章鼎敏，劉貴梅，盧永翎，鄭鐵松，呂麗爽*

蛋白質(zhì)糖基化即還原糖和蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的游離氨基發(fā)生的非酶促褐變反應(yīng)，該反應(yīng)過程中生成一系列的晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）[1]。AGEs的形成涉及到復(fù)雜的連續(xù)和平行反應(yīng)，它形成的具體機(jī)制存在多條路徑，產(chǎn)物復(fù)雜，存在爭議，一直是研究的熱點(diǎn)[2-3]。食源性的AGEs明顯地增加了生物體內(nèi)總AGEs的含量[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)通過飲食攝入含量超過10%的AGEs后，有2/3進(jìn)入生物體組織，其余1/3通過腎臟排出[6]。AGEs在體內(nèi)蓄積[7-8]會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥和慢性心臟衰竭等[9-11]。近年來，很多學(xué)者對(duì)如何檢測和有效抑制食源性和體內(nèi)產(chǎn)生的AGEs進(jìn)行了大量研究，由于AGEs結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類很多，逐一檢測有一定難度，但大多數(shù)大分子AGEs具有熒光吸收的特點(diǎn)，目前熒光光譜法因適合對(duì)體系熒光性AGEs總量進(jìn)行檢測而被廣泛應(yīng)用[12]。

大豆含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組成主要為7S球蛋白和11S球蛋白，約占蛋白質(zhì)總含量70%左右。11S球蛋白占大豆總蛋白含量的25%～35%，含有較多的谷氨酸、天冬氨酸殘基，少量的組氨酸、色氨酸和胱氨酸[13]，并且含有豐富的賴氨酸，賴氨酸含量占總蛋白的10.75%[14]。1999年美國食品藥品監(jiān)督管理局同意在產(chǎn)品標(biāo)簽中標(biāo)注大豆具有降低膽固醇作用，使得大豆市場得到了更高地增長[15]。由于11S大豆球蛋白溶解性和乳化性能較低，限制其在工業(yè)上的應(yīng)用。目前通過對(duì)大豆蛋白進(jìn)行糖基化改性從而有效改善大豆11S球蛋白的乳化性[16]、溶解性[17]、穩(wěn)定性[18]、凝膠性[19]等蛋白功能性質(zhì)，并廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。而在大豆蛋白改性或者含糖大豆食品加工過程中，美拉德反應(yīng)是否會(huì)產(chǎn)生大量的有害大分子交聯(lián)AGEs，是要關(guān)注的重點(diǎn)。齊軍茹等[20]通過干熱反應(yīng)采用多糖對(duì)大豆蛋白進(jìn)行改性，且十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）實(shí)驗(yàn)證明復(fù)合產(chǎn)物中存在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。但是，目前對(duì)其中有害產(chǎn)物AGEs的監(jiān)測、抑制及有效調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過熒光分光光度法、SDS-PAGE、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等技術(shù)，探討了大豆在高溫加工或蛋白改性過程中有害糖產(chǎn)物AGEs的形成及添加黃酮對(duì)其抑制機(jī)理，提高了大豆食品安全性，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆11S球蛋白依據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法由低溫脫脂大豆粕分離提純而得；染料木素、木犀草素、蘆丁（均為色譜級(jí)） 南京廣潤生物試劑有限公司；槲皮素（色譜級(jí)） 美國Sigma Aldrich公司；考馬斯亮藍(lán)、丙烯酰胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、三羥基氨基甲烷、過硫酸銨、溴酚藍(lán)、SDS、甘氨酸生工生物工程（上海）股份有限公司；β-巰基乙醇、冰醋酸 南京賽吉科技有限公司；大豆油 新加坡益海嘉里集團(tuán)；葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、甲酸（均為分析純） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite 200Pro多孔酶標(biāo)儀 瑞士帝肯貿(mào)易有限公司；EPS 300電泳儀 上海天能科技有限公司；凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；LC-MS/MS聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；UV1600紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；T18高速勻漿機(jī) 德國IKA公司；冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST公司。

