游淑珠，唐食明，蔡教英，姚麗鋒，王小玉，馮家望，丁琦，符家忍

（珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東珠海 519000）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）為人和溫血動物腸道正常棲居菌，絕大部分大腸埃希氏菌在正常棲居條件下不致病，若侵入組織或血液時可引起化膿性炎癥或敗血癥，可引發(fā)體弱或免疫力低下人群或動物感染。有些大腸埃希氏菌為食源性致病菌，能引起人類以腹瀉癥狀為主的病癥，這些大腸埃希氏菌被統(tǒng)稱為致瀉性大腸埃希氏菌（diarrheagenic E. coli，DEC）。致瀉性大腸埃希氏菌可分為：腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenic E. coli，EPEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive E. coli，EIEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（enterotoxigenic E. coli，ETEC）、腸道集聚性大腸埃希氏菌（enteroaggregative E. coli，EAggEC）、擴散附著大腸埃希氏菌（diffusely adherent E. coli，DAEC）和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌為（shigatoxin-producingE. coli，STEC）六大類[1]。部分產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌屬于腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagicE. coli，EHEC）可引起人類出血性結腸炎或出血性腹瀉、溶血性尿毒綜合癥等臨床癥狀。

致瀉性大腸埃希氏菌與特定血清型有一定相關性，《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》列出了已發(fā)現(xiàn)的EPEC、ETEC、EIEC、EAggEC和STEC五種致瀉大腸埃希氏菌的所有相關血清型，其中大腸埃希氏菌O145血清型與 EPEC、STEC相關[1,2]。從臨床病人和溫血動物中均有分離大腸埃希氏菌O145的致病性菌株的相關報道[3～7]，1984年日本首次報道大腸埃希氏菌O145導致的食源性疾病暴發(fā)事件以來，美國、德國、比利時等許多國家都報道過大腸埃希氏菌O145引起的食源性疾病暴發(fā)事件[6～8]，其中2010年美國密歇根、俄亥俄和紐約等5個州暴發(fā)的因食用被污染長葉生菜的重大食源性疾病事件的病原體也被認定為大腸埃希氏菌O145[7]。

大腸埃希氏菌的抗原成分復雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中O抗原是血清分型的基礎，共有一百七十多種[1]。由于分型用血清售價高、保質(zhì)期短，加上大腸埃希氏菌污染較普遍等特點，導致傳統(tǒng)分離、生化和血清分型鑒定方法存在檢測時間長、鑒定過程工作量大、檢測費用居高不下等無法避免的缺點，在實際應用中大大受限。O抗原由O抗原基因簇編碼，隨著對O抗原基因簇編碼基因研究的深入，以為PCR代表的現(xiàn)代分子生物學新技術以其無可取代的優(yōu)勢被廣泛用于微生物檢測領域，也同樣被成功應用大腸埃希氏菌O145血清型的檢測[8～11]。Taqman探針熒光PCR法是利用PCR反應延伸過程中，Taq酶的5’核酸外切酶活性切割與靶序列結合的寡核苷酸探針，使得Taqman探針的報告基團與淬滅基團分離而產(chǎn)生熒光強度變化的一種 PCR技術，與 SYBR green染料熒光 PCR法以及傳統(tǒng)的PCR擴增加電泳檢測相比，Taqman探針的引入提升了反應的特異性，該技術實行完全閉管式操作，不僅避免了傳統(tǒng)PCR開蓋引起的產(chǎn)物污染問題，減少了假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn)，還避免了對環(huán)境的污染[12]，擴增反應全程動態(tài)實時可見，是一種高特異性、高靈敏度、快速高通量的現(xiàn)代分子生物學檢測技術，本世紀以來已被逐步推廣應用于生物學研究、食品檢測、環(huán)境檢測、醫(yī)學檢測與診斷等行業(yè)。

本研究以大腸埃希氏菌O145為檢測對象針對其O抗原基因簇的wckD基因建立了Taqman熒光PCR檢測方法，驗證了方法的靈敏度和特異性，并將其用于食品中大腸埃希氏菌O145的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

