祁 鑫，蔣桃珍，李偉杰

(1.北京農(nóng)學院，北京 102206；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是一種人獸共患病病原菌，不但能夠感染多種家禽、家畜和野生動物，而且可以感染人，主要引起呼吸系統(tǒng)疾病、局灶性感染及出血性敗血癥，導致的疾病包括禽霍亂、豬萎縮性鼻炎及肺炎、牛出血性敗血癥及肺炎、兔出血性敗血癥以及人的皮膚壞死等，嚴重威脅動物及人類健康[1]。不同型的多殺性巴氏桿菌與其導致的疾病存在一定的關聯(lián)，因此開展多殺性巴氏桿菌流行病學調(diào)查，進行快速準確的分型顯得尤為重要。

多殺性巴氏桿菌的分型方法主要包括血清學分型方法和分子分型方法，前者主要包括Carter分型和Heddleston分型[2-3]，后者主要包括莢膜多重PCR分型方法[4]、脂多糖多重PCR分型方法[5]、多位點序列分型方法(multilocus sequence typing，MLST)[6]、脈沖場凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE)[7]、全基因組測序(whole genome sequence，WGS)[8]等。本文就多殺性巴氏桿菌的分型方法研究進展進行綜述，以期為臨床多殺性巴氏桿菌流行病學調(diào)查提供參考。

1 血清學分型方法

多殺性巴氏桿菌的血清學分型方法包括基于間接血凝試驗的Carter分型和基于瓊脂擴散試驗的Heddleston分型，分別依據(jù)莢膜抗原和脂多糖抗原的差異，前者分為A、B、D、E和F共5種血清群，后者分為1～16共16種血清型[9]。通常將兩者結合起來表示多殺性巴氏桿菌的血清型，例如A∶1、B∶2等。多殺性巴氏桿菌的不同血清型與其所致的疫病有一定的關聯(lián)，但不同血清型之間的交叉免疫保護較低，因此血清學分型方法的建立和應用對于流行病學的調(diào)查以及后續(xù)疫苗的研發(fā)具有重要的意義。但血清學分型方法基于細菌的表型特征，培養(yǎng)條件會影響這些表型特征的表達，從而降低鑒定的穩(wěn)定性和可靠性，而且血清學方法操作繁瑣，對抗血清的特異性有很高的要求，不適宜臨床大規(guī)模快速進行流行病學調(diào)查。

2 基于莢膜編碼區(qū)的多重PCR分型方法

針對Carter分型中不同血清群多殺性巴氏桿菌的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，編碼莢膜的基因成簇存在[10]，按照功能的不同分為3個區(qū)域，分別與莢膜多糖的輸出、莢膜多糖的合成、莢膜多糖的磷脂替換有關，在不同血清型的多殺性巴氏桿菌中，區(qū)域2存在一定的差異，其他2個區(qū)域較為保守[4]。血清群A、D和F莢膜多糖合成相關區(qū)域均含有4個編碼基因(hyaE、D、C、B，dcbE、F、C、B，fcbE、D、C、B)，其中dcbF基因為血清D群菌株所特有，血清F群菌株的fcbD基因與血清A群菌株hyaD基因同源性為82%；血清群B和E均含有9個編碼基因(bcbA、B、C、D、E、F、G、H、I，ecbA、B、J、K、D、E、F、G、I)，其中ecbJ基因為血清E群菌株獨有，血清E群菌株的ecbD基因與血清B群菌株的bcbC基因同源性只有23%[4]?；谝陨匣虻牟煌稽c，Townsend K M等[4]建立了多殺性巴氏桿菌莢膜分型的多重PCR方法。該方法具有操作簡單、準確快速等特點，結果能夠與Carter分型相對應，目前已完全取代Carter分型，在多殺性巴氏桿菌所引起的疾病的臨床診斷中得到了廣泛應用[11-12]。我國豬群中流行的多殺性巴氏桿菌主要為A群和D群，雞群中流行的多殺性巴氏桿菌主要為A群。我國現(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《禽霍亂(禽巴氏桿菌病)診斷技術NY/T 563—2016》、《豬巴氏桿菌病診斷技術NY/T564—2016》也將此方法列入標準中。該方法存在的不足之處是部分菌株無法定型[13]。