1.3 方法

1.3.1 11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響因素

1.3.1.1 糖種類對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

11S球蛋白和糖均用0.2 mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解。在樣品管中加入11S球蛋白、葡萄糖（或乳糖、果糖、蔗糖）和PBS各2 mL，使11S球蛋白和糖的終質(zhì)量濃度分別為2 mg/mL和4 mg/mL?；靹蚝笥?00 ℃沸水浴中反應(yīng)0、5、15、30、60、90、120 min，以8 000×g冷凍離心30 min，取上清液測定λex/λem＝340 nm/465 nm波長處熒光值?？瞻捉M以PBS代替還原糖，所有實(shí)驗(yàn)均做3 組平行。

1.3.1.2 糖質(zhì)量濃度對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

在樣品管中加入11S球蛋白、不同質(zhì)量濃度的葡萄糖和PBS各2 mL，使體系中11S球蛋白的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，葡萄糖的終質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8 mg/mL，后續(xù)操作同1.3.1.1節(jié)。

1.3.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

在樣品管中加入11S球蛋白、葡萄糖和PBS各2 mL，使11S球蛋白和葡萄糖的終質(zhì)量濃度分別為2 mg/mL和4 mg/mL，分別于60 ℃水浴鍋、100 ℃沸水浴、121 ℃油浴鍋中反應(yīng)，后續(xù)操作同1.3.1.1節(jié)。

1.3.1.4 pH值對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

分別用pH 6.5、7.2、9.2，濃度為0.2 mol/L的PBS溶解11S球蛋白和葡萄糖。反應(yīng)體系及其他操作同1.3.1.3節(jié)。

1.3.1.5 黃酮類化合物對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

在1.3.1.3節(jié)體系中，分別加入槲皮素、木犀草素、染料木素、蘆丁，使其終濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mmol/L，將反應(yīng)物于100 ℃沸水浴中反應(yīng)120 min，其他操作同上。糖基化組以PBS代替黃酮，計(jì)算抑制率，公式如式（1）所示。

式中：F0為糖基化組熒光值；F為抑制組熒光值。

1.3.2 槲皮素抑制大豆11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成機(jī)理

1.3.2.1 LC-MS/MS分析槲皮素抑制AGEs生成機(jī)理

樣品制備同1.3.1.5節(jié)操作配制11S球蛋白-葡萄糖-槲皮素體系，使槲皮素終濃度為1 mmol/L，100 ℃沸水浴中反應(yīng)120 min后，冰水冷卻，精確量取2 mL樣品，加入4 mL乙酸乙酯，渦漩混勻，超聲10 min萃取，取上清液并氮吹除去溶劑，放入-80 ℃冰箱備用。測定前用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇水溶液復(fù)溶，過濾膜收集濾液，用LC-MS/MS分析。

液相色譜條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（含有體積分?jǐn)?shù)1‰的甲酸）為流動(dòng)相（A）進(jìn)行梯度洗脫檢測，然后以水（含有體積分?jǐn)?shù)1‰的甲酸）為流動(dòng)相（B）。梯度洗脫：0～5 min（10% A），5～40 min（70% A），40～50 min（90% A）。柱溫20 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長掃描200～400 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子化（ESI－）檢測，掃描范圍為m/z 50～1 000；噴霧電壓4 000 V，霧化氣壓45 psi，輔助氣壓力5 psi，毛細(xì)管溫度280 ℃，裂解電壓135 V，紫外檢測：波長為370 nm。

1.3.2.2 大豆11S球蛋白糖基化過程及槲皮素的抑制作用

依據(jù)文獻(xiàn)[22]方法，如1.3.1.3節(jié)方法制備大豆11S球蛋白-葡萄糖體系，于100 ℃沸水浴中反應(yīng)0、5、10、20、30、60 min，分別取樣1 mL于樣品管，14 000 r/min離心10 min，取沉淀，加入100 μL樣品緩沖液，高速振蕩混勻，100 ℃沸水浴中反應(yīng)5 min，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。采用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后用凝膠成像儀拍攝凝膠，進(jìn)而對(duì)圖像進(jìn)行分析。

