姚 瑤，　胡　蝶，　鄔敏辰， 葉慧華

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122）

手性環(huán)氧化物和鄰二醇是一類合成手性化合物的重要砌塊，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、精細化工材料等的合成，如β-3腎上腺素受體激動劑、南部松小蠹誘劑和α-甜沒藥醇等的合成[1]。環(huán)氧化物水解酶 （epoxide hydrolase，EH，EC 3.3.2.3） 能選擇性水解環(huán)氧化物生成相應(yīng)的鄰二醇[2]，例如，其水解外消旋環(huán)氧苯乙烷（（R，S）-SO） 可產(chǎn)生（R）-或（S）-苯基乙二醇（PED），該產(chǎn)物是液晶材料中不可缺少的手性添加劑，也是合成許多光學活性藥物和農(nóng)藥的重要手性中間體。已發(fā)現(xiàn)的一些來源于動物、植物和微生物的EHs具有良好的對映選擇性和區(qū)域選擇性[3-4]。目前，對EH的研究主要集中在動力學拆分消旋體環(huán)氧化物制備手性環(huán)氧化物和鄰二醇，但其生成1，2-二醇的對映體過量值（e.e.值）普遍較低，且最大理論產(chǎn)率為50%。如Aspergillus niger LCP 52 ANEH和Cupriavidus metallidurans-CH34 CMEH 動力學拆分外消旋（R，S）-SO 獲得（R）-PED的 e.e.值分別為56%和51%[5-6]。

對映體會聚 （enantioconvergence）是指將2種構(gòu)型的外消旋底物同時轉(zhuǎn)化成一種構(gòu)型的產(chǎn)物，發(fā)生對映體會聚的水解反應(yīng)[7]，其產(chǎn)物的最大理論產(chǎn)率為100%。許建和課題組從綠豆（Vigna radiata）中成功克隆出 2種 EHs基因 Vreh1[8]和 Vreh2[9]，并實現(xiàn)其在大腸桿菌 （Escherichia coli）中的異源表達，獲得的重組酶均能對映歸一性水解對硝基苯基環(huán)氧乙烷生成 （R）-對硝基苯基乙二醇，當轉(zhuǎn)化率為100%時，產(chǎn)物對映體過量e.e.值分別為70%和84.8%。本研究中通過對植物來源的EH進行基因多序列比對，設(shè)計2條簡并引物，采用RT-PCR和作者所在研究室建立的側(cè)翼未知DNA序列擴增技術(shù)THSO-PCR，克隆了一種新型綠豆EH的基因（Vreh3），并將其在 E.coli BL21（DE3） 中表達，利用該酶水解（R，S）-SO 制備（R）-PED。

1　材料與方法

1.1　菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

E.coli JM109、BL21 （DE3） 和表達質(zhì)粒 pET-28a（+）購自Novagen公司；克隆質(zhì)粒pUCm-T購自上海Sangon公司；LB培養(yǎng)基：0.5 g/dL酵母提取物、1 g/dL蛋白胨和1 g/dL NaCl（固體培養(yǎng)基添加2 g/dL瓊脂粉），pH 7.2。

1.2　主要試劑和儀器

綠豆，購自超市；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒，購自上海Sangon公司；Ex Taq和rTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒，均購自大連 TaKaRa公司；（R，S）-SO 和（S）-PED，購自上海薩恩化學技術(shù)有限公司。氣相色譜儀GC-2010，購自日本Shimadzu公司產(chǎn)品；手性氣相色譜柱CYCLOSIL-B（30 m×0.25 mm×0.25 μm），購自美國Agilent科技公司產(chǎn)品。

1.3　綠豆總RNA及基因組DNA提取

選取飽滿的綠豆種子置于培養(yǎng)皿中，加入少許去離子水覆蓋培養(yǎng)皿底層，于37℃培養(yǎng)箱中孵育12 h，取發(fā)芽綠豆胚芽，使用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取綠豆總RNA。采用簡化CTAB法[10]提取綠豆基因組DNA。

