全 燦，李紅梅

(中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029)

溯源性是通過具備證明文件的不間斷的校準(zhǔn)鏈，將測量結(jié)果與參照物聯(lián)系起來的特性，校準(zhǔn)鏈中的每項(xiàng)校準(zhǔn)都會引入測量不確定度[1]。中國計(jì)量科學(xué)研究院位于校準(zhǔn)鏈的頂端，簽署國際計(jì)量委員會互認(rèn)協(xié)議(CIPM mutual recognition arrangement, CIPM MRA) ，通過國際比對，證明其測量能力，為參考物質(zhì)賦值，為中間層級參考實(shí)驗(yàn)室測量結(jié)果提供溯源，從而為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評價的質(zhì)控品賦值提供溯源[2]。

參考測量程序經(jīng)過充分研究，其測量值的測量不確定度適合其預(yù)期用途，尤其用于評價測量相同量的其他測量程序的正確度。同位素稀釋質(zhì)譜法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS)作為具有最高計(jì)量學(xué)特性的基準(zhǔn)方法，用高豐度同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)，適用于可直接或用其衍生物進(jìn)行質(zhì)譜分析的測量，已廣泛應(yīng)用于臨床參考系統(tǒng)[3-4]。本文重點(diǎn)介紹了同位素稀釋質(zhì)譜基本原理、定量方式及其不確定度，結(jié)合檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會 (joint committee for traceability in laboratory medicine, JCTLM)參考系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫，分析其在臨床參考系統(tǒng)的應(yīng)用及最新進(jìn)展。

1 臨床檢測結(jié)果溯源性及參考系統(tǒng)

1.1 臨床檢測結(jié)果溯源性

醫(yī)學(xué)診斷及其治療都依賴于臨床檢測指標(biāo)的準(zhǔn)確可靠。臨床上有近4 000項(xiàng)檢測項(xiàng)目，涵蓋不同的相對分子質(zhì)量、濃度范圍、形態(tài)和基體。臨床檢驗(yàn)已成為疾病診斷、治療效果評價和健康狀況監(jiān)測的重要手段，臨床檢測結(jié)果的一致性和可比性是防病治病和提高人類健康水平的基本要求。臨床檢測結(jié)果關(guān)系患者、門診醫(yī)生、檢驗(yàn)科、病理科專家、儀器廠家以及醫(yī)療管理部門等諸多相關(guān)方的利益。檢測結(jié)果受“人、機(jī)、料、法、環(huán)”等因素影響。

國際計(jì)量局(bureau international des poids et mesures, BIPM)、聯(lián)合國際法制計(jì)量組織(international organization of legal metrology, OIML)、國際實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可合作組織(international laboratory accreditation cooperation, ILAC)，以及國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(international organization for standardization, ISO)發(fā)布《BIPM，OIML，ILAC，ISO對計(jì)量溯源性聯(lián)合聲明》[1]，明確提出測量結(jié)果一致性和可比性是檢測結(jié)果的基本需求，只有實(shí)現(xiàn)可比，檢測結(jié)果方可被普遍采納。溯源性是關(guān)于測量結(jié)果的屬性，使測量結(jié)果通過連續(xù)的比較鏈與給定的參考標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來，具有一致性和可比性，給定的參考標(biāo)準(zhǔn)通常是國家或國際標(biāo)準(zhǔn)，是實(shí)現(xiàn)國際等效的保證。比較鏈中每一步都有給定的不確定度，溯源源頭可以是國際單位制(international system of units, SI)或國際公認(rèn)其他參考標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 臨床參考系統(tǒng)

