劉曉光，肖衛(wèi)華，陳佩杰，趙淋淋，曾志剛,2，周永戰(zhàn)，鄭莉芳

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剔除巨噬細(xì)胞可通過(guò)抑制肌再生因子和Akt/mTOR信號(hào)通路損害骨骼肌再生

劉曉光1，肖衛(wèi)華1，陳佩杰1，趙淋淋1，曾志剛1,2，周永戰(zhàn)1，鄭莉芳1

1. 上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院, 上海 200438; 2. 井岡山大學(xué) 體育學(xué)院, 江西 吉安 343009。

目的：探討骨骼肌挫傷修復(fù)過(guò)程中巨噬細(xì)胞與肌再生因子及Akt/mTOR信號(hào)通路間的關(guān)系，以深入研究巨噬細(xì)胞在骨骼肌挫傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制。方法：80只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為骨骼肌損傷組（S，n=32），損傷+巨噬細(xì)胞剔除組（T，n=32），未損傷對(duì)照組（SCon，n=8），未損傷+巨噬細(xì)胞剔除對(duì)照組（TCon，n=8）。骨骼肌挫傷后1d、3d、7d和14d取雙側(cè)腓腸肌外層。蘇木素-伊紅（HE）染色觀察骨骼肌形態(tài)學(xué)變化，熒光定量PCR（RT-PCR）及蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測(cè)肌再生相關(guān)因子及Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號(hào)分子表達(dá)變化。結(jié)果：1）HE結(jié)果顯示，S組和T組骨骼肌在挫傷后第1 d和3 d肌纖維結(jié)構(gòu)破壞、大量肌纖維壞死、腫脹。S組在損傷第7 d出現(xiàn)大量再生肌纖維，而T組在傷后第7 d僅出現(xiàn)少量再生肌纖維，傷后第14 d仍有大量再生肌纖維出現(xiàn)；2）RT-PCR結(jié)果顯示，S組骨骼肌成肌分化抗原（MyoD）和肌細(xì)胞生成素（myogenin）mRNA在挫傷后表達(dá)均顯著增加（＜0.01）。而與S組相比，T組損傷骨骼肌中MyoD顯著下調(diào)，myogenin顯著上調(diào)表達(dá)（＜0.05）；3）S組骨骼肌損傷后，與SCon組相比，除機(jī)械生長(zhǎng)因子（MGF）外，多種肌再生因子均顯著上調(diào)表達(dá)。與S組相比，T組損傷骨骼肌中多種肌再生因子表達(dá)均顯著下調(diào)。4）S組骨骼肌損傷后低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）和血管生成素1（Angpt1）mRNA表達(dá)均顯著增加，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA表達(dá)下降。與S組相比，T組HIF-1α和Angpt1在損傷后期顯著上調(diào)表達(dá)；5）WB結(jié)果顯示，骨骼肌損傷后，S組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6k和p-4EBP1/4EBP1表達(dá)均顯著增加，而T組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6k和p-4EBP1/4EBP1與TCon及S組相比均無(wú)顯著變化（＞0.05）。結(jié)論：巨噬細(xì)胞在骨骼肌挫傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，剔除巨噬細(xì)胞可損害挫傷骨骼肌再生，其機(jī)制可能與肌再生因子表達(dá)下調(diào)、蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路未激活有關(guān)。

骨骼??；損傷修復(fù)；巨噬細(xì)胞；肌再生因子；血管再生因子；蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路

骨骼肌是具有高度可塑性的組織，損傷后可進(jìn)行再生，恢復(fù)結(jié)構(gòu)和功能[11]。骨骼肌這種強(qiáng)大的自我再生能力主要依賴于肌衛(wèi)星細(xì)胞。肌衛(wèi)星細(xì)胞是一類肌源性前體細(xì)胞，存在于肌膜和基底膜之間。骨骼肌未損傷時(shí)肌衛(wèi)星細(xì)胞一般處于靜息狀態(tài)，而當(dāng)骨骼肌損傷后，肌衛(wèi)星細(xì)胞即可被激活，增殖、分化形成新的肌管或與受損肌纖維融合，參與骨骼肌損傷修復(fù)[31]。

