Hybrid Antimi?crobial Peptides with Enhanced Cell Selectivity and Anti-Biofilm Activity[J].Plos One,2014,9(6):98935.

[49] Bahnsen JS,Franzyk H,Sayers E J,et al.Cell-penetrating anti?microbial peptides-prospectives for targeting intracellular infec?tions[J].Pharmaceutical Research,2015,32(5):1546-1556.

[50] Benincasa M,Runti G,Mardirossian M,et al.methods for eluci?dating the mechanism of action of proline-rich and other non-lyt?ic antimicrobial peptides[J].Methods Mol Biol,2017:283-295.

[51] Bastos P,Trindade F,Costa JD,et al.human antimicrobial pep?tides in bodily fluids:Current knowledge and therapeutic perspec?tives in the postantibiotic era[J].Medicinal Research Reviews,2018,38(1):101-146.

[52] Han J,Zhao S,Ma Z,et al.The antibacterial activity and modes of LI-F type antimicrobial peptides against Bacillus cereus in vitro[J].Journal of Applied Microbiology,2017,123(3):602-614.

[53] Lohner K.Membrane-active antimicrobial peptides as template structures for novel antibiotic agents[J].Current Topics in Medici?nal Chemistry,2017,17(5):508-519.

[54] Sharma A,Pohane A A,Bansal S,et al.Cell penetrating synthetic antimicrobial peptides(SAMPs)exhibiting potent and selective killing of Mycobacterium by targeting its DNA[J].Chemistry-A European Journal,2015,21(9):3540-3545.

[55] Scocchi M,Lüthy C,Decarli P,et al.The proline-rich antibacteri?al peptide Bac7 binds to and inhibits in vitro the molecular chap?erone DnaK[J].International Journal of Peptide Research and Therapeutics,2009,15(2):147-155.

[56] Leeuw E D,Li C,Zeng P,et al.Functional interaction of human neutrophil peptide-1 with the cell wall precursor lipidⅡ[J].Febs Letters,2010,584(8):1543-1548.

[57] Nan Y H,Park K H,Park Y,et al.Investigatingtheeffects of posi?tive charge and hydrophobicity on the cell selectivity,mechanism of action and anti-inflammatory activity of a Trp-rich antimicro?bial peptide indolicidin[J].Fems Microbiology Letters,2009,292(1):134-140.

[58] 劉忠淵.新疆家蠶AMPs結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及抗菌作用機理的研究[D].烏魯木齊:新疆大學(xué),2008:30-32.

[59] Wang J J,Chou S L,Xu L,et al.High specific selectivity and membrane-activemechanism of thesynthetic centrosymmetricαhelical peptides with gly-gly pairs[J].Scientific Reports,2015,5:1-19.

[60] 衣同輝.五種AMPs的設(shè)計、原核表達和抗菌作用機理研究[D].長春:吉林大學(xué),2014.

[61] Luque-Ortega J R,van't Hof W,Veerman E C I,et al.Human antimicrobial peptide histatin 5 is a cell-penetrating peptide targeting mitochondrial ATP synthesis in Leishmania[J].The Faseb Journal,2008,22(6):1817-1828.

[62]Zhou Y,Chen WN.iTRAQ-coupled 2-D LC-MS/MSanalysis of membrane protein profile in Escherichia coli incubated with apidaecin IB[J].Journal of Proteomics,2011,75(2):511-516.

[63] 徐奇友.綠色飼料添加劑[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,2008.