患者新鮮樣品檢測結(jié)果的可溯源性是建立臨床參考系統(tǒng)的主旨和最終目標(biāo)。溯源性的基礎(chǔ)是參考系統(tǒng)，包括參考物質(zhì)、測量程序和參考實(shí)驗(yàn)室。參考系統(tǒng)應(yīng)具有國際公認(rèn)的計(jì)量學(xué)水平。一級參考物質(zhì)(primary reference material, PRM)是指用基準(zhǔn)方法或二種不同原理的方法定值，具有最高計(jì)量學(xué)水平，一般是純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前，一級參考測量程序(基準(zhǔn)方法)僅限于同位素稀釋/質(zhì)譜(ID/MS)、庫侖法、重量法、滴定法和依數(shù)性(如凝固點(diǎn)降低)測量等[5]。國際上臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目能溯源至SI單位的約有25～40個，如電解質(zhì)類物質(zhì)(如鉀、鈉、氯、鎂、鈣、鋰離子等)、代謝物類物質(zhì)(如膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、肌肝、尿酸、尿素等)和某些甾體類激素及甲狀腺激素等，雖數(shù)目不大，卻是臨床檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目的主要組成部分。其余多因測量(主要是生物大分子類物質(zhì))的復(fù)雜性(如混合物、異構(gòu)體等)，使得一級參考測量過程的建立和一級參考物質(zhì)的制備困難，量值溯源停留在較低水平[4,6]。臨床上標(biāo)記常用的主要穩(wěn)定同位素列于表1，包括碳、氫、氧、氮等元素。

表1 臨床上常用的穩(wěn)定同位素Table 1 Frequently-used stable isotopes in clinic

2 IDMS基本概念、溯源性原理

2.1 IDMS溯源性原理

基準(zhǔn)方法，亦稱絕對方法或定義測量方法(primary/absolute/definitive method)，其定義為具有最高計(jì)量學(xué)特性的測量方法。其操作可以被完整描述和理解，不確定度可以用SI單位表述，其測量值不需要參考相同量的其他標(biāo)準(zhǔn)。具有被測量定義明確、高度特異性、不確定度分量及其影響因素清晰、最小的不確定度和最高的計(jì)量學(xué)水平等特征，常由中國計(jì)量科學(xué)院建立。根據(jù)基準(zhǔn)方法的特征，國際物質(zhì)量咨詢委員會(committee for amount of substance: metrology in chemistry and biology, CCQM)確定了化學(xué)領(lǐng)域五種基準(zhǔn)方法，包括同位素稀釋質(zhì)譜法、庫侖法、重量法、滴定法以及如凝固點(diǎn)下降法等其他依數(shù)性測量方法[5,7-9]。同位素稀釋質(zhì)譜法原理是向被測樣品中加入一定量的同位素，通過質(zhì)譜測定同位素豐度比進(jìn)行定量[8]，其主要過程為：精確稱量一定質(zhì)量的被測樣品，配制成一定濃度Cs的樣品溶液，同時精確稱量一定質(zhì)量的高純度同位素配制成濃度Cl的同位素溶液，將兩者混合成一定同位素豐度比的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)充分混合平衡后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，根據(jù)測得的同位素豐度比和質(zhì)量比按一定模式進(jìn)行定量。

2.2 IDMS 基準(zhǔn)方法定量方式

IDMS 基準(zhǔn)方法定量方式主要包括單點(diǎn)法、括弧法以及線性法/校準(zhǔn)曲線法，分述如下。

2.2.1單點(diǎn)法 精確配制1個校準(zhǔn)混合溶液，同位素比約為1.0，計(jì)算公式如式(1)所示：

(1)

式中，Rwsample、Rwstandard分別指樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的同位素質(zhì)量比；RAsample、RAstandard分別指樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的同位素豐度響應(yīng)比。單點(diǎn)法要求配制的校準(zhǔn)混合溶液以及樣品中添加的同位素質(zhì)量比盡可能接近1，適合經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后得到樣品大致濃度需要精確定量的情況，具有制備樣品量少的優(yōu)點(diǎn)。

2.2.2括弧法 需要配制高標(biāo)、低標(biāo)2個校準(zhǔn)混合溶液，同位素豐度比約為1.00，如(0.95～1.05) ，按比例法定量，計(jì)算公式如式(2)所示：

(2)

式中，C為待測樣品中被測量的濃度，mg/kg；Rs為待測樣品中同位素豐度比；Rl為低標(biāo)樣品中同位素豐度比；Rh為高標(biāo)樣品中同位素豐度比；Wh為高標(biāo)樣品中同位素質(zhì)量比；Wl為低標(biāo)樣品中同位素質(zhì)量比；Mlab為待測樣品添加的標(biāo)記質(zhì)量，g；Mser為待測樣品中被測量的質(zhì)量，g；PS為被測量高純物質(zhì)(如純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))的純度。