28株大腸埃希氏菌細菌和20株非大腸埃希氏菌細菌，分別來源于美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，英國國家典型菌株保藏中心（National Collection of Type Cultures，NCTC），中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collection，CMCC)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，簡稱CCTCC)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，黑龍江出入境檢驗檢疫局和珠海出入境檢驗檢疫局。

表1 實驗用菌株Table 1 Strains used in theexperiment

大腸埃希氏菌 A T C C 4 3 8 9 3 O 1 2 4 金黃色葡萄球菌 C M C C(B)2 6 0 0 3 /大腸埃希氏菌 A T C C 3 5 1 5 0 O 1 5 7 表皮葡萄球菌 C M C C(B)2 6 0 6 9 /大腸埃希氏菌 A T C C 7 0 0 0 7 8 / 藤黃微球菌 C M C C(B)2 8 0 0 1 /大腸埃希氏菌 A T C C 1 0 7 9 8 / 銅綠假單孢菌 C C T C C A B 9 1 0 9 5 /大腸埃希氏菌 A T C C 1 3 7 0 6 / 肺炎克雷伯氏菌 C M C C 4 6 1 0 1 /大腸埃希氏菌 A T C C 1 5 5 9 7 / 腸炎沙門氏菌 C C T C C A B 9 4 0 1 8 /大腸埃希氏菌 A T C C 1 1 2 2 9 / 福氏志賀氏菌 C M C C 5 1 5 7 1 /大腸埃希氏菌 N C T C 1 2 9 0 0 O 1 5 7 宋內(nèi)氏志賀氏菌 C M C C 5 1 3 3 4 /大腸埃希氏菌 C C T C C A B 2 0 0 0 5 1 O 1 5 7 副溶血性弧菌 A T C C 1 7 8 0 2 /大腸埃希氏菌 C C T C C A B 2 0 0 0 6 8 / 乙型溶血性鏈球菌 C M C C(B) 3 2 2 1 0 /大腸埃希氏菌 C M C C(B)4 4 1 0 2 / 枯草芽孢桿菌 C M C C(B)6 3 5 0 1 /大腸埃希氏菌 E C O 4 O 4 產(chǎn)氣莢膜梭菌 A T C C 1 3 1 2 4 /大腸埃希氏菌 E C O 1 0 4 O 1 0 4 糞腸球菌 C M C C(B) 3 2 2 2 0 /大腸埃希氏菌 E C O 1 5 7-1 O 1 5 7 小腸結腸炎耶爾森氏菌 C M C C(B) 5 2 2 0 4 /大腸埃希氏菌 E C O 1 5 7-2 O 1 5 7 變形桿菌 C M C C(B) 4 9 0 2 7 /

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑與溶液

離子柱型DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；DEPC水：生工生物工程（上海）股份有限公司；EC肉湯：北京陸橋技術股份有限公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒、DNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；DNA裂解液：珠?？频巧锕こ逃邢薰?。

1.1.3 引物和探針

在NCBI網(wǎng)站上檢索的不同菌株來源的大腸埃希氏菌O145的O抗原基因簇序列（GenBank序列號：AY863412、AY647260、 JN850039～JN850044），DNAMAN軟件比對，根據(jù)wckD基因高保守區(qū)的基因序列，通過Oligo7.0軟件設計引物、Taqman探針。上游引物：5′-CTGTGATTCAGAACTAGAAG-3′；下游引物：5′-GCCACTACTACATTGTCA-3′；探針：5′-FAM-TCACGAATAACTACAGAACCAGAACCABHQ1-3′：上海英濰捷基公司合成。引物對和探針分別用DEPC水稀釋至儲備濃度100 μmol/L，-20 ℃保存，臨用時用DEPC水稀釋至工作濃度10 μmol/L。

1.1.4 食品樣品

畜肉196份、水產(chǎn)品46份、禽產(chǎn)品43份、可生食蔬菜54份：部分購自珠海本地集貿(mào)市場、超市；部分為本單位受理的委托檢驗樣品。

1.2 主要儀器設備

NanoDropND-1000核酸濃度測定儀：美國賽默飛世爾公司；Minispin Plus離心機：德國艾本德公司；7500Fast熒光PCR儀：美國美國應用生物系統(tǒng)公司；AES easyMIX拍擊式均質(zhì)器：法國生物梅里埃公司；1565-2E恒溫培養(yǎng)箱，美國SHELLAB公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌 DNA模板的制備、濃度和純度測定