1.4　PCR引物的設(shè)計

將 Vignaradiata（ADP68585）、Glycinemax（NP_001238563） 和 Phaseolus vulgaris（XP_00714 7002）等21條來源于植物的EH氨基酸序列進行比對，在近N端和C端區(qū)域各選取一段保守序列（MHVAEKG） 和（AHFNNQ），分別對應(yīng)其設(shè)計簡并引物VrEH-F1和VrEH-R1，用于Vreh3基因部分cDNA序列的擴增；根據(jù)上述引物擴增獲得的cDNA序列，在近其N端和C端非保守區(qū)分別設(shè)計特異下游引物VrEH-R2和特異上游引物VrEH-F2，用于Vreh3基因5′端DNA和3′端cDNA序列的擴增。根據(jù)獲得的 Vreh3基因 3′端 cDNA和 5′端 DNA序列，設(shè)計上下游引物VrEH-F和VrEH-R，用于克隆Vreh3基因編碼區(qū)DNA和cDNA序列。T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列HSO-T和引物HSO-F參照胡蝶[11]等所述方法合成。除試劑盒內(nèi)引物，其余引物和HSO-T均由上海Sangon公司合成，見表1。

表1　PCR擴增引物和T-發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列Table 1　Primers and T-hairpin structure sequences for PCR amplification

1.5　Vreh3基因序列的擴增

1.5.1Vreh3基因3′端cDNA序列的擴增以綠豆總RNA為模板，Oligo dT-AP為引物，按照TaKaRa RNA PCR Kit（Ver.3.0）說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。以該鏈為模板，VrEH-F1和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR擴增。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，VrEH-F1和VrEH-R1為引物進行第二輪PCR擴增獲得Vreh3基因部分cDNA片段，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收目的條帶，連接pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)藍白斑篩選后，送上海Sangon測序。然后，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，VrEH-F2和M13 Primer M4為引物進行第二輪PCR擴增，獲得部分cDNA片段。合并2次第二輪PCR擴增的cDNA片段獲得Vreh3基因3′端cDNA序列。

1.5.2Vreh3基因5′端DNA序列的擴增參考胡蝶[11]等的 THSO-PCR技術(shù)擴增 Vreh3基因 5′端DNA。以HSO-T發(fā)夾結(jié)構(gòu)與酶切修飾后綠豆基因組DNA的連接產(chǎn)物為模板，HSO-F與VrEH-R2為引物進行PCR擴增獲得Vreh3基因5′端DNA序列。1.5.3Vreh3編碼區(qū)DNA和cDNA序列的擴增以綠豆基因組DNA為模板，VrEH-R和VrEH-F為引物進行PCR擴增獲得Vreh3基因編碼區(qū)DNA序列。以逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板，以VrEH-F和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR；以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，VrEH-F和VrEH-R為引物進行第二輪PCR：94℃ 3 min，30個循環(huán)（94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s），72 ℃ 10 min，獲得 Vreh3基因編碼區(qū)cDNA序列，PCR產(chǎn)物回收后與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-Vreh3。

1.6　生物信息學分析

利 用 NCBI ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析 Vreh3開放閱讀框；BDGP（http：//www.fruitfly.org/index.html）預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始 位 點 ；PLACE （http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）預(yù)測順式調(diào)控作用元件；ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/） 工具分析 VrEH3理化性質(zhì)；DNAMAN 6.0和ClustalW2軟件用于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的分析。

1.7　Vreh3在 E.coli BL21（DE3）中的表達

以cDNA第一鏈為模板，以VrEH-F和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR；以該輪PCR產(chǎn)物為模板，VrEH-F和VrEH-R為引物進行第二輪PCR獲得Vreh3基因編碼區(qū)cDNA序列，產(chǎn)物回收后與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-Vreh3。

用Nde I和Xho I雙酶切pUCm-T-Vreh3，割膠回收目的基因Vreh3，與經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a（+） 連接，獲得重組表達質(zhì)粒 pET-28a（+）-Vreh3，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），獲得工程菌命名為E.coli BL21/pET-28a（+）-Vreh3。在 IPTG終濃度 0.15 mmol/L，16℃誘導表達重組VrEH3。100 mL誘導發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心收集菌體，用5 mL磷酸鉀緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0） 懸浮，用于 SDS-PAGE分析及活性測定。不含目的基因的pET-28a（+）轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）作為空白對照，命名為E.coli/pET-28a（+）。