3 基于脂多糖外核編碼基因簇的多重PCR分型方法

多殺性巴氏桿菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)主要包括內(nèi)核和外核兩部分，內(nèi)核由類脂A和核心低聚糖組成，外核由側鏈低聚糖組成[14]。Harper M等[15]對Heddleston 1～16型多殺性巴氏桿菌參考菌株的LPS組裝基因序列分析發(fā)現(xiàn)，這些菌株的LPS具有高度保守的內(nèi)核和可變的外核。外核主要由不同數(shù)量的葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺以及庚糖等通過一系列的轉移酶連接組成[14]。與LPS外核合成和組裝相關的基因在多殺性巴氏桿菌基因組上分布較為集中，均位于兩個保守的且與LPS合成無關的基因priA和fpg之間，不同的Heddleston血清型參考菌株包含有5～13個不等基因[14]。通過對其同源性分析，可將多殺性巴氏桿菌分為8個不同的基因型，LPS基因型L1包括血清型1和14，L2包括血清型2和5，L3包括血清型3和4，L4包括血清型6和7，L5包括血清型9，L6包括血清型10、11、12和15，L7包括血清型8和13，L8包括血清型16[5]。多殺性巴氏桿菌LPS外核編碼基因簇的差異，為多殺性巴氏桿菌基于LPS分型提供了理論基礎。Harper M等[5]根據(jù)不同Heddleston血清型外核側鏈多糖組裝所需的不同基因位點設計引物，建立了一種能對全部8種LPS基因型進行鑒定的多重PCR方法，該方法與質譜分析結果匹配良好，能夠對全部16種Heddleston血清型的多殺性巴氏桿菌進行快速檢測，但不能與Heddleston分型方法形成一一對應關系。Peng等從患呼吸系統(tǒng)疾病的豬肺臟分離獲得115株多殺性巴氏桿菌，經(jīng)LPS多重PCR分型檢測包括2種基因型，其中L3 基因型占22.6%，L6基因型占77.4%[16]。

4 多位點序列分型方法

多殺性巴氏桿菌的多位點序列分型(MLST)是由多位點酶電泳(multilocus enzyme electrophoresis，MLEE)衍生而來的，是以核酸序列為基礎對細菌進行分型的方法，它基于7個看家基因的等位基因位點的組合而獲得目標菌株的序列型(sequence type，ST型)[6]。由于看家基因序列的變化速率很慢，若兩菌株的分型結果相同，便可以認為這兩株細菌屬于相同克隆或克隆群。多殺性巴氏桿菌多位點序列分型在線數(shù)據(jù)庫有2個(http://pubmlst.org/pmultocida)：RIRDC MLST由澳大利亞動物研究所開發(fā)，主要針對禽源多殺性巴氏桿菌[6]，所使用的7個看家基因為adk(腺苷酸環(huán)化酶)、est(酯酶基因)、pmi(6-磷酸-甘露糖異構酶基因)、gdhA(谷氨酸脫氫酶)、zwf(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、mdh(蘋果酸脫氫酶)、pgi(磷酸葡萄糖異構酶)，目前共有344個ST型，但已停止對外服務；Multi-host MLST由英國格拉斯哥大學開發(fā)，針對不同宿主來源的多殺性巴氏桿菌，所使用的7個看家基因為adk、aroA(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成基因)、deoD(嘌呤核苷酸磷酸化酶)、gdhA、g6pd(即zwf)、mdh、pgi，PCR擴增和測序引物參見http://pubmlst.org/pmultocida，目前共有72個ST型。多位點序列分型具有以下特點：分型力好、可重復性好；已經(jīng)實現(xiàn)全球數(shù)據(jù)比對和綜合分析；分辨力一般，不能單獨用于暴發(fā)菌株溯源分析；成本比較高。已有研究表明，我國引起禽霍亂的禽源多殺性巴氏桿菌主要為ST129[14,16]。Petersen A等[17]和Moustafa A M等[18]分別對與出血性敗血癥相關的多殺性巴氏桿菌進行RIRDC MLST分析，發(fā)現(xiàn)與該病相關的菌株主要為ST122。García-Alvarez A等[19]對分離自不同商品化養(yǎng)兔場的11株多殺性巴氏桿菌進行multi-host MLST分型，發(fā)現(xiàn)全部為ST11。García-Alvarez 等對分離自綿羊肺炎的43株多殺性巴氏桿菌進行Multi-host MLST分型檢測，共檢測出16個ST型，其中ST50和ST19為主要的ST型，占全部菌株的53.5%，而且所有ST型只在患小反芻獸疫的羊中檢測出，說明這些ST型所屬菌株具有宿主特異性。研究還表明，綿羊分離株和豬分離株分屬于不同的亞群[20]。上述研究均說明多殺性巴氏桿菌的ST型與動物疫病之間可能存在的一定的相關性。