研究表明，骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中，巨噬細(xì)胞也發(fā)揮了重要作用[4]。M1型巨噬細(xì)胞可分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）等炎性介質(zhì)，吞噬壞死肌肉組織。M2型巨噬細(xì)胞可分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、抗炎因子白介素-10（IL-10），及促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），調(diào)控骨骼肌再生和纖維化[32]。此外，巨噬細(xì)胞還能分泌VEGF，參與血管再生[23]，即巨噬細(xì)胞在損傷骨骼肌再生中發(fā)揮了多重作用，但其作用機(jī)制仍遠(yuǎn)未闡明。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在mdx小鼠[34]、毒素致傷[41,37,33]、氯化鋇注射致傷[18]等肌損傷動(dòng)物模型中有重要作用，但在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常見(jiàn)損傷——骨骼肌挫傷中，巨噬細(xì)胞是否發(fā)揮作用及如何發(fā)揮作用，卻少有研究。我們推測(cè)，和其他損傷模型相似，巨噬細(xì)胞在挫傷骨骼肌修復(fù)過(guò)程中也具有重要作用，巨噬細(xì)胞剔除可能會(huì)影響肌再生因子和蛋白質(zhì)合成信號(hào)分子表達(dá)，從而損害挫傷骨骼肌再生。為驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究建立了骨骼肌挫傷模型及巨噬細(xì)胞剔除模型，檢測(cè)了骨骼肌中多種肌再生因子及蛋白質(zhì)合成信號(hào)分子表達(dá)變化，深入探索了巨噬細(xì)胞在骨骼肌挫傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

80 只8 周齡C57BL/6雄性小鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）隨機(jī)分為骨骼肌損傷組（S，n=32）、損傷+巨噬細(xì)胞剔除組（T，n=32）、未損傷對(duì)照組（SCon，n=8）和未損傷+巨噬細(xì)胞剔除對(duì)照組（TCon，n=8）。小鼠腓腸肌損傷后第1 d、3 d、7 d和14 d取材，每組每時(shí)間點(diǎn)8只。

1.2 骨骼肌挫傷模型

小鼠用400 mg/kg體重水合氯醛腹腔注射麻醉后，使小鼠固定于平臺(tái)上，且膝關(guān)節(jié)伸直0°，踝關(guān)節(jié)背伸90°位。將重16.8 g，直徑1.6 cm的鋼珠，置于一管狀裝置頂端，自125 cm高處釋放，擊中一打擊裝置，打擊裝置底端撞擊小鼠腓腸肌中部（打擊面積28.26 mm2），制作骨骼肌挫傷模型[40,2]。

1.3 巨噬細(xì)胞剔除模型

小鼠腓腸肌挫傷前2 d，腹腔注射2 mg脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽（購(gòu)自www.clodronateliposomes.com），然后在損傷前 2 h小鼠腹腔注射0.5 mg脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽，之后在損傷后第3、6、9和12 d都注射0.5 mg脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽。此法可特異性剔除體內(nèi)巨噬細(xì)胞，而不影響其他細(xì)胞，是巨噬細(xì)胞剔除的最常用方法[39,30,17]。

1.4 動(dòng)物取材

在骨骼肌損傷修復(fù)相關(guān)研究中，通常不對(duì)肌纖維類型進(jìn)行特殊說(shuō)明，且腓腸肌為研究者最常用部位[14,6]，因此本研究也選取腓腸肌進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。小鼠腓腸肌挫傷后在不同時(shí)間點(diǎn)（1 d、3 d、7 d和14 d）取材。小鼠麻醉后頸椎脫位致死，迅速取雙側(cè)受損腓腸肌外層，對(duì)照組取腓腸肌相同部位，通過(guò)HE染色、RT-PCR及WB檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.5 HE染色

骨骼肌經(jīng)4%多聚甲醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）固定24 h后，石蠟包埋，橫切3～4 μm厚的連續(xù)薄片，切片脫蠟復(fù)水，蘇木精染色，1%鹽酸-酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡（Olympus DX70）下觀察并拍攝。

