孫淑娜 張小平 魏海峰 周曙杰 梁晨希 吳國境 韓 旭 張曉杰

龍膽瀉肝湯是臨床治療銀屑病的傳統(tǒng)經(jīng)方[1]，但目前對其在治療中的分子機(jī)制了解甚少。銀屑病皮損處病理特征之一包括表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生[2]。本研究將利用人表皮細(xì)胞HaCaT作為研究模型，探討龍膽瀉肝湯對HaCaT細(xì)胞增殖的影響并分析其作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示龍膽瀉肝湯的作用機(jī)制以及開發(fā)治療銀屑病的新靶點奠定理論基礎(chǔ)和提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 永生化人表皮形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基：美國Gibco公司；DAPI、BrdU、MTT和PI：Sigma公司。抗BrdU一抗：Sigma公司；Western blot用一抗和siRNAs：Santa cruz公司；DAPI，RIPA裂解液。Trizol，Lipofectamine 2000：美國Thermo公司。TRITC(羅丹明) 與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗：中衫金橋公司。RNaseA和Light Cycler 480 SYBR Green I Master：ROCHE公司。cNDA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技有限公司。PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 膽瀉肝湯藥液制備 龍膽草6 g，黃芩9 g，山梔9 g，澤瀉12 g，車前子9 g，生地黃20 g，當(dāng)歸8 g，柴胡10 g，甘草6 g。將上述中藥濃縮成1 mL相當(dāng)于1.5 g原中藥材的藥液，過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?xì)胞培養(yǎng)時稀釋到相應(yīng)終濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞株，隔天換液。取狀態(tài)較好的對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞進(jìn)行實驗。龍膽瀉肝湯藥物處理組使用含有終濃度20～100 μg/mL藥液的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 使用0.1%胰酶消化收集細(xì)胞，使用75%乙醇-20℃固定過夜。待檢測時使用PBS洗滌細(xì)胞后，加入PI和RNaseA至終濃度50 μg/mL，避光靜置30 min。流式細(xì)胞儀記錄激發(fā)波長488 nm處的紅色熒光，收集數(shù)據(jù)。實驗重復(fù)三次。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將HaCaT細(xì)胞株接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，收集細(xì)胞前使用含MTT 1 mg/mL的培養(yǎng)基37℃繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。棄上清后加入二甲基亞砜(DMSO)震蕩混勻，37℃避光放置20 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長狀態(tài)下測其吸光度值。實驗每組設(shè)6個重復(fù)孔，實驗重復(fù)三次。

1.2.5 Western blot 待收集細(xì)胞使用RIPA裂解液裂解提取蛋白，使用BCA法蛋白定量，取40 μg變性后樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBS封閉，4℃一抗孵育過夜，37℃二抗孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光，膠片曝光，顯影定影。所有實驗重復(fù)三次。

1.2.6 BrdU摻入檢測 使用含50 μM BrdU的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞20 min，PBS洗滌后，使用免疫染色固定液固定，加入2N鹽酸37℃變性30 min，0.1 M硼酸鈉中和2次，含Triton-X 100 0.5%的PBS處理15 min，5% BSA室溫封閉1 h，BrdU一抗4℃孵育過夜，加入TRITC二抗37℃ 處理1 h，DPAI染核，熒光顯微鏡觀察。每組細(xì)胞隨機(jī)選擇3個視野，在高倍鏡(×200)計數(shù)每個視野100個HaCaT細(xì)胞中BrdU陽性細(xì)胞的比例，取3個視野的平均百分?jǐn)?shù)為判定結(jié)果，實驗重復(fù)三次。

1.2.7 Realtime PCR 將藥物處理的HaCaT細(xì)胞使用Trizol法裂解提取并參照說明書提取RNA和逆轉(zhuǎn)錄。Realtime PCR檢測：每個樣品設(shè)4個復(fù)孔，每復(fù)孔10 μL反應(yīng)體系，具體包括Light Cycler 480 SYBR Green I Master 5 μL、去離子水4.2 μL、cDNA 0.5 μL、引物0.3 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 3 min，95℃變性30 s，退火60℃ 30 s，延伸72度30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。實驗重復(fù)三次。引物序列qGAPDH-F：5'- CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3'，qGAPDH-R：5' GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT -3'；qCDK4-F：5′-ATGGCTACCTCTCGATATGAGC-3′, q CDK4-R：5′- CATTGGGGACTCTCACACTCT-3′；qCyclin D1-F：5′- GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′, qCyclin D1-R：5′- CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′。

1.2.8 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染siRNA 將細(xì)胞接種到6孔板，24 h后，參照說明，分別加入適量的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamin 2000和siRNA，混勻，室溫放置10 min。將配制好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中siRNA終濃度為50 nM。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0 軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)應(yīng)用t檢驗分析評價。

