祁愛蓉 傅博 劉小燕 李順民 文善適 鄭平 陳劍平

摘 ? 要：目的 ?建立測定雷公藤制劑中的6種成分（雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素及雷公藤內(nèi)酯甲）的高效液相色譜方法。方法 ?采用Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以10 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈為流動相梯度洗脫，流速為0.75 ml/min，檢測波長為225 nm，柱溫為25 ℃。結(jié)果 ?6種成分的進(jìn)樣濃度為0.1～156.25 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，平均回收率為98.5%（RSD=1.9%）、99.2%（RSD=1.9%）、99.5%（RSD=1.5%）、98.7%（RSD=1.2%）、98.8%（RSD=1.6%）、99.0%（RSD=1.7%）。結(jié)論 ?所建立的測定方法操作方便，重復(fù)性強，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于雷公藤及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量分析;不同雷公藤制劑中6個成分的含量存在差異。

關(guān)鍵詞：雷公藤制劑;雷公藤化學(xué)成分;反相高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.05.023

文章編號：1006-1959（2018）05-0070-04

Study on the Content of Six Components in Different Tripterygium Wilfordii Preparations

QI Ai-rong1，F(xiàn)U Bo1，LIU Xiao-yan1，LI Shun-min1，WEN Shan-shi2，ZHENG Ping3，

CHEN Jian-ping3

（1.4th College of Clinical Medicine，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Shenzhen 518033，Guangdong，China;

2.Nanao People's Hospital，Dapeng New District，Shenzhen 518121，Guangdong，China;

3.Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparations，Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518033，Guangdong，China）

Abstract：Objective ?To establish a high performance liquid chromatography method for the determination of 6 components in Tripterygium wilfordii（Triptolide，triptolide，lycopolide，Tripterygium，tripterin，and triptolide a）.Methods ?A Agilent TC-C18 column of （250 mm×4.6 mm，5 μm）was used.The mobile phase gradient elution was 10 mmol/L ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile.The flow rate was 0.75 ml/min，the detection wavelength was 225 nm，and the column temperature was 25 ℃.Results ?The injection concentration of the six components was 0.1～156.25 μg/ml and the peak area integral value was linear，the average recovery rate was 98.5%（RSD=1.9%），99.2%（RSD=1.9%），99.5%（RSD=1.5%），98.7%（RSD=1.2%），98.8%（RSD=1.6%），99.0%（RSD=1.7%）.Conclusion ?The established method is convenient， reproducible and accurate.It can be used for the quality analysis of Tripterygium wilfordii and its related products，and the content of 6 components in different Tripterygium wilfordii preparations is different.

Key words：Tripterygium wilfordii preparation;Chemical constituents of Tripterygium wilfordii;Reversed phase high performance liquid chromatography

中藥雷公藤（tripterygium wilfordii）屬于衛(wèi)矛科雷公藤屬藤本植物，主要分布于中國東部及南部，具有抗炎、抑制免疫、抗腫瘤等作用，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征和癌癥等多種疾病[1，2]。目前雷公藤制劑是治療慢性腎炎是最為有效的中成藥之一，包括火把花根片、雷公藤多苷片、昆仙膠囊等。但雷公藤制劑投入臨床使用以來，相關(guān)不良反應(yīng)仍時有報道，主要存在于消化道系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚黏膜、血液系統(tǒng)，主要原因在于雷公藤所含的主要活性成分二萜類、生物堿類、三萜類在產(chǎn)生毒性的同時又發(fā)揮著藥理作用，如雷公藤甲素是雷公藤中活性最高的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，同時也是雷公藤引起毒副作用的主要成分[3，4]。此外雷公藤通常以單一成分作為提取指標(biāo)，不能反映雷公藤提取物的整體情況，加上雷公藤提取工藝多樣化，各工藝質(zhì)量存在差異化，無法判定其科學(xué)性、合理性、可行性、優(yōu)劣性。故存在著臨床用藥安全性的威脅。臨床實踐證明：上述單體成分相同但含量不同的雷公藤制劑在治療作用及副作用發(fā)生率方面存在明顯差異。為探討其內(nèi)在質(zhì)量，確保臨床療效穩(wěn)定可靠，本實驗基于現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上[5-8]，采用高效液相色譜（HPLC）法測定雷公藤多苷片中6種成分即雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素及雷公藤內(nèi)酯甲的含量，為評價雷公藤制劑的質(zhì)量提供參考手段。