1.6 RNA 抽提和cDNA合成

取約60 mg肌肉組織，剪碎后加入1 ml Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），用機(jī)械勻漿器（IKA T10，德國(guó)IKA公司）粉碎勻漿。靜置10 min后，加入200 μl氯仿（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）并上下顛倒充分混勻后，靜置5 min，會(huì)出現(xiàn)明顯分層。然后12 000 rpm，4℃離心15 min后小心吸取500 μl上清移入一新離心管中，在此離心管中加入等量異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），顛倒混勻并靜置 20 min。冷凍離心機(jī)（centrifuge5417R，德國(guó)Eppendorf公司）中12 000 rpm，4℃離心10 min，白色羽毛狀沉淀即為 RNA。該沉淀用75%酒精（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）洗滌2 次后，加入30 μl DEPC水（生工生物工程（上海）股份有限公司）溶解。測(cè)OD值，OD260/280為1.8～2.0的樣品可用。取2 μg總RNA，按cDNA合成試劑盒說(shuō)明（K1622, Thermo Scientific 公司）加0.2μg隨機(jī)引物，20 mM dNTP mix, 5× Reaction buffer，20U RiboLockTMRNase Inhibitor 和200 U of RevertaidTMM-MuLV Reverse Transcriptase總體積是20 μl。在梯度PCR儀（Mastercycler EP，德國(guó) Eppendorf 公司），進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)過(guò)程中的溫度控制是25℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，然后，溫度降低到4 ℃，cDNA合成完成。合成的cDNA儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆肹22, 23]。

1.7 熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系包括12.5 μl 2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master mix（K0221，Thermo Scientific公司）、1 μl cDNA、無(wú)核酸酶水和300 nM的上下游引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，見(jiàn)表1。 使用熒光定量PCR儀（ABI SteponePlus Real Time PCR System7500，USA）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 變性15 s，60 ℃1 min退火/延伸，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)2-△△CT方法計(jì)算所測(cè)樣本mRNA的相對(duì)含量[24,25]。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.8 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

取60～80 mg腓腸肌移入2 ml EP管中，加入含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液（P0013B，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）后，剪碎組織并充分勻漿；4 ℃離心機(jī)12 000 rpm離心5 min，取上清液；二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)蛋白樣本濃度（P009，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SDS-PAGE電泳，5%濃縮膠，70 V恒壓電泳30 min，10%分離膠，110 V恒壓電泳90 min后（Protean tetra電泳槽，美國(guó)Biorad公司），用濕轉(zhuǎn)法（Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽，美國(guó) Biorad 公司）轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)默克密理博公司）上；PVDF膜于5%脫脂牛奶（光明乳業(yè)股份有限公司）中室溫封閉1.5 h；分別加入一抗Akt、磷酸化Akt、mTOR、磷酸化mTOR、p70 s6k、磷酸化p70 s6k、4EBP1、磷酸化4 EBP1和GAPDH（所有一抗為兔抗小鼠1:1000，CST公司），4°過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記二抗（1:5 000，Santa Cruz公司）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光法（Tanon 5200自動(dòng)發(fā)光儀，中國(guó)天能儀器有限公司）檢測(cè)蛋白條帶，采用Image J分析軟件測(cè)定條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞剔除模型的成功建立

圖1 脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽對(duì)損傷骨骼肌巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響

Figure 1 Effects of CL-liposomes on the Specific Markers of Macrophages of Muscle Post-injury.

注：a：CD68；b：CD206； S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細(xì)胞剔除組；SCon：未損傷對(duì)照組；TCon：未損傷+巨噬細(xì)胞剔除對(duì)照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時(shí)間點(diǎn)比較，c＜0.05；cc＜0.01；CD68：M1巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物；CD206：M2巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物。

RT-PCR結(jié)果顯示，S組骨骼肌中CD68（M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）[38,34,32,10]mRNA在傷后第1 d、3 d和7 d表達(dá)量均顯著增加（＜0.05）。與S組相比，T組CD68 mRNA在傷后1 d、3d和7d表達(dá)量均顯著降低（＜0.01），但在損傷后第14 d表達(dá)量顯著高于S組（＜0.01）。同時(shí)，T組CD206（M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）[15,24]mRNA在損傷后1 d和3 d表達(dá)量均顯著低于S組（＜0.01,圖1）。

同時(shí)，本課題組前期通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)損傷骨骼肌中巨噬細(xì)胞含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨骼肌損傷后第1 d和第3 d脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽處理組中巨噬細(xì)胞百分比顯著低于損傷組[39,17]。此結(jié)果和Shen等[27]相似，他們發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)脂質(zhì)體包被氯膦酸鹽處理，在傷后第1 d骨骼肌中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少了73.2%，第2 d減少了80.2%，第3 d減少77.4%，以上結(jié)果證實(shí)，巨噬細(xì)胞剔除模型得以成功建立。

