錢　媛，洪　挺，章光文，殷海霞1,，段和祥，黃　東，楊毅生#

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌330004； 2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院/江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌　330029； 3.江西省食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)劃財(cái)務(wù)處，江西 南昌　330029)

*碩士研究生。研究方向：藥學(xué)。E-mail：chain8@163.com

#通信作者：副主任中藥師。研究方向：中藥活性成分和質(zhì)量控制研究。E-mail：1020115850@qq.com

滿山香片由滿山香單味中藥組成，具有清熱解表之功效，用于外感風(fēng)熱，發(fā)熱頭痛、咽痛及身痛。在江西民間，滿山香藥材常用于治療流行性感冒，此外還用于風(fēng)濕痛、月經(jīng)不調(diào)、神經(jīng)衰弱、補(bǔ)虛及驅(qū)蛔等[1]。近年來，其抗腫瘤活性成分的研究越來越受到關(guān)注[2]。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)頒布件[批件號：(2012)國藥標(biāo)字ZD-0 674號]，標(biāo)準(zhǔn)編號：WS-11216(ZD-1216)-2002-2012Z，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文收載了性狀、槲皮素的薄層色譜鑒別、片劑常規(guī)檢查項(xiàng)及高效液相色譜法測定山柰素的含量。由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較簡單，并僅用山柰素這一常見化合物來控制產(chǎn)品質(zhì)量，不能全面地反映制劑質(zhì)量，不利于制劑質(zhì)量的準(zhǔn)確控制；同時(shí)，含量方法操作復(fù)雜，重現(xiàn)性不好。為更有效地控制制劑質(zhì)量，參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]，本研究建立了以滿山香對照藥材、山柰素和槲皮素對照品的薄層色譜鑒別法，修訂了高效液相色譜法測定制劑中山柰素的含量方法，以保證藥品的有效性和安全性。

1　材料

1.1　儀器

SHIMADZU LC-2010AD型高效液相色譜儀(四元泵；二極管陣列檢測器；LC solution色譜工作站；自動進(jìn)樣器)(日本島津公司)；Sartorius BT25S型電子天平(德國賽托利斯公司)；Sartorius BSA 124S-CW型電子天平(德國賽托利斯公司)；KQ5200B型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；TLC Visualzer薄層成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司)。

1.2　藥品與試劑

滿山香片(江西本真藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：20131101、20140801和20150301，規(guī)格：0.34 g/片)；槲皮素對照品(批號：100081-200907，純度：96.5%)、山柰素對照品(批號：110861-201209，純度：93.2%)，均購自中國藥品生物制品檢定所；對照藥材(江西本真藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院萬林春副主任中藥師鑒定為正品)；羥甲基纖維素鈉(批號：110819)、硅膠G(青島海洋化工廠分廠，批號：20160812)；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1　定性鑒別

2.1.1槲皮素、山柰素的薄層色譜法的建立：參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]，取本品5片，除去包衣，研細(xì)，取約0.6 g，置于圓底燒瓶中，加入甲醇-鹽酸(V∶V=10 ∶1)混合溶液50 ml，混勻，加熱回流1 h，冷卻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取槲皮素、山柰素對照品，加甲醇分別制成每1 ml含0.1、1.0 mg的溶液，作為對照品溶液。按滿山香片處方和工藝分別制備缺滿山香藥材的單一陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)通則0502]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(V∶V∶V=10 ∶8 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，在供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，見圖1。

1.槲皮素對照品溶液；2.山柰素對照品溶液；3.供試品溶液 (批號：20131101)；4.供試品溶液(批號：20140801)；5.供試品溶液 (批號：20150301)；6.陰性對照溶液 1.reference substance solution of kaempferide； 2.reference substance solution of quercetin； 3.test solution (batch number：20131101)； 4.test solution(batch number： 20140801)； 5.test solution(batch number：20150301)； 6.negative control solution 圖1　槲皮素、山柰素的薄層色譜圖Fig 1　TLC chromatograms of kaempferide and quercetin

2.1.2滿山香：取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液，作為供試品溶液。參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，另取滿山香對照藥材0.3 g，加水50 ml煎煮2次，1次1 h，合并煎液，放冷、離心(轉(zhuǎn)速為3 000 r/min)，去除藥渣，溶液減壓濃縮至近干，加入70%乙醇溶液100 ml，攪勻，冷藏靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇至干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)通則0502]試驗(yàn)，分別吸取上述對照品和供試品溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(V∶V∶V∶V=15 ∶40 ∶22 ∶10)于5～10 ℃放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱數(shù)分鐘至斑點(diǎn)顯色清晰，分別在日光和紫外光(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的主斑點(diǎn)，紫外光下顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，見圖2。