各菌株指數(shù)生長期新鮮培養(yǎng)物，用DNA提取試劑盒并按其說明提取制備DNA模板。核酸濃度測定儀測定出 DNA濃度與純度，OD260/OD280比值在1.6～1.9之間表明DNA純度較高，可用于PCR擴增。

1.3.2 熒光PCR反應體系和反應條件

反應體系：總體積 25 μL：Premix（2×）12.5 μL、引物對（10 μmol/L）1 μL、探針（10 μmol/L）1 μL、50×ROX Reference Dye I（I50×）0.5 μL、DEPC水8 μL、模板2 μL。每個反應管均設置雙平行管?？瞻讓φ找訢EPC水代替模板。

反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，收集熒光，40個循環(huán)。

1.3.3 特異性試驗

各菌株DNA模板均按1.3.2進行熒光PCR擴增，驗證熒光PCR方法的特異性。

1.3.4 靈敏度試驗

將大腸埃希氏菌O145的DNA進行10倍梯度稀釋至10-7濃度，將DNA原液和核酸梯度稀釋液相同條件進行熒光PCR擴增，確定熒光PCR方法的靈敏度。

1.3.5 食品樣品的檢測

1.3.5.1 樣品制備和均質(zhì)

無菌稱取樣品25 g至有濾網(wǎng)的拍擊式均質(zhì)袋，加入225 mL無菌EC肉湯，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min。

1.3.5.2 樣品增菌

36 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.3.5.3 樣品核酸提取

拍擊式均質(zhì)袋中取1 mL增菌液的濾過液，12000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加50 μL DNA裂解液，100 ℃金屬浴5 min，冷卻，12000 r/min離心5 min，上清用于熒光PCR檢測。

1.3.5.4 樣品熒光PCR檢測

同1.3.2中的條件進行熒光PCR檢測。

2 結果與討論

2.1 Taqman探針熒光PCR檢測方法的建立

圖1 大腸埃希氏菌O145擴增曲線Fig.1 Amplification plot of Escherichia coli O145

選擇大腸埃希氏菌O145的O抗原基因簇中wckD基因為靶基因，設計引物、探針，通過反應體系和反應條件優(yōu)化，建立了大腸埃希氏菌 O145的 Taqman探針熒光PCR檢測方法，大腸埃希氏菌O145菌株呈現(xiàn)出典型的熒光PCR擴增曲線（見圖1），表明該反應體系適用于大腸埃希氏菌O145的擴增。

2.2 特異性試驗

圖2 大腸埃希氏菌O145特異性試驗擴增曲線Fig.2 Amplification plot of specificity test of Escherichia coli O145

表1所列菌株用建立的Taqman探針熒光PCR法進行擴增，以驗證方法的特異性，驗證結果表明，僅大腸埃希氏菌O145菌株呈現(xiàn)出典型的熒光PCR擴增曲線（見圖2），其它27株大腸埃希氏菌和20株非大腸埃希氏菌菌株的DNA樣本的檢測結果均為陰性。據(jù)此可判斷，本研究中針對大腸埃希氏菌O145的引物和Taqman探針特異性良好。

2.3 靈敏度試驗

圖3 大腸埃希氏菌O145靈敏度試驗擴增曲線Fig.3 Amplification plot of sensitivity test of Escherichia coli O145

核酸濃度測定儀測定大腸埃希氏菌O145菌株的DNA濃度為33 ng/μL，菌株DNA原液和10倍遞增稀釋液擴增曲線見圖3，每個反應模板加入量為2 μL，圖中可見大腸埃希氏菌O145菌株的DNA原液（66 ng/反應）、10-1稀釋液（6.6 ng/反應）、10-2稀釋液（660 pg/反應）、10-3稀釋液（66 pg/反應）、10-4稀釋液（6.6 pg/反應）、10-5稀釋液（0.66 pg/反應）均有明顯擴增曲線出現(xiàn)，且各稀釋度平行試驗重復性良好，因此可計算、判斷本方法檢測靈敏度為0.66 pg/反應，大腸埃希氏菌基因組為0.004 pg/拷貝，靈敏度折算即165拷貝/反應。