2.2 骨骼肌挫傷模型的成功建立及巨噬細(xì)胞剔除對(duì)骨骼肌再生的影響

本研究采用重物擊打腓腸肌，建立骨骼肌挫傷模型。HE結(jié)果顯示，SCon組骨骼肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，肌細(xì)胞核位于肌膜下，肌纖維結(jié)構(gòu)完整性較好。損傷后第1 d，肌纖維結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。傷后第3 d，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷部位，且S組骨骼肌中可見(jiàn)少量再生肌纖維（中央核肌纖維）。骨骼肌損傷后第7 d，壞死肌纖維被大量中央成核肌纖維所代替，損傷后第14 d仍可見(jiàn)部分中央成核肌纖維。提示，骨骼肌挫傷后第14 d損傷骨骼肌未完全恢復(fù)。此結(jié)果證實(shí)，骨骼肌挫傷模型得以成功建立[40,2]。

雖然S組骨骼肌在傷后第3 d可見(jiàn)少量再生肌纖維，但T組骨骼肌中未見(jiàn)再生肌纖維。S組骨骼肌傷后第7 d可見(jiàn)大量新生肌纖維，T組僅有少量中央成核肌纖維零星分布，且仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在傷后第14 d，S組中大部分再生肌纖維已成熟，僅出現(xiàn)少量再生肌纖維，而在T組中出現(xiàn)大量再生肌纖維，表明巨噬細(xì)胞剔除使骨骼肌再生得以延遲，有損骨骼肌再生（圖2）。

圖2 巨噬細(xì)胞剔除損害骨骼肌再生

Figure 2 Macrophages Depletion Showed Markedly Impaired Muscle Regeneration after Injury.

2.3 巨噬細(xì)胞剔除對(duì)損傷骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化標(biāo)志物表達(dá)的影響

MyoD通常視為肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖標(biāo)志物，myogenin 為肌衛(wèi)星細(xì)胞分化標(biāo)志物[9]。與SCon組相比，S組MyoD mRNA在骨骼肌傷后第1 d和3 d表達(dá)顯著增加（＜0.01）。T組MyoD mRNA與S組相比，在傷后第7 d表達(dá)顯著降低（＜0.05） （圖3 a）。S組myogenin mRNA在傷后第1 d和3 d表達(dá)均顯著增加（＜0.01）。與S組相比，T組myogenin mRNA在傷后第14 d的表達(dá)顯著增加（＜0.05,圖3）。

圖3 巨噬細(xì)胞剔除對(duì)損傷骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化物表達(dá)的影響

Figure 3 Effects of Macrophages Depletion on the Marker of Proliferation and Differentiation of Satellite Cell Post Injury.

S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細(xì)胞剔除組；SCon：未損傷對(duì)照組；TCon：未損傷+巨噬細(xì)胞剔除對(duì)照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時(shí)間點(diǎn)比較，c＜0.05；cc＜0.01；

圖4 巨噬細(xì)胞剔除對(duì)損傷骨骼肌肌再生因子表達(dá)的影響

Figure 4 Effects of Macrophages Depletion on Regulatory Factors for Muscle Regeneration

S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細(xì)胞剔除組；SCon：未損傷對(duì)照組；TCon：未損傷+巨噬細(xì)胞剔除對(duì)照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時(shí)間點(diǎn)比較，c＜0.05；cc＜0.01；

2.4 巨噬細(xì)胞剔除對(duì)損傷骨骼肌肌再生因子表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，S組HGF mRNA在傷后第1 d、3 d和7 d表達(dá)量均顯著增加（＜0.01）。而T組HGF mRNA在傷后第1 d和3 d表達(dá)量均顯著低于S組（＜0.05,圖4 a）。

S組中uPA和IGF-1 mRNA的表達(dá)與HGF相似，在損傷后表達(dá)量顯著增加，巨噬細(xì)胞剔除后T組中uPA和IGF-1的表達(dá)顯著低于S組（圖4 b，c）。

骨骼肌損傷后S組MGF的表達(dá)與SCon組相比，無(wú)顯著變化（＞0.05）。T組MGF mRNA在損傷前顯著高于S組（＜0.01），而在損傷后第1 d和3 d表達(dá)量顯著低于S組（＜0.01）。