2 結(jié)果

2.1 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞的增殖 利用MTT檢測細(xì)胞增殖，實驗重復(fù)三次，結(jié)果一致，所示的有代表性的結(jié)果如圖1顯示，龍膽瀉肝湯處理72 h后，與對照組(未使用藥物處理組)相比，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，并且龍膽瀉肝湯對HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性增加。100 μg/mL的龍膽瀉肝湯處理的細(xì)胞，其OD值僅為對照細(xì)胞的17.4%。因此，該結(jié)果表明龍膽瀉肝湯能夠有效抑制銀屑病表皮細(xì)胞的增殖。

圖1 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞增殖。使用含0～100 μg/mL龍膽瀉肝湯藥液的DMEM培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)細(xì)胞72 h，收取細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測

2.2 龍膽瀉肝湯誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞停滯在G0/G1期 為明確龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們使用流式細(xì)胞術(shù)分析了龍膽瀉肝湯對HaCaT細(xì)胞周期的影響。實驗重復(fù)三次，結(jié)果一致，所示的有代表性的結(jié)果(圖2)，未處理的細(xì)胞各周期比例為：G1期細(xì)胞比例為51.98%，S期細(xì)胞比例為40.74%，G2/M期為7.28%。與對照細(xì)胞相比，使用100 μg/mL龍膽瀉肝湯處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞G1期比例上升至79.36%，S期細(xì)胞下降到17.03%，G2/M期下降到3.61%；相比對照細(xì)胞，龍膽瀉肝湯處理組細(xì)胞G1期比例明顯增加，上調(diào)了約28%，S期則下降了約23%。

圖2 龍膽瀉肝湯處理導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞G1期比例上調(diào)。藥物處理組細(xì)胞使用含100 μg/mL龍膽瀉肝湯藥液的DMEM培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，對照組使用含等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時間。培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。藥物組，100 μg/mL龍膽瀉肝湯藥液的DMEM；對照組， 含與藥物組龍膽瀉肝湯等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基

2.3 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞的DNA復(fù)制 隨后，我們進(jìn)行了BrdU摻入檢測以分析龍膽瀉肝湯對HaCaT細(xì)胞DNA復(fù)制的影響。實驗重復(fù)三次，結(jié)果一致，所示的有代表性的結(jié)果(圖3)，對照細(xì)胞組BrdU摻入陽性細(xì)胞比列約為(68.4±7.2)%， 100 μg/mL龍膽瀉肝湯處理細(xì)胞48 h后，BrdU摻入陽性細(xì)胞比例降低至(11.3±2.6)%，而兩者相比有顯著性差異。該結(jié)果表明龍膽瀉肝湯能夠有效抑制HaCaT細(xì)胞DNA復(fù)制。

圖3 龍膽瀉肝湯處理抑制HaCaT細(xì)胞DNA復(fù)制。藥物處理組細(xì)胞使用含龍膽瀉肝湯100 μg/mL藥液的DMEM培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，對照組使用含與龍膽瀉肝湯等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時間。48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行BrdU檢測。藥物組，100 μg/mL龍膽瀉肝湯藥液的DMEM；對照組，含與藥物組龍膽瀉肝湯等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基。

2.4 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞Rb蛋白磷酸化 Rb蛋白磷酸化可以解除Rb對E2F轉(zhuǎn)錄因子的抑制效應(yīng)，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。因此，我們使用Western blot實驗分析了龍膽瀉肝湯處理后HaCaT細(xì)胞Rb蛋白的磷酸化水平。實驗重復(fù)三次，結(jié)果一致，所示的有代表性的結(jié)果(圖4a)，使用100 μg/mL龍膽瀉肝湯處理細(xì)胞48 h后，盡管Rb蛋白總量沒有明顯變化，但Rb的蛋白的磷酸化(p-Rb)表達(dá)明顯下調(diào)。

為了明確Rb在龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞增殖中的作用。我們使用siRNA干擾Rb的表達(dá)。Western blot實驗結(jié)果顯示siRNA顯著抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)Rb蛋白表達(dá)(圖4b)。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示， siRNA能夠有效抑制龍膽瀉肝湯導(dǎo)致的HaCaT細(xì)胞G0/G1期阻滯(圖4c)。這些結(jié)果表明龍膽瀉肝湯能夠通過抑制Rb的磷酸化，促進(jìn)其對E2F的抑制作用，導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞G1期停滯。所有實驗重復(fù)三次，結(jié)果一致。

圖4 龍膽瀉肝湯處理導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞p-Rb蛋白表達(dá)下調(diào)。4a：龍膽瀉肝湯處理組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收取細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行Western blot。4b：轉(zhuǎn)染干擾Rb的siRNA (50 nM)或等量的陰性對照siRNA入HaCaT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后換含100 μg/mL清龍膽瀉肝湯或?qū)φ盏腄MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。4c：細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA并加入龍膽瀉肝湯處理48 h后(方法同圖4b)。藥物組，100 μg/mL龍膽瀉肝湯藥液的DMEM；對照組， 含與藥物組龍膽瀉肝湯等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基