于上述體系中添加槲皮素，使其最終濃度分別為0.1、0.5、1.0 mmol/L，在100 ℃沸水浴中反應(yīng)60 min，如上同樣方法處理樣品，SDS-PAGE檢測槲皮素在100 ℃條件下反應(yīng)60 min后的作用效果。

1.3.3 大豆11S改性蛋白乳化性質(zhì)

1.3.3.1 樣品制備

同1.3.1.1節(jié)實(shí)驗(yàn)方法于100 ℃沸水浴中反應(yīng)60、120 min，制備添加和不添加槲皮素的11S球蛋白糖基化產(chǎn)物，冷凍干燥。

1.3.3.2 乳化活性測定

分別取未改性的11S球蛋白粉、糖基化蛋白、添加槲皮素的糖基化產(chǎn)物溶于0.2 mol/L、pH 7.2的PBS中，使得蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL，將6 mL樣品溶液和2 mL大豆油放入離心管中，高速勻漿1 min，立即從勻漿液底部吸取50 μL加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的SDS溶液中，混勻后在500 nm波長處測定吸光度A0，帶入公式（2）計(jì)算乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI），以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS溶液作為空白對(duì)照，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

式中：ρ是蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；d為光徑（1 cm）；φ為大豆油所占體積分?jǐn)?shù)（25%）；稀釋倍數(shù)為100；A0為乳狀液在0 min時(shí)的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013和SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用Duncan法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光法分析11S球蛋白糖基化過程中AGEs的形成

2.1.1 糖種類對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

由圖1可見，不同的糖對(duì)體系中熒光性AGEs的量存在顯著性差異，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，熒光性AGEs的量增大，且各種糖之間的差異性呈現(xiàn)遞增的趨勢。其中，大豆11S球蛋白-果糖體系，熒光性AGEs的相對(duì)熒光強(qiáng)度最高，其次為葡萄糖、乳糖，蔗糖相對(duì)熒光強(qiáng)度最低，這與Bierhaus等[23]研究果糖產(chǎn)生AGEs量高于葡萄糖相一致；Srey等[24]也證明在美拉德反應(yīng)中五碳糖反應(yīng)活性高于六碳糖，且單糖比雙糖更易發(fā)生糖基化反應(yīng)[25]。另外，葡萄糖、果糖和乳糖較蔗糖形成AGEs多，說明還原性糖比非還原性糖反應(yīng)活性更高。因此，建議在大豆11S球蛋白改性過程中盡量選用低反應(yīng)活性的糖。

圖1 糖種類對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響Fig. 1 Effect of sugar type on the formation of AGEs

2.1.2 糖質(zhì)量濃度對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

圖2 還原糖質(zhì)量濃度對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響Fig. 2 Effect of reducing sugar concentration on the formation of AGEs

由圖2可知，大豆11S球蛋白-葡萄糖模型中，葡萄糖的質(zhì)量濃度與熒光性AGEs形成量呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為8 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，AGEs的生成量約為2 mg/mL葡萄糖的1.5 倍。隨著糖質(zhì)量濃度在反應(yīng)體系中的增加，糖分子與大豆11S球蛋白游離氨基充分接觸，從而有助于反應(yīng)的進(jìn)行[26]。在不影響改性效果的基礎(chǔ)上，選擇大豆11S球蛋白、葡萄糖低配比（質(zhì)量濃度分別為2、2 mg/mL和2、4 mg/mL）進(jìn)行改性。

2.1.3 溫度對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

圖3 溫度對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響Fig. 3 Effect of temperature on the formation of AGEs