1儀器與試藥

1.1儀器 ?島津LC-20AT高效液相色譜儀（上海納锘儀器有限公司），HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司），AUW220D電子天平（日本島津公司），HKD1002VS型數(shù)控超聲波清洗器（深圳市和科達(dá)超聲設(shè)備有限公司），Aquelix 5實驗室純水機(jī)（美國默克密理博公司）。

1.2試藥 ?雷公藤多苷片（江蘇美通制藥有限公司，批號為20160701，160401）;昆明山海棠片（云南植物藥業(yè)有限公司，批號為20150508-025，20160302）;昆仙膠囊（廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司，批號為D31001）;雷公藤甲素（批號150713，純度不少于98%）、雷公藤內(nèi)酯酮（150805，純度不少于98%）、雷酚內(nèi)酯（150826，純度不少于98%）、雷公藤次堿（150614，純度不少于98%）、雷公藤紅素（150627，純度不少于98%）、雷公藤內(nèi)酯甲（160107，純度不少于98%）均購于四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、三氯甲烷、乙酸銨為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 ?色譜柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：流動相A為10 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～15 min，90%A→65%A;15～22 min，65%A→65%A;22～30 min，65%A→45%A;30～35 min，45%A;35～40 min，45%A→40%A;40～70 min，40%A→15%A;70～75 min，15%A→5%A;75～80 min，5%A→90%A）;流速0.75 ml/min;進(jìn)樣量20 μl;檢測波長：225 nm;柱溫：25 ℃。色譜圖見圖1。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液 ?分別取雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為1 mg/ml、1 mg/ml、1 mg/ml、5 mg/ml、1 mg/ml、1 mg/ml的單個對照品貯備液。

2.2.2供試品溶液 ?取樣品適量，研細(xì)，精密稱取藥粉約0.15 g，置25 ml量瓶中，用氯仿溶解后定容。精密移取5 ml，加于硅膠層析柱（100～200目，6 g，內(nèi)徑為10～15 mm），用氯仿-甲醇（97∶3）洗脫3次，每次25 ml，收集洗脫液，蒸干，殘渣加2 ml甲醇使溶解，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 ?分別精密吸取以上對照品貯備液適量，混勻，加甲醇逐級稀釋，分別制得質(zhì)量濃度在0.09～156.5 μg/ml 6個濃度的對照品溶液，分別吸取20 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果表明，各成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

2.3.2精密度試驗 ?精密吸取混合對照品溶液20 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算峰面積。結(jié)果雷公藤甲素峰面積RSD=0.87%（n=6）;雷公藤內(nèi)酯酮峰面積RSD=0.43%（n=6）;雷酚內(nèi)酯峰面積RSD=0.03%（n=6）;雷公藤次堿峰面積RSD=0.08%（n=6）;雷公藤紅素峰面積RSD=0.35%（n=6）;雷公藤內(nèi)酯甲峰面積RSD=0.98%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗 ?精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，分別進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積。結(jié)果：雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲的峰面積RSD值分別為1.2%、1.5%、1.7%、1.8%、1.4%、1.3%（n=6）。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性試驗 ?稱取同一批樣品（批號：160401）6份，依法制備供試品溶液，按擬定色譜條件依次進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果雷公藤甲素平均峰面積RSD=1.01%（n=6）;雷公藤內(nèi)酯酮平均峰面積RSD=1.72%（n=6）;雷酚內(nèi)酯平均峰面積RSD=0.69%（n=6）;雷公藤次堿平均峰面積RSD=0.93%（n=6）;雷公藤紅素平均峰面積RSD=1.22%（n=6）;雷公藤內(nèi)酯甲平均峰面積RSD=1.77%（n=6）。表明本法重復(fù)性好。