A.日光；B.紫外光(365 nm)；1.滿山香對照藥材溶液； 2.供試品溶液(批號：20131101)；3.供試品溶液(批號：20140801)； 4.供試品溶液(批號：20150301)；5.滿山香對照藥材溶液； 6.陰性對照品溶液 A.sunlight；B.ultraviolet light(365 nm)；1.reference substance solution of Manshanxiang；2.test solution(batch number：20131101)；3.test solution(batch number：20140801)； 4.test solution(batch number：20150301)；5.reference substance solution of Manshanxiang；6.negative control solution 圖2　滿山香的薄層色譜圖Fig 2　TLC chromatograms of Manshanxiang

2.2　含量測定

2.2.1對照品溶液的制備：精密稱取山柰素對照品11.11 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品母液。精密量取上述對照品母液1 ml，置于10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備：參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定質(zhì)量；超聲處理(功率：500 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量；搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 ml，置于100 ml圓底燒瓶中，加鹽酸3 ml，混勻，熱回流1 h，然后迅速冷卻至室溫(25 ℃)，再減壓濃縮至約10 ml，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液并入容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備：按處方取不含滿山香藥材，照本制劑的制備工藝制成陰性對照樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照品溶液。

2.2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(V∶V=47 ∶53)；流速為1 ml/min；檢測波長為365 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μl；在上述色譜條件下，理論板數(shù)以山柰素峰計(jì)>3 000。結(jié)果顯示，各成分基線分離良好，分離度>1.5[11-12]，見圖3。

A.山柰素對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液 A.reference substance solution of kaempferide； B.test solution；C.negative control solution 圖3　高效液相色譜圖(365 nm)Fig 3　HPLC chromatograms(365 nm)

2.2.5線性關(guān)系考察：分別吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液2、5及10 μl，對照品母液2、4 μl，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定對照品峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸處理，回歸方程為Y=4 104 447.089 2X-4 905.265 7(r=0.999 8)，計(jì)算得山柰素對照品進(jìn)樣量在0.041 4～0.828 4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6精密度試驗(yàn)：精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液10 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定山柰素峰面積值。結(jié)果顯示，重復(fù)進(jìn)樣6次的峰面積值分別為856 383、857 217、857 435、856 089、859 188和859 261，平均峰面積值為857 993，RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液(批號：20150301)10 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、1、2、3、6、9、12和24 h，測定供試品溶液中山柰素峰面積值。結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)供試品山柰素峰面積值分別為960 229、961 579、962 262、960 771、962 112、960 794、962 154和963 920，平均峰面積值為962 245，RSD為0.13%，表明供試品溶液在室溫(25 ℃)放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn)：取批號為20150301的樣品，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算山柰素含量。結(jié)果顯示，山柰素含量的RSD為1.28%，表明本方法重復(fù)性良好，見表1。

表1　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 1　Results of repeatability tests

2.2.9加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量樣品(批號：20150301，山柰素含量為2.422 7 mg/g)適量，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取6份，每份約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，再分別精密加入含山柰素(質(zhì)量濃度為0.031 8 mg/ml)對照品溶液25 ml，稱定質(zhì)量；超聲處理(功率：500 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液20 ml，置于圓底燒瓶中，加鹽酸3 ml，混勻，加熱回流1 h，迅速冷卻至室溫(25 ℃)，減壓濃縮至約10 ml，移至25 ml容量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液并入量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2　Results of sample recovery tests(n=6)

2.2.10耐用性試驗(yàn)：取本品(批號：20150301)，照“2.2”項(xiàng)下方法制備，分別用A[Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)]、B[SHIMADZU Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)]和C[COSMOSIL 5C18-AR-Ⅱ柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)]三種品牌的色譜柱，按正文中的色譜條件對其進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，山柰素含量的RSD為0.91%，三種品牌色譜柱無明顯差別。

2.2.11樣品含量測定：取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3　樣品含量測定結(jié)果(n=3)Tab 3　Results of content determination of samples(n=3)