2.5 龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞CDK4/Cyclin D1表達(dá) CDK4/Cyclin D在Rb磷酸化中發(fā)揮核心的作用。因此，我們分析了CDK4和Cyclin D1的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示龍膽瀉肝湯處理細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1和CDK4的表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)(圖5a)。為了進(jìn)一步明確龍膽瀉肝湯調(diào)控CDK4和Cyclin D1表達(dá)的分子機(jī)制，我們又使用Realtime PCR檢測了龍膽瀉肝湯處理后HaCaT細(xì)胞內(nèi)兩個基因mRNA的含量。結(jié)果顯示與對照組相比，龍膽瀉肝湯藥物處理組HaCaT細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1 mRNA含量較對照組明顯降低(圖5b)，而CDK4的mRNA沒有明顯改變(圖5b)。

圖5 龍膽瀉肝湯處理導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞CDK4和Cyclin D蛋白表達(dá)下調(diào)。龍膽瀉肝湯處理組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收取細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行Western blot(5a)和Realtime PCR(5b)。藥物組，100 μg/mL龍膽瀉肝湯藥液的DMEM；對照組， 含與藥物組龍膽瀉肝湯等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基

3 討論

銀屑病病程長，纏綿難愈，容易復(fù)發(fā)，大多伴隨終生，對患者的身心健康及日常生活都帶來極大傷害[3]。銀屑病給患者、家庭和整個社會帶來巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是皮膚科領(lǐng)域亟待解決的難題之一。傳統(tǒng)的中醫(yī)運用中醫(yī)辨證以及其特有的治療方法，在銀屑病治療上具有改善病情、延長緩解期、副作用小、遠(yuǎn)期療效好等特點，彰顯出了獨特的優(yōu)勢。龍膽瀉肝湯始載于《蘭室秘藏》一書，是臨床中常用方劑，由龍膽草、梔子、黃芩、車前子、澤瀉、木通、生地黃、當(dāng)歸、甘草組成，具有瀉肝膽實火，清下焦?jié)駸嶂π?。因木通在現(xiàn)代藥理研究中，明確有腎毒性，故后世在使用龍膽瀉肝湯治療疾病時，已經(jīng)不再使用木通，本次實驗也未納入。在銀屑病治療中，龍膽瀉肝湯也表現(xiàn)出較好的療效[4]，但對其作用的分子機(jī)制尚不清楚。

銀屑病皮損處特征包括表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和異常分化，淋巴細(xì)胞(絕大多數(shù)為T細(xì)胞)浸潤，以及真皮血管的改變[5]。我們的結(jié)果顯示龍膽瀉肝湯可顯著抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的增殖，降低DNA復(fù)制能力，誘導(dǎo)使其停滯在G0/G1期。角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)是表皮細(xì)胞的主要成分，對皮膚正常的結(jié)構(gòu)和功能維持有著重要的作用。KC的異常增殖和分化與多種角化性皮膚病及表皮腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。與其他炎癥性皮膚病相比，銀屑病最特征性的病理表現(xiàn)之一是表皮高度增殖(棘層肥厚)，顆粒細(xì)胞層缺失，表皮突規(guī)則地向下延伸，角質(zhì)層增厚(角化過度)和不完全的角質(zhì)形成細(xì)胞分化及成熟時間縮短(角化不全)，角質(zhì)層細(xì)胞異常堆積，形成鱗屑[3，6，7]。此外，大量研究也揭示了KC在銀屑病發(fā)生中的重要作用。鑒于銀屑病的臨床病理特征和發(fā)病特點，抑制KC過度增殖分化也是銀屑病治療的重要途徑之一。因此，我們的結(jié)果提示抑制細(xì)胞DNA復(fù)制、抑制細(xì)胞增殖是龍膽瀉肝湯治療銀屑病的重要機(jī)制之一。

E2F1能夠轉(zhuǎn)錄激活包括Cyclin E在內(nèi)的多種G1到S期轉(zhuǎn)換調(diào)控因子以及DNA復(fù)制相關(guān)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。而Rb能夠結(jié)合E2F1，使后者喪失轉(zhuǎn)錄激活功能。因此抑制Rb的功能是使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)行細(xì)胞增殖的關(guān)鍵[8]。CDK4激酶能夠磷酸化Rb蛋白，使其失活，釋放E2F1，促進(jìn)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換和增殖。Cyclin D家族蛋白能夠與CDK4結(jié)合并激活CDK4的活性[9]。本結(jié)果顯示，龍膽瀉肝湯可顯著抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)Rb蛋白的磷酸化水平，而利用siRNA干擾Rb能夠部分恢復(fù)龍膽瀉肝湯對HaCaT細(xì)胞DNA復(fù)制的功能。進(jìn)一步分析顯示龍膽瀉肝湯能夠下調(diào)HaCaT細(xì)胞內(nèi)CDK4和Cyclin D1的表達(dá)。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CDK4/Cyclin D在角質(zhì)形成細(xì)胞增殖中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，在銀屑病皮損中表達(dá)異常[10-12]。因此，我們的結(jié)果提示，龍膽瀉肝湯通過抑制CDK4/Cyclin D-Rb途徑而抑制表皮形成細(xì)胞的增殖，該途徑是龍膽瀉肝湯治療銀屑病的靶點之一。

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