1.8　氣相色譜分析及計算

樣品分析采用氣相色譜儀GC-2010、手性氣相色譜柱CYCLOSIL-B和氫火焰離子化檢測器。進樣口和檢測器溫度均為250℃；初始柱溫100℃，以5℃/min升溫至210℃；載氣為氮氣，流速3.0 mL/min，分流比 1∶50。在此檢測條件下，正己醇、（R）-SO、（S）-SO、（S）-PED 和 （R）-PED 的保留時間分別為3.738、6.368、6.492、17.437 min 和 17.574 min。 （R）-PED 摩爾產(chǎn)率 =（S/RS0） × 100%，e.e.=[（S-R）/（S+R）]× 100%； 其中：S和 R 分別代表 （S）-和 （R）-PED的最終摩爾濃度，RS0代表（R，S）-SO的初始摩爾濃度。

1.9　EH活性的測定

在 2 mL EP管中加入 800 μL菌液和 150 μL磷酸鉀緩沖液 （100 mmol/L，pH 7.0），25 ℃預(yù)熱 5 min；加入 50 μL（R，S）-SO（200 mmol/L），25 ℃反應(yīng)3.5 h后8 000 r/min離心2 min， 取100 μL上清液于1 mL乙酸乙酯 （含1 mmol/L的正己醇作為內(nèi)標），激烈震蕩，8 000 r/min離心2 min，吸取上層有機相，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，過0.22 μm有機膜，按1.8方法進行氣相色譜分析。

2　結(jié)果與分析

2.1 Vreh3基因序列的擴增

2.1.1Vreh3基因3′端cDNA序列的擴增據(jù)1.5所述，以VrEH-F1和M13 Primer M4為引物進行PCR 獲得約 1 800 bp的條帶（圖 1（a） 泳道 1）；以VrEH-F1和VrEH-R1為引物，第二輪PCR產(chǎn)物獲得約 850 bp條帶（圖 1（a）泳道 2）；以 VrEH-F2和M13 Primer M4為引物，第二輪PCR產(chǎn)物獲得約400 bp、500 bp 2 條清晰的條帶（圖 1（a） 泳道 3），測序結(jié)果顯示約500 bp處條帶為Vreh3基因序列。合并2次第二輪PCR產(chǎn)物獲得的序列，獲得的Vreh3基因3′端cDNA序列長1 080 bp。

2.1.2Vreh3基因5′端DNA序列的擴增不同限制性內(nèi)切酶酶切基因組構(gòu)建了3個PCR模板庫，以HSO-F和VrEH-R2為引物分別進行PCR擴增，獲得約 2 100 bp、220 bp 和 220 bp 的條帶（圖 1（b））。測序結(jié)果顯示3個條帶均為Vreh3基因5′端DNA序列。

2.1.3Vreh3基因編碼區(qū)DNA和cDNA序列的擴增用DNAMAM軟件分析3′端cDNA序列確定終止子為TAA，設(shè)計特異性下游引物VrEH-R；用BestORF分析5′端DNA序列確定起始密碼子ATG的位置，設(shè)計特異性上游引物VrEH-F。以綠豆總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板，VrEH-F和VrEH-R為引物，經(jīng)二輪PCR擴增獲得Vreh3基因的編碼區(qū)cDNA長約960 bp（圖1（c）泳道1）。以綠豆基因組DNA為模板，VrEH-F和VrEH-R為引物，經(jīng)PCR擴增獲得Vreh3基因的編碼區(qū)DNA長約1 200 bp的序列（圖1（c）泳道2）。測序獲得編碼區(qū)cDNA序列為 957 bp（GenBank登錄號為KR013755），編碼區(qū)DNA序列為1 178 bp。

2.2　Vreh3的核酸序列分析

用DNAMAN合并擴增獲得Vreh3序列，編碼區(qū)DNA序列包含2個142 bp和79 bp的內(nèi)含子和957 bp的開放閱讀框，編碼318個氨基酸。利用BDGP預(yù)測，位于起始密碼子ATG上游的94 bp處的鳥嘌呤（G）為轉(zhuǎn)錄起始位點；利用PLACE分析在轉(zhuǎn)錄起始位點上游22 bp處發(fā)現(xiàn)真核生物中典型的TATA-box，在終止密碼子下游360 bp處發(fā)現(xiàn)AATAATA的多聚腺苷酸加尾信號，分析結(jié)果表明Vreh3的5′-非翻譯區(qū)和 3′非編碼區(qū)長分別為 94 bp 和 446 bp（圖 2）。