括弧法亦稱比例法，是在接近樣品被測量濃度附近范圍配制高標(biāo)和低標(biāo)混合校準(zhǔn)溶液。同樣適合經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后得到樣品大致濃度需要精確定量的情形，可以通過多次實(shí)驗(yàn)，不斷收緊高標(biāo)、低標(biāo)范圍，具有定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。按低標(biāo)→樣品A→樣品B→高標(biāo)→樣品A→樣品B→低標(biāo)的次序進(jìn)樣，要求相鄰兩次進(jìn)樣的檢測結(jié)果變異系數(shù)CV<1%，否則需要再增加進(jìn)樣次數(shù)，直至滿足要求。

2.2.3線性法 亦稱校準(zhǔn)曲線法，是在樣品被測量濃度范圍配制系列校準(zhǔn)混溶液(5～9個同位素質(zhì)量比，如0.85～1.25)，在一定范圍內(nèi)校準(zhǔn)混合溶液中同位素質(zhì)量比(RW)與同位素豐度比的線性相關(guān)性，如公式(3)所示，從而回歸擬合得到樣品中被測量的濃度：

RW=a+bRA

(3)

線性法適合對被測樣品經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定大致濃度范圍的情形，也適合對樣品進(jìn)行精確定量的情形，具有定量可靠的優(yōu)點(diǎn)。但線性法在精確定量時要求配制的混合校準(zhǔn)溶液較多(5～9個)，樣品配制工作量大，特別是有多個被測量的情況，且要求線性相關(guān)系數(shù)r>0.999 9，以保證定量結(jié)果的可靠性，此外，線性不確定度分量也需要評定。

2.3 不確定度評定

作為基準(zhǔn)方法，IDMS具有最高的計(jì)量學(xué)特性，即具有最低的不確定度。根據(jù)IDMS溯源原理，主要包括重量法配制和質(zhì)譜法檢測兩個環(huán)節(jié)，相應(yīng)的合成不確定度uC評定依據(jù)公式(4)：

uC=

(4)

總體分為A類不確定度和B類不確定度，其中A類不確定度是使用統(tǒng)計(jì)分析法評定，而B類不確定度是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或其他信息，不使用統(tǒng)計(jì)分析法進(jìn)行評定。樣品溶液、同位素溶液以及混合校準(zhǔn)溶液通常均采用重量-重量法配制，需要在控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下使用高精密度天平準(zhǔn)確稱量。稱重過程不確定度分量需要考慮天平浮力、線性、靈敏度、樣品水分、穩(wěn)定性以及稱量重復(fù)性等因素影響。樣品制備過程中萃取、混合平衡常常很難保證添加的同位素標(biāo)記物與樣品中的被測量物充分平衡，需要對樣品處理過程優(yōu)化，確保兩者充分平衡。可通過樣品添加研究評估回收率，即添加已知量的被測物至待測樣品中，充分平衡后使其盡可能與被測樣品接近。質(zhì)譜響應(yīng)主要受基質(zhì)干擾、質(zhì)量歧視、豐度靈敏度以及響應(yīng)重復(fù)性等因素影響。在評定測量結(jié)果不確定度時，還應(yīng)考慮樣品的均勻性、萃取效率、分析空白、干擾影響、回收率等不確定度分量對合成不確定度的影響。

3 IDMS在臨床參考測量系統(tǒng)上的應(yīng)用

3.1 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會

國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會是由國際計(jì)量局、國際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(international federation of clinical chemistry and laboratory medicine, IFCC)和國際實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可合作組織(international laboratory Accreditation cooperation, ILAC)共同組織成立，秘書處設(shè)在國際計(jì)量局。旨在“指導(dǎo)和促進(jìn)世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等效測量，為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)測量標(biāo)準(zhǔn)溯源提供全球平臺”。其任務(wù)就是指導(dǎo)和促進(jìn)世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等效測量，實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)測量結(jié)果的可溯源性，提供全球平臺。核心工作就是鑒別和遴選急需關(guān)鍵檢驗(yàn)指標(biāo)的可溯源性和可比性，鼓勵利益攸關(guān)方參與建立參考系統(tǒng)。

3.2 JCTLM 數(shù)據(jù)庫[10]

根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)：截至2017年3月，JCTLM 數(shù)據(jù)庫共收錄了293 種參考物質(zhì)，184 種參考測量程序和由17個參考實(shí)驗(yàn)室提供的161種參考測量服務(wù)。