2.3.5加樣回收試驗 ?取6份批號為160401的雷公藤多苷片約0.075 g，精密稱定;分別精密加入與供試品中各成分相同含量的6個對照品，按2.2項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按擬定色譜條件進(jìn)行分析，計算回收率。結(jié)果見表2。

2.4樣品含量測定 ?取市售臨床常用的雷公藤產(chǎn)品，按擬訂色譜條件測定樣品中的6個成分的含量。結(jié)果見表3。

3討論

本試驗在流動相優(yōu)化中選用乙腈為有機(jī)相（A）分離效果較好，保留時間適中，色譜信息豐富。同時發(fā)現(xiàn)在堿性條件下，可以更好的分離不同色譜峰，故為保護(hù)色譜柱選用低濃度的乙酸銨（10 mmol/ml）作為流動相（B）（0～15 min，10%B→35%B;15～22 min，35%B→35%B;22～30 min，35%B→55%B;30～35 min，55%B;35～40 min，55%B→60%B;40～70min，60%B→85%B;70～75 min，85%B→95%B;75～80 min，95%B→10%B）進(jìn)行梯度洗脫。選用梯度洗脫的色譜條件，可更好的分離不同的色譜峰，使實驗數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。實驗中曾采用：①WondaSil-C18（4.6 mm×250mm，5 μm）;②Sapphire-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;③Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行比較，但實驗圖譜顯示①和②的分離效果不好，后來選用Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)基線和柱壓平穩(wěn)，且測出來的色譜峰值、分離度等指標(biāo)值均較為理想。雷公藤多苷的化學(xué)組成較為復(fù)雜，雖經(jīng)上柱除雜等前處理，色譜分析所得圖譜上仍顯示樣品液中眾多化合物的存在，分離起來有一定的困難，故現(xiàn)有文獻(xiàn)基本對其進(jìn)行1個或2個組分的測定。同時，通過對樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到處理后樣品較未處理樣品，目標(biāo)物沒有減少，而且目標(biāo)峰更為清晰。

雷公藤制劑在腎臟病治療方面，療效確切，作用途徑多樣化，在中醫(yī)藥防治腎臟病方面，臨床優(yōu)勢明顯，但其毒副作用也不容忽視，主要表現(xiàn)在消化、泌尿、生殖、造血系統(tǒng)及皮膚等多系統(tǒng)方面，可能引起多器官的損害，有效成份與毒性成分較難區(qū)別[9，10]。本次研究結(jié)果表明：不同廠家生產(chǎn)的雷公藤多苷提取物化學(xué)組成存在明顯的差異。如：雷公藤紅素和雷公藤甲素最高和最低含量之間相差10倍，其它組分的含量差異也較大。不同廠家的雷公藤制劑成分含量有一定差異，同一廠家不同批號的雷公藤制劑之間成分含量也有一定差異。分析其原因，除與雷公藤藥材本身的來源有關(guān)外，也與制作工藝、條件、劑型的不同有必然的關(guān)系。但如何質(zhì)控仍在探索階段[11]。

雷公藤甲素是該類藥物的主要有效成分，但毒性也很大，近年來有關(guān)其結(jié)構(gòu)修飾等減毒研究為其熱點，如雷公藤甲素脂質(zhì)體、雷公藤紅素固體脂質(zhì)納米粒、雷公藤紅素緩釋滴丸[12-14]等單體成分緩釋制劑等。以雷公藤甲素為例，正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗的新藥（5R）-5-羥基雷公藤甲素就是以雷公藤甲素為母體并修飾而成，其具有顯著的體內(nèi)抗炎作用和免疫抑制活性，未見受試者體內(nèi)有藥物累積現(xiàn)象，減毒增效作用顯著[15]。本試驗對臨床上常用的雷公藤多苷片、昆明山海棠片、昆仙膠囊，采用HPLC方法測定其主要成分：雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲的含量，為下一步研究其不同單體組合對體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞的生殖毒性作用，并在配伍中藥辨證治療后分析其毒副作用的情況，從體內(nèi)和體外實驗闡述其增效減毒的效應(yīng)和作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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