2.3　VrEH3氨基酸序列分析

利用ProtParam分析VrEH3的理論相對分子質(zhì)量和等電點分別為36.2×103和5.59。通過將VrEH3與不同來源的5種EH進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)VrEH3 與來源 于 Glycine max（NP_001238563）、Glycine max（NP_001240943）、Vigna radiata（ADP685 85，VrEH1）[8]、Phaseolus vulgaris （XP_007147002）和Solanum lycopersicum （XP_004230258）的EH氨基酸序列同源性分別為80.8%、73.9%、72.4%、71.6%和66.0%（圖3）。根據(jù)文獻報道分析，VrEH3保守的Asp101、Asp262和 His297組成催化三聯(lián)體，Tyr150和Tyr232為質(zhì)子供體。

圖1　Vreh3序列擴增的PCR產(chǎn)物Fig.1　PCR products of the amplification of Vreh3

圖2　Vreh3的核酸序列分析Fig.2　Analysis of nucleotide sequence of Vreh3

2.4　Vreh3在E.coli中的表達

構(gòu)建的重組菌VrEH3按1.7方法進行誘導表達。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，VrEH3全細胞在約30.1×103處有特異性目的條帶（圖 4，泳道 2），小于VrEH1（約 41.0×103）[8]和 VrEH2（約 36.0×103）[9]的相對分子量；E.coli/pET-28a（+）在該處無特異性條帶（圖 4泳道 1），表明 VrEH3成功在 E.coli BL21（DE3）中表達。

圖4　重組大腸桿菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of the expressed products by recombinant E.coli

2.5　VrEH3 對映歸一性水解（R，S）-SO

按1.9所述方法，誘導后的工程菌E.coli/Vreh3 對10 mmol/L（R，S）-SO 進行水解反應(yīng)，反應(yīng)進程如圖5。結(jié)果表明，VrEH3優(yōu)先水解（S）-SO，而對（R）-SO 反應(yīng)較慢。 在 0～2 h內(nèi)，（S）-SO 的摩爾濃度迅速降低，（R）-SO的e.e.值迅速上升，同時產(chǎn)物e.e.值一直保持在95%以上。當反應(yīng)3.5 h時，（S）-SO 全部水解，（R）-SO 的 e.e.值＞99%，得率為20.6%；產(chǎn)物（R）-PED 的 e.e.值為 94.7%，得率為79.4%，高于綠豆粉水解（R，S）-SO 生成（R）-PED的最大 e.e.值（82.7%） 和最高得率（48.2%）[12]。目前，大部分報道的重組表達EHs，如A.niger ANEH[5]，Sphingomonassp.HXN-200SpEH[13]和Agrobacterium radiobacter AD1[14]EchA等均具有較高的對映選擇性，通過酶動力學拆分的制備（R）-或（S）-SO，其 e.e.值＞99%，得率＜50%，但（R）-或（S）-PED的e.e.值并不高。少部分EHs，如Caulobacte crescentus CcEH[15]，Solanum tuberosum StEH[16]和 綠豆VrEH1[8]和VrEH2[9]等具有對映體歸一性，其中CcEH 和 StEH 歸一性水解（R，S）-SO 生成（R）-PED的e.e.值分別為90%和86%，均小于VrEH3獲得（R）-PED 的 e.e.值（94.7%）。 該結(jié)果說明 VrEH3 不僅具有較好的對映選擇性，且具有良好的對映體歸一性（如圖6），有著廣闊的應(yīng)用前景。

圖 5　對映歸一性水解（R，S）-SO的時間進程Fig.5　Time course of enantioconvergent hydrolysis of（R，S）-SO

圖6　VrEH3催化水解（R，S）-SO的反應(yīng)Fig.6　Catalytic hydrolysis reaction of （R，S）-SO by VrEH3

3　結(jié)　語

本研究運用不同PCR技術(shù)，從綠豆中獲得了一種新型環(huán)氧化物水解酶基因Vreh3，并成功實現(xiàn)了在E.coli中的異源表達。初步測定重組VrEH3活性，發(fā)現(xiàn)VrEH3對映歸一性水解（R，S）-SO可同時獲得高對映體純的（R）-SO（e.e.值＞99%） 和（R）-PED（e.e.值為94.7%）。VrEH3可作為一個良好的生物催化劑，對于制備高純度的手性環(huán)氧化物或鄰二醇具有巨大的潛在應(yīng)用價值，其催化機理及應(yīng)用需進一步研究。

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