3.2.1參考系統(tǒng)完整 具備三位一體的參考物質(zhì)(包括純度參考物質(zhì)和基體參考物質(zhì))、參考測量程序和參考測量服務(wù)。目前JCTLM 數(shù)據(jù)庫共有26個完整的參考系統(tǒng)，包括17 beta-雌二醇、孕酮、睪酮、可的松、膽固醇、血清肌酐、甘油三酯、血中尿素、血中尿酸、地高辛、γ-谷氨酸、HDLLDL 13種有機(jī)小分子；鈣、鎂、鉀、鈉、鋰、氯離子6種無機(jī)電解質(zhì)；以及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、α-淀粉酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶、糖化血紅蛋白7種酶及蛋白。上述13種有機(jī)小分子和6種無機(jī)電解質(zhì)基于同位素稀釋質(zhì)譜技術(shù)參考測量程序。

3.2.2尚待完善 參考系統(tǒng)三要素中只有兩個，還缺少一個要素。目前數(shù)據(jù)庫中有39種尚待完善的參考系統(tǒng)，包括基于同位素稀釋質(zhì)譜法建立了參考測量程序的羥孕酮、羥基雌酮、VD2、VD3、甲基四氫葉酸、醛固酮、膽紅素、洋地黃毒苷、雌三醇、甲狀腺素、魯米那、苯妥英、茶堿、T3T4、尿中(肌酐、葡萄糖、尿素、尿酸)等19種有機(jī)小分子和砷、鎘、鈷、銅、鉛、汞等10種無機(jī)電解質(zhì)；此外還有白蛋白、C 肽、CRP、IgGIgAIgM、轉(zhuǎn)鐵蛋白、transthyretin等10種大分子蛋白參考系統(tǒng)需要完善。

3.2.3單一要素的參考系統(tǒng) 目前只有其中一個要素的參考系統(tǒng)，共計(jì)140種，包括63種只有純度或溶液參考物質(zhì)，其中包括21種校準(zhǔn)溶液和42種純度參考物質(zhì)；60種只有基體參考物質(zhì)，包括4種血漿基質(zhì)、27種血清基質(zhì)和29種尿液基質(zhì)。17種只有參考測量程序，包括11種血清基質(zhì)、3種全血基質(zhì)、2種血漿基質(zhì)、1種腦脊液基質(zhì)和1種尿液基質(zhì)。

3.3 我國在臨床參考系統(tǒng)方面的研究[11-13]

近年來，臨床參考系統(tǒng)研究在國內(nèi)發(fā)展迅速，目前主要是中國計(jì)量科學(xué)研究院等機(jī)構(gòu)代表參加JCTLM的年會，在BIPM JCTLM中發(fā)揮積極作用，臨床領(lǐng)域參考物質(zhì)被JCTLM參考物質(zhì)數(shù)據(jù)庫收錄。中國計(jì)量院研究人員作為評審專家或組長在JCTLM工作組中發(fā)揮著積極作用。

中國計(jì)量科學(xué)研究院基于IDMS基準(zhǔn)方法，成功參加了系列臨床領(lǐng)域國際比對。建立了LC-IDMS測定血清中肌酐準(zhǔn)確定值方法，2005年6月參加了血清中肌酐國際比對CCQM-K12.1。建立了直接蛋白沉淀-低溫離心的LC/MS電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)，建立了液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜(LC-IDMS)準(zhǔn)確測定血糖的方法，2013年參加了CCQM-K11.2血清中葡萄糖國際比對，取得了很好的比對結(jié)果，在所有實(shí)驗(yàn)室中成績最好，實(shí)現(xiàn)了國際互認(rèn)和等效一致，并對兩種絕對方法進(jìn)行了比較。建立了LC-IDMS測量血清中睪酮含量的高準(zhǔn)確度方法，采用萃取和沉淀等前處理方法從血清中提取睪酮，以13C標(biāo)記睪酮為內(nèi)標(biāo)，同時考察樣品前處理過程的影響，2016年6月參加的國際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)血清中睪酮含量測定國際比對中取得了良好成績。2017年3月參加了國際計(jì)量比對計(jì)劃(CCQM-K78)，測定水溶液中苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸四種氨基酸的含量。利用液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法，以氨基酸相對應(yīng)的同位素標(biāo)記物為內(nèi)標(biāo)，準(zhǔn)確測定了四種氨基酸的含量，實(shí)現(xiàn)了亮氨酸和異亮氨酸同分異構(gòu)體的完全分離。中國計(jì)量科學(xué)研究院大部分臨床參考物質(zhì)均采用IDMS基準(zhǔn)方法進(jìn)行定值，如膽固醇、肌酐、葡萄糖、可的松、激素等被測量定義明確的小分子化合物，可溯源至SI。