不同溫度（60～121 ℃）對(duì)11S球蛋白與葡萄糖模擬體系中熒光性AGEs的產(chǎn)生存在顯著性差異（P＜0.05），特別是在100 ℃以上，隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，體系中熒光性AGEs的量大幅增加[27]，而在中低溫條件下（60 ℃）熒光性AGEs的生成量變化不大（圖3）。這與Ho等[28]研究的當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，加工溫度對(duì)AGEs的生成量沒有顯著性影響，但當(dāng)加工溫度升高至150～200 ℃之間時(shí)，隨著溫度的升高，食品中的AGEs生成量呈顯著性升高趨勢相一致。一般反應(yīng)溫度在小于等于90 ℃時(shí)反應(yīng)速率較慢，大于等于90 ℃時(shí)反應(yīng)速率較快[29-31]。Ledl等[32]研究證明溫度每升高10 ℃，糖基化反應(yīng)速率至少增加一倍。

2.1.4 pH值對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響

圖4 pH值對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響Fig. 4 Effect of pH on the formation of AGEs

如圖4所示，pH值越大，體系中熒光性吸收越高，pH 9.2條件下熒光性AGEs的生成量最多。有文獻(xiàn)報(bào)道，在中等水分條件下，糖基化反應(yīng)的最適pH值為7.8～9.2[33]。在偏酸環(huán)境中，溶液中的氨基處于質(zhì)子化狀態(tài)，使得N-葡基胺難以形成，糖基化反應(yīng)難以進(jìn)行；而在中性偏堿的反應(yīng)環(huán)境則最有利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行[34]。大豆11S球蛋白在pH 7.2時(shí)溶解度最大，且從食品安全角度考慮，選擇pH 7.2為糖基化最適pH值。

2.1.5 黃酮對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs的抑制作用

圖5 黃酮對(duì)11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成的影響Fig. 5 Effect of flavonoids on the formation of AGEs

添加黃酮后對(duì)AGEs的抑制效果如圖5所示，同種黃酮隨著濃度的增加，體系中的AGEs生成量均減少，即抑制率與添加量呈現(xiàn)量效關(guān)系。在各濃度下，槲皮素抑制效果最好，染料木素與木犀草素抑制效果較為接近，蘆丁抑制率在四者中最低。當(dāng)濃度為1.00 mmol/L時(shí)，對(duì)AGEs的抑制率均達(dá)到60%以上。槲皮素濃度為0.10 mmol/L時(shí)，即可達(dá)到半抑制率，濃度升高至0.50、1.00、5.00 mmol/L時(shí)，抑制率可分別達(dá)到77%、86%和94%。這與Kong Yanghui等[35]用染料木素抑制β-乳球蛋白糖基化過程中生成的AGEs，其抑制效果在一定范圍內(nèi)與抑制劑的濃度呈正相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 槲皮素抑制大豆11S球蛋白糖基化過程中AGEs形成機(jī)理

2.2.1 LC-MS/MS分析槲皮素抑制AGEs生成機(jī)理

圖6 槲皮素在11S球蛋白糖基化過程中結(jié)構(gòu)變化液相色譜圖Fig. 6 Liquid chromatogram of quercetin derivatives during glycosylation of 11S globulin

圖7 槲皮素在11S球蛋白糖基化過程中產(chǎn)物變化質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectra of quercetin derivatives during glycosylation of 11S globulin

為了研究槲皮素抑制AGEs生成的機(jī)理，將槲皮素添加到11S球蛋白-葡萄糖體系中，在100 ℃下反應(yīng)120 min后用LC-MS/MS進(jìn)行分析。如圖6所示，除槲皮素主峰（tR27.60 min），體系中出現(xiàn)tR21.04、21.34 min的兩個(gè)色譜峰，在MS1（圖7A、B）中，ESI-MS（m/z）準(zhǔn)分子離子峰是445[M—H]-，相對(duì)分子質(zhì)量比槲皮素高144（2 個(gè)MWMGO），MS2中出現(xiàn)m/z 301（槲皮素）碎片離子峰，推測其為槲皮素與兩個(gè)MGO的加合物。在tR23.81、24.06、28.69 min的3 個(gè)色譜峰，MS1（圖7C、D、E）中，ESI-MS（m/z）準(zhǔn)分子離子峰是373[M-H]-，相對(duì)分子質(zhì)量比槲皮素高72（MWMGO），MS2中均出現(xiàn)m/z 301（槲皮素）碎片離子峰，推測其為槲皮素與一個(gè)MGO的加合物。MGO是糖基化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的活性中間產(chǎn)物，是AGEs的前體物質(zhì)[36]。槲皮素通過捕獲糖基化過程中產(chǎn)生的高活性反應(yīng)因子MGO，進(jìn)而抑制AGEs的形成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期的報(bào)道槲皮素抑制體系中MGO（抑制率80.1%）[37]相一致。