S組生長(zhǎng)分化因子11（GDF11）mRNA在傷后第1 d表達(dá)顯著增加（＜0.01），T組GDF11 mRNA在傷后第7 d顯著低于S組（＜0.05）。

S組大麻素受體2（CB2R）mRNA在傷后第1 d和3 d表達(dá)均顯著增加（＜0.01），而T組CB2R mRNA在傷后1 d和7 d表達(dá)均顯著低于S組（圖4）。

2.5 巨噬細(xì)胞剔除對(duì)損傷骨骼肌血管再生因子表達(dá)的影響

圖 5 巨噬細(xì)胞剔除對(duì)損傷骨骼肌血管再生因子表達(dá)的影響

Figure. 5 Effects of macrophage depletion on the expression of angiogenesis factors

S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細(xì)胞剔除組；SCon：未損傷對(duì)照組；TCon：未損傷+巨噬細(xì)胞剔除對(duì)照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時(shí)間點(diǎn)比較，c＜0.05；cc＜0.01；

熒光定量PCR研究發(fā)現(xiàn)，S組HIF-1α mRNA在傷后1 d、3 d和7 d表達(dá)顯著增加，而在傷后14d T組HIF-1α mRNA表達(dá)顯著高于S組（＜0.05,圖5 a）。

S組Angpt1 mRNA在傷后1-7d表達(dá)均顯著增加（＜0.01），傷后14 d雖進(jìn)行性下降，但仍顯著高于SCon組（＜0.01）。巨噬細(xì)胞剔除后T組中Angpt1在損傷前以及損傷后第14 d表達(dá)均顯著高于S組（＜0.05,圖5c）。

VEGF mRNA在傷后第7d表達(dá)顯著低于SCon組（＜0.05），而TCon組VEGF mRNA顯著高于SCon組（＜0.05,圖5 b）。

2.6 巨噬細(xì)胞剔除對(duì)損傷骨骼肌Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號(hào)分子的影響

圖 6 巨噬細(xì)胞剔除對(duì)損傷骨骼肌蛋白質(zhì)合成信號(hào)分子表達(dá)的影響

Figure. 6 Effects of macrophage depletion on the pathway of protein synthesis

S：骨骼肌損傷組；T：損傷+巨噬細(xì)胞剔除組；SCon：未損傷對(duì)照組；TCon：未損傷+巨噬細(xì)胞剔除對(duì)照組；與SCon組比較，a＜0.05；aa＜0.01；與TCon組比較，b＜0.05；bb＜0.01；S組與T組同一時(shí)間點(diǎn)比較，c＜0.05；ccP＜0.01；

WB結(jié)果顯示，S組骨骼肌p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR均在傷后第1d表達(dá)顯著增加（＜0.05），p-p70S6K/p70S6k在傷后1d和3d表達(dá)均顯著增加，p-4EBP1/4EBP1在傷后1d、3d、7d和14d表達(dá)均顯著增加。而T組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1與SCon組及S組相比雖有增加，但并無(wú)顯著變化（＞0.05，圖6a，b，c，d）

3 討論

3.1 巨噬細(xì)胞剔除下調(diào)肌再生因子表達(dá)，損害骨骼肌再生

MyoD一般作為生肌調(diào)節(jié)因子參與衛(wèi)星細(xì)胞激活，而myogenin則參與肌衛(wèi)星細(xì)胞分化[40]。本研究中，T組myogenin表達(dá)量在傷后1 d、3 d和7 d相比，于S組均不同程度降低，但第14 d卻處于高表達(dá)狀態(tài)。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果來(lái)看，T組在第14天時(shí)，仍有較多再生肌纖維（圖2），提示，巨噬細(xì)胞剔除可能延遲了肌衛(wèi)星細(xì)胞分化，損害了骨骼肌再生。此結(jié)果和Segawa等[26]相似，他們發(fā)現(xiàn)，抑制巨噬細(xì)胞活性可影響損傷骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化，損害骨骼肌再生。但Summan等[30]的研究認(rèn)為，剔除巨噬細(xì)胞并不影響肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化。從其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)看，Summan等僅用傷后第3 d研究巨噬細(xì)胞剔除對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響，存在一定的局限性，本研究采用多點(diǎn)檢測(cè)（傷后1-14 d），結(jié)果可能更為客觀。