5 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳(PFGE)是基于細菌DNA指紋圖譜的基因分型技術，基本過程是將純培養(yǎng)的細菌與低熔點瓊脂糖(含SDS)進行包埋，用蛋白酶K消化，待DNA釋放后，選用識別稀有酶切位點的限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，獲得大小不等的DNA片段，在外加脈沖電場的低濃度瓊脂糖凝膠中分離，產(chǎn)生數(shù)量有限的DNA條帶，染膠、讀膠，用計算機軟件(如Bion Numeris)進行分析。影響脈沖場凝膠電泳分辨力的因素包括限制性內(nèi)切酶的選擇、脈沖時間、電場強度、溫度、緩沖液組成、瓊脂糖類型和濃度、電場夾角等。PFGE分型力好、分辨力高、可重復性好，已有成熟的標準化技術方案，可實現(xiàn)數(shù)據(jù)分析的網(wǎng)絡化，對于大部分細菌是暴發(fā)溯源中細菌分型的“金標準”。Cardoso-Toset F等[21]對從不同患敗血癥豬的各種組織中分離的多殺性巴氏桿菌，利用Bsp1201限制性內(nèi)切酶進行PFGE分型，證明為同一菌株感染。Moustafa A M等[18]對分離自巴基斯坦和泰國的23株多殺性巴氏桿菌進行PFGE分型發(fā)現(xiàn)，兩國分離的菌株只有1條酶切條帶的差異，而且各國田間分離株與各自使用的疫苗株帶型相同。Dagleish M P等[22]對英國臨床分離的1株牛源多殺性巴氏桿菌與美國1株牛肺炎模型菌株進行比較分析，PFGE分別有10條和11條帶，說明兩者之間具有地域和遺傳學上的差異，而且氣管內(nèi)接種兩者引起的病理嚴重程度不同，這也對新型疫苗的研發(fā)提供了依據(jù)。

6 全基因組測序

全基因組測序(WGS)是指通過高通量測序技術對病原菌整個基因組進行測序，并通過生物信息學技術對序列特征進行分析，可在全基因組水平探究物種的遺傳進化規(guī)律和種群遷移等。目前，全基因組測序分型主要有兩種方式，即基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性分型(whole genome-based single-nucleotide polymorphisms,wgSNP)和基于全基因組的多位點序列分型(whole genome multilocus sequence typing,wgMLST)。wgSNP是在全基因組序列的水平上選擇一定數(shù)目的SNP，比較不同細菌基因組SNP的信息，從而達到將同一個種內(nèi)的不同菌株進行分型的目的。wgMLST是使用某一個種的細菌核心基因組中的成百上千個基因位點的序列差異對菌株進行區(qū)分和分型的方法。Moustafa A M等[8]對12株引起敗血性出血癥的多殺性巴氏桿菌和1株疫苗株的全基因組序列測序后，基于wgSNP構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)分離自不同國家的菌株聚類在不同的分支；比對1 824個核心基因后發(fā)現(xiàn)，96個基因為13個菌株所共有，全基因組測序一方面能對上述菌株進行區(qū)分，另一方面也能提供候選基因用來建立快速診斷技術。全基因組測序方法在多殺性巴氏桿菌分型中由于在全基因組水平基于序列多態(tài)性進行分型，因此理論上比傳統(tǒng)的分子分型方法具有更高的分辨力，具有良好的分型力、可重復性和實驗室間可比性，便以建立分析網(wǎng)站和公共數(shù)據(jù)庫，容易實現(xiàn)標準化和網(wǎng)絡化應用，具有取代目前所有分子分型方法的潛力。

7 小結和展望

多殺性巴氏桿菌的血清分型或基因分型是其流行病學調(diào)查常采用的方法，選擇適宜的分型方法，對于了解其感染和致病規(guī)律等具有十分重要的意義。理想的病原菌分型方法應具備以下幾點：一是分型力好，能獲得菌株分型結果；二是分辨力高，能夠區(qū)分不相關的菌株；三是可重復性好，對同一菌株反復測試能夠獲得相同的結果；四是可比性好，不同實驗室的結果可以放在一起分析。基于以上幾點，采用標準化的細菌分子分型監(jiān)測技術，構建細菌性傳染病分子分型實驗室監(jiān)測網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)特征型別簇，提出預警信息，通過流行病學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)細菌性傳染病暴發(fā)流行，尤其是發(fā)現(xiàn)傳染病跨地區(qū)傳播和散在分布于不同地理區(qū)域的暴發(fā)流行，有助于實現(xiàn)細菌病監(jiān)控、跨地區(qū)關聯(lián)分析和傳染病的溯源。尤其是隨著測序技術的成熟，全基因組測序所需時間和成本不斷降低，為在全基因組序列水平上進行流行病學分析提供了基礎。WGS分型因其全面反應了病原菌的遺傳和變異特征，提高了菌株進化和溯源分析的分辨力，有助于快速確認并追蹤病原體、描述菌群結構、評估某種致病菌群的出現(xiàn)和傳播機制，其結果不但可以直接與經(jīng)典微生物分型方法，如MLST和PFGE進行比對，同時還可以通過公共數(shù)據(jù)庫方便全球共享和分析，在疾病監(jiān)控和暴發(fā)調(diào)查中將發(fā)揮越來越大的優(yōu)勢作用。