3　討論

滿山香具有廣泛而顯著的藥理作用，在民間具有悠久的使用歷史，其治療感冒發(fā)熱具有良好的臨床效果，因而具有很大的潛在藥用價(jià)值，其已被開發(fā)出滿山香片制劑，臨床用于外感風(fēng)熱，發(fā)熱頭痛、咽痛及身痛等。采用滿山香對照藥材薄層色譜法鑒別控制滿山香片的質(zhì)量，確保原料的質(zhì)量，可以大幅度提高藥品的質(zhì)量，保證藥品的有效性，從而確定滿山香片的療效；通過山柰素的含量測定嚴(yán)格控制藥品質(zhì)量，山柰素類化合物亦是滿山香片的主要有效成分之一，可以嚴(yán)格控制藥品質(zhì)量，保證藥品安全、有效。

本研究僅對山柰素進(jìn)行含量測定是因?yàn)榻?jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素在制劑中的含量比較低，而且較不穩(wěn)定，含量差異較大，推測槲皮素可能是以結(jié)合形式存在于制劑中，故未選用槲皮素進(jìn)行含量鑒別。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，在山柰素含量測定方面，通過超聲提取后加酸水解，最后使用聚酰胺住富集山柰素的含量制得供試品。但經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過聚酰胺柱并沒有起到富集作用，且對山柰素在制劑中的含量影響較大，方法復(fù)雜，重現(xiàn)性差，對質(zhì)量控制不利，故本研究僅通過考察酸水解等因素簡化實(shí)驗(yàn)步驟，方法穩(wěn)定可控，利于山柰素含量測定。

3.1　定性指標(biāo)的選擇

本研究分別優(yōu)化了供試品與對照品的點(diǎn)樣量，比較了預(yù)制板和自制板對斑點(diǎn)的影響，考察了不同溫濕度下的展開情況，充分查閱文獻(xiàn)，通過優(yōu)化顯色劑，得到清晰的薄層色譜斑點(diǎn)，充分驗(yàn)證了薄層色譜鑒別法的重現(xiàn)性和耐用性。在滿山香藥材薄層色譜中，對滿山香對照藥材處理方法也進(jìn)行了考察，對比了藥材用甲醇直接超聲和按照處方工藝處理的差異。結(jié)果表明，按照處方工藝來處理，使?jié)M山香對照藥材和供試品色譜斑點(diǎn)基本相同，更能真實(shí)客觀地反應(yīng)出滿山香藥材的色譜行為，能系統(tǒng)地評價(jià)所使用滿山香藥材的質(zhì)量，從而準(zhǔn)確反應(yīng)出滿山香片的質(zhì)量。

3.2　含量測定條件的選擇

按原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對3批供試品進(jìn)行含量測定檢驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果不準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較差，且操作較復(fù)雜。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，滿山香藥材中山柰素主要是以結(jié)合苷的形式存在，游離量非常少，考慮到可能是鹽酸用量和酸水解時(shí)間對其含量的影響[13-16]。因此，本研究針對性地對山柰素的含量測定條件進(jìn)行摸索：首先，考察了超聲時(shí)間對含量的影響。分別超聲20、30、40及50 min，結(jié)果顯示，山柰素的含量分別為0.60、0.76、0.75及0.76 mg/片，表明超聲30 min已經(jīng)超聲完全，故選擇超聲30 min。其次，考察了鹽酸用量情況。鹽酸加入量分別為0.5、1.0、2.0、3.0及4.0 ml，結(jié)果顯示，山柰素的含量分別為0.46、0.56、0.72、0.76及0.76 mg/片，可見鹽酸用量對結(jié)果影響較大，且鹽酸用量3.0與4.0 ml時(shí)的測定結(jié)果無顯著差異，表明酸水解基本完全，故鹽酸用量選取3.0 ml。再次，考察了水解時(shí)間的影響。分別加熱回流20、30 min和1、2、3 h，結(jié)果顯示，山柰素的含量分別為0.41、0.74和0.75、0.73、0.61 mg/片，表明加熱回流30 min與1 h的測定結(jié)果無顯著差異，而2、3 h的測定結(jié)果呈下降趨勢，考慮到樣品批次間差異，為保證酸水解完全，故加熱回流時(shí)間選取1 h。最后，考察了水浴溫度對水解的影響。分別采用60、80及100 ℃的水浴溫度，結(jié)果顯示，山柰素的含量分別為0.52、0.70及0.75 mg/片，表明水浴溫度為100 ℃時(shí)酸水解最為徹底，故采用水浴100 ℃。另外，原標(biāo)準(zhǔn)中需要對水解后的溶液進(jìn)行聚酰胺柱純化，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在高效液相色譜圖譜中山萘素色譜峰旁邊未有其他色譜峰干擾，且峰面積在聚酰胺柱純化前后差異不大，故刪除該聚酰胺純化過程。

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