骨骼肌再生過(guò)程中，多種肌再生因子發(fā)揮了重要作用，如IGF-1與骨骼肌蛋白質(zhì)合成有關(guān)，其異構(gòu)體MGF則可能參與了肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活[29,1]；HGF可激活骨骼肌中靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞[12]，uPA則促進(jìn)巨噬細(xì)胞向損傷骨骼肌趨化[7]；CB2R可調(diào)節(jié)損傷骨骼肌中炎癥反應(yīng)和纖維化[42]，而GDF11可影響成肌細(xì)胞分化[3]。這些因子中，有多種因子如IGF-1[18]、HGF[25]和uPA[21]等可由巨噬細(xì)胞分泌。本研究中，巨噬細(xì)胞剔除使挫傷骨骼肌修復(fù)受損，是否與這些因子有關(guān)？我們對(duì)此展開(kāi)了相關(guān)研究。結(jié)果表明，骨骼肌挫傷后，多種肌再生因子（MGF除外）均顯著上調(diào)表達(dá)，參與損傷骨骼肌修復(fù)，而巨噬細(xì)胞剔除后，這些肌再生因子出現(xiàn)顯著下調(diào)。提示，這些肌再生因子可能參與了巨噬細(xì)胞剔除損害骨骼肌再生這一過(guò)程。

3.2 巨噬細(xì)胞剔除調(diào)節(jié)骨骼肌血管再生因子表達(dá)損害骨骼肌再生

血管再生是骨骼肌損傷后修復(fù)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，骨骼肌損傷后新生的血管不僅能為再生組織提供充足的O2和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還能進(jìn)一步促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的再生，維持局部組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[35,28]。有研究證實(shí)，HIF-1α、Angpt1和 VEGF不僅與血管再生有關(guān)，且可直接參與骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程[36,20,5]。巨噬細(xì)胞也是血管再生所必須的，它可通過(guò)分泌一些血管再生因子促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)血管形成[44]。剔除巨噬細(xì)胞小鼠其血管再生水平顯著降低，骨骼肌損傷修復(fù)能力受損[13]。但對(duì)于巨噬細(xì)胞剔除如何影響挫傷骨骼肌再生過(guò)程中血管再生卻鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞剔除可顯著提高傷后第14 d HIF-1α和Angpt1表達(dá)。HIF-1α是低氧環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生的關(guān)鍵因子，其高水平表達(dá)提示，損傷處氧氣供應(yīng)不足，血管損傷未完成修復(fù)[36,22]。巨噬細(xì)胞剔除后，這兩種血管再生因子在損傷修復(fù)后期仍處于高表達(dá)狀態(tài)，提示，巨噬細(xì)胞剔除可能加劇損傷骨骼肌修復(fù)后期缺氧狀態(tài)、延長(zhǎng)了血管再生過(guò)程，進(jìn)而損害骨骼肌再生。同時(shí)，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞剔除后，在骨骼肌損傷修復(fù)后期仍有較高水平的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示，巨噬細(xì)胞剔除延遲了骨骼肌損傷修復(fù)進(jìn)程[39]。

3.3 巨噬細(xì)胞剔除抑制Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路損害骨骼肌再生

在骨骼肌損傷后的修復(fù)過(guò)程中，蛋白質(zhì)合成需大于分解，才能有效完成修復(fù)過(guò)程。Akt/mTOR信號(hào)通路是蛋白質(zhì)合成的主要信號(hào)通路，骨骼肌損傷后可能通過(guò)激活A(yù)kt/mTOR及其下游信號(hào)分子促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，加速骨骼肌損傷后修復(fù)過(guò)程[43,16]。與其他骨骼肌損傷模型相似，本研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌挫傷后第1 d即可激活A(yù)kt/mTOR及其下游信號(hào)分子p70S6K和4EBP1，提示骨骼肌損傷后，Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路被激活，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[19,8]。但巨噬細(xì)胞剔除是否影響挫傷骨骼肌修復(fù)過(guò)程中蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路的激活，卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞剔除后，挫傷骨骼肌中Akt/mTOR及其下游信號(hào)分子p70S6K和4EBP1與剔除對(duì)照組及損傷組相比均無(wú)顯著變化。提示，巨噬細(xì)胞剔除后損傷骨骼肌中Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路可能未被激活。因此，巨噬細(xì)胞剔除損害骨骼肌再生可能與巨噬細(xì)胞剔除后未能激活損傷骨骼肌中Akt/mTOR蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路有關(guān)。