2.4 食品樣品污染調(diào)查

所檢339份食品樣品中檢出大腸埃希氏菌 O145陽性31份，陽性率9.1%，各類型樣品陽性率見表2。由表2結合樣品來源分析可知，生畜肉均為購自市場和超市的生豬肉和生牛肉，未經(jīng)過食品深加工，196份樣品檢出樣品大腸埃希氏菌O145陽性樣品27份，陽性率最高達13.8%；水產(chǎn)品、禽產(chǎn)品和可生食蔬菜多數(shù)為經(jīng)過加工的產(chǎn)品，特別是部分水產(chǎn)品和禽產(chǎn)品為深度加工的鮮、凍產(chǎn)品，陽性率較低，46份水產(chǎn)品、禽產(chǎn)品43份各檢出樣品大腸埃希氏菌O145陽性1份，陽性率分別為2.2%和2.3%；54份可生食蔬菜檢出大腸埃希氏菌O145陽性2份，陽性率為3.7%。檢測結果表，食品基質(zhì)營養(yǎng)越豐富、未經(jīng)過加工或只經(jīng)過初加工的產(chǎn)品陽性率相對較高，經(jīng)深加工的產(chǎn)品陽性率相對較低，樣品檢出陽性率與食品基質(zhì)類型及其加工程度存在一定相關性。

表2 食品樣品污染調(diào)查結果統(tǒng)計分析Table 2 Statisticsanalysis of food samples pollution survey

3 結論

3.1 Taqman探針熒光PCR技術具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點，與SYBR green染料熒光PCR法以及傳統(tǒng)的PCR擴增加電泳檢測相比，Taqman探針的引入提升了反應的特異性，使其特異性更強、自動化程度更高，擴增反應全程動態(tài)實時可見，PCR擴增過程無需對PCR擴增產(chǎn)物進行后處理，完全閉管式操作，可有效解決PCR產(chǎn)物污染導致的假陽性等問題，已成為檢測領域重要的快速高通量檢測手段。

3.2 本研究中設計的引物和Taqman探針可實現(xiàn)對大腸埃希氏菌 O145菌株的特異性擴增，其它 27株非O145大腸埃希氏菌和20株非大腸埃希氏菌細菌菌株均無擴增，說明引物和探針具有高度特異性。為確定該方法檢測靈敏度，對已知濃度的大腸埃希氏菌O145核酸進行10倍梯度稀釋，進行實時熒光PCR檢測，結果顯示，原始菌液稀釋至10-5時仍能檢出，表明本方法對檢測靈敏度為0.66 pg/反應（即165拷貝/反應）。

3.3 食品中食源性致病菌往往含量不高，食品樣品采用EC肉湯增菌培養(yǎng)物進行實時熒光PCR進行檢測，其原理是利用細菌在指數(shù)增長期遵循的數(shù)學指數(shù)模型以提高檢測的靈敏度、準確度和可靠性，便于簡化DNA提取步驟、減少非活致病菌的干擾，避免死的目標菌導致的假陽性產(chǎn)生，樣品增菌并用增菌液的濾過液進行實時熒光 PCR檢測可避免肉類等復雜基質(zhì)可能導致的假陰性產(chǎn)生。食品樣品DNA的提取采用的熱裂解法操作簡便、快速、經(jīng)濟節(jié)約，便于大批量樣品的檢測。

3.4 本研究建立的Taqman探針熒光PCR方法全過程（包括樣品增菌、核酸提取、熒光PCR擴增反應和結果分析）用于食品中大腸埃希氏菌O145的檢測僅需約28 h，樣品增菌后的核酸提取和檢測所需時間僅2 h～3 h，與傳統(tǒng)細菌分離鑒定方法增菌后分離、生化和血清鑒定至少需3 d～7 d相比顯著縮短了檢測時間。綜上所述，方法的特異性、靈敏度和實際樣品污染調(diào)查試驗表明，本研究建立的熒光PCR快速檢測方法特異性強、靈敏度高、快速、操作簡便，可用于食品中大腸埃希氏菌O145的快速檢測。

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