4 小結(jié)

測量結(jié)果一致性和可比性是臨床檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)的基本需求，只有實(shí)現(xiàn)可比，測量結(jié)果方可被普遍接受。溯源性是測量結(jié)果一致性和可比性的保證，臨床參考系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)臨床結(jié)果溯源性的技術(shù)途徑。IDMS是一項(xiàng)基準(zhǔn)方法，具有最高的計(jì)量特性，在臨床參考系統(tǒng)方面有著廣泛的應(yīng)用，如用于參考測量程序的建立，血清基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值以及國際比對等。

參考文獻(xiàn)：

[1] David A. Metrological traceability of assays and comparability of patient test results[J]. Clin Lab Med, 2017, 37: 119-135.

[2] JOINT BIPM, OIML, ILAC and ISO Declaration on Metrological Traceability[M]. Paris: BIPM, 2011.

[3] 陳文祥. 臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化:醫(yī)療質(zhì)量管理的重要課題[J]. 中華臨床實(shí)驗(yàn)室管理電子雜志,2017,5(1):1.

Chen WenXiang. Standardization of clinical test: an important subject of medical quality management[J]. Chinese Journal of Clinical Laboratory Management (Electronic Edition), 2017, 5(1): 1(in Chinese).

[4] Lothar S. Requirements for reference (calibration) laboratories in laboratory medicine[J]. Clin Biochem Rev, 2007, 28: 154.

[5] Quinn T J. Primary methods of measurement and primary standards[J]. Metrologia, 1997, 34: 61-65.

[6] David A, Richard R M. The joint committee for traceability in laboratory medicine (JCTLM): A global approach to promote the standardisation of clinical laboratory test results[J]. Clin Biochem Rev, 2007, 28: 105-113.

[7] Selvin H E, Mary M K, Susan D P, et al. Proposed serum cholesterol reference measurement procedure by gas chromatography-isotope dilution mass spectrometry[J]. Clinical Chemistry, 2011, 57: 4 614-4 622.

[8] 徐大剛,李良君,杜曉寧,等. 穩(wěn)定同位素技術(shù)的研究與發(fā)展[J]. 中國核科學(xué)技術(shù)進(jìn)展報(bào)告(第一卷),2009:73-77.

Xu Dagang, Li Liangjun, Du Xiaoning, et al. The research and development of stable isotope technology[J]. Progress Report on China Nuclear Science & Technology (Vol.1), 2009: 73-77(in Chinese).

[9] Jochen V, Wolfgang P. Isotope dilution mass spectrometry-A primary method of measurement and its role for RM certification[J]. Journal of Metrology Society of India, 2010, 25(3): 135-164.

[10] JCTLM. Laboratory medicine and in vitro diagnostics [DB/OL] [2017-12-04]. http:∥www.bipm.org/jctlm/.

[11] 全燦，徐蓓，李紅梅,等. 醫(yī)學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室的計(jì)量學(xué)特性研究[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015,(17):2 610-2 613.

Quan Can, Xu Bei, Li Hongmei, et al. Study on the metrological characteristics of medical reference laboratory[J]. International Journal of Laboratory Medicine Int J Lab Med , 2015, (17): 2 610-2 613(in Chinese).

[12] 全燦,李紅梅,徐蓓,等. 血糖參考測量實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016,37(4):571-572.

Quan Can, Li Hongmei, Xu Bei, et al. Laboratory proficiency test of serum glucose reference measurement[J]. International Journal of Laboratory Medicine Int J Lab Med, 2016, 37(4): 571-572(in Chinese).

[13] 石蓮花，金有訓(xùn)，何海紅，等. 血清中尿酸和尿素含量測定的超高效液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法國際比對[J]. 化學(xué)分析計(jì)量,2017,26(4):85-88.

Shi Lianhua, Jin Youxun, He Haihong, et al. Determination of uric acid and urea in serum by ultra high performance liquid chromatography-an international comparison of single Quadrupole Mass Spectrometer[J]. Chemical Analysisand Meterage, 2017, 26(4): 85-88(in Chinese).