4 結(jié)論

巨噬細(xì)胞在骨骼肌挫傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，剔除巨噬細(xì)胞可損害挫傷骨骼肌再生，其機(jī)制可能與肌再生因子表達(dá)下調(diào)、蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路未激活有關(guān)。

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Depletion of Macrophage Impairs Skeletal Muscle Regeneration by Inhibited the Expression of Muscle Regeneration Regulatory Factors and Akt / mTOR Protein Synthesis Signaling Pathway

LIU Xiao-guang1, XIAO Wei-hua1, CHEN Pei-jie1, ZHAO Lin-lin1, ZENG Zhi-gang1,2, ZHOU Yong-zhan1, ZHENG Li-fang1

1.Shanghai University of Sport, Shanghai 200438, China; 2.Jinggangshan University, Ji’an 343009, China

Objective: The purpose of this study is to explore the relationship between macrophage and muscle regeneration regulatory factors and Akt/mTOR signaling pathway, in order to investigate the role and mechanism of macrophages in the regeneration of injured skeletal muscle. Methods: Eighty C57BL/6 mice were randomly divided into muscle contusion (S, n=32), muscle contusion+ macrophages depleted (T, n=32), control (SCon, n=8), and macrophages depleted control groups (TCon, n=8). Their outer layer of the gastrocnemius muscles were harvested at the time points of 1, 3, 7 and 14d post-injury. The changes of skeletal muscle morphology were assessed by hematoxylin and eosin (HE) stains. The gene and protein expression was analyzed by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blotting (WB). Results: 1) The HE results showed that skeletal muscle fibers were significantly impaired and the injured fibers had almost degenerated at 1d and 3d post-injury in both S and T groups. At 7d after injury, the damaged muscle area in the group S had been replaced mostly by newly formed muscle fibers, whereas numerous necrotic myofibers and inflammatory cells dominated the injured muscle regions of group T. In addition, a large number of regenerated muscle fibers were observed at 14d after injury in the group T. 2) The Myogenic Differentiation Antigen (MyoD) and myogenin mRNA increased significantly post-injury (p<0.01). As compared to the S group, macrophage depletion significantly inhibited MyoD mRNA level and increased myogenin mRNA level in the group T post-injury (p<0.05). 3) The regulatory factors of muscle regeneration (except mechano growth factor, MGF) mRNA increased significantly in the group S post-injury. However, compared with group S, the expression of regulatory factors of muscle regeneration of T group was significantly down regulated. 4) Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) and angiopoietin1 (Angpt1) mRNA increased significantly post-injury in group S. Compared with group S, HIF-1 and Angpt1 in T group were significantly up-regulated in the later stage of muscle regeneration. 5) WB analysis showed that p-Akt/Akt, p-mTOR/mTOR, p-p70S6K/p70S6k and p-4EBP1/4EBP1 increased significantly post-injury in group S. However, there were no significantly change in the expression of p-Akt/Akt, p-mTOR/mTOR, p-p70S6K/p70S6k and p-4EBP1/4EBP1 in the group T after injury. Conclusion: Macrophages play important roles in muscle regeneration after injury. Macrophage depletion impairs muscle regeneration and that the inhibition of muscle regeneration regulatory factors and Akt/mTOR pathway may involve in the process.

1000-677X(2018)03-0056-09

10.16469/j.css.201803006

G804.7

Ａ

2017-10-10；

2018-02-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31300975, 31271273); 上海市人類運(yùn)動(dòng)能力開(kāi)發(fā)與保障重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(11DZ2261100)。

劉曉光,男,在讀博士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)健康促進(jìn)的生物學(xué)機(jī)制,E-mail:xiaoguangliu2008@126.com;肖衛(wèi)華,男,博士,副教授,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)健康促進(jìn)的生物學(xué)機(jī)制,E-mail: xiaoweihua@sus.edu.cn; 陳佩杰,男,博士,教授,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)免疫與運(yùn)動(dòng)健康促進(jìn),E-mail:chenpeijie@sus.edu.cn。