2.2.2 SDS-PAGE定性分析大豆11S球蛋白糖基化的變化及槲皮素的抑制效果

圖8 糖基化對(duì)大豆11S球蛋白蛋白結(jié)構(gòu)的影響及槲皮素抑制作用Fig. 8 Effect of glycosylation on protein structure of soybean 11S globulin and inhibitory effect of quercetin

如圖8所示，SDS-PAGE圖在20 min后大豆11S球蛋白的亞基條帶開始逐漸變?nèi)酰纬傻慕宦?lián)蛋白由于分子質(zhì)量過大而無法進(jìn)入凝膠，此時(shí)在濃縮膠頂部開始出現(xiàn)條帶，特別是在60 min時(shí)更加明顯。由此推測糖基化引起大豆11S球蛋白的交聯(lián)，分子質(zhì)量增大，且交聯(lián)程度不同導(dǎo)致交聯(lián)蛋白分子質(zhì)量不同[38]。Akhtar等[39]報(bào)道蛋白和糖發(fā)生糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖，出現(xiàn)新的電泳條帶，部分條帶消失，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果相近。

在添加槲皮素（0.1、0.5、1.0 mmol/L）后，大豆11S球蛋白亞基條帶保留清晰可見，高分子蛋白較糖基化組減少，添加濃度為1.0 mmol/L時(shí)，11S球蛋白各亞基條帶與未添加槲皮素相比顏色加深，而高分子蛋白質(zhì)幾乎沒有產(chǎn)生。表明槲皮素對(duì)蛋白質(zhì)大分子交聯(lián)有一定抑制作用，即抑制了高活性反應(yīng)因子MGO引發(fā)的蛋白質(zhì)大分子交聯(lián)。

2.3 大豆11S改性蛋白乳化性質(zhì)

表1 糖基化產(chǎn)物與槲皮素抑制產(chǎn)物的乳化性質(zhì)Table 1 Emulsifying properties of glycosylation products formed in the presence and absence of quercetin

從表1可知，糖基化反應(yīng)60 min后，乳化活性提高了0.7 倍，120 min后，提高1.6 倍，表明糖基化改性有效改善蛋白的乳化活性。Diftis等[40]研究證明糖基化后蛋白質(zhì)乳化活性提高主要是由于其溶解性增加。同時(shí)，11S球蛋白與葡萄糖共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物表面疏水性降低，空間結(jié)構(gòu)變得松散，使蛋白質(zhì)分子更為親水，分子流動(dòng)性增加，從而可以較快吸附于油-水界面，表現(xiàn)出更高的乳化活性。添加槲皮素后，反應(yīng)60 min，改性蛋白乳化活性與未添加相差不大，但熒光強(qiáng)度顯著降低，抑制率達(dá)到77%；反應(yīng)120 min后，其乳化活性雖然低于未添加的糖基化組，但仍明顯高于未改性的蛋白質(zhì)，熒光性AGEs抑制率高達(dá)到86%，推測可能是隨著時(shí)間延長槲皮素捕獲MGO的量增大，從而抑制了由MGO誘發(fā)的熒光性AGEs的形成，但不影響糖對(duì)蛋白的修飾改性，故而乳化活性仍維持在一定水平。

3 結(jié) 論

大豆11S球蛋白糖基化改性過程中會(huì)產(chǎn)生有害產(chǎn)物熒光性AGEs。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間一定時(shí)，反應(yīng)溫度和還原糖濃度越高，產(chǎn)生熒光性AGEs的強(qiáng)度就越高，pH值偏大的條件下AGEs的量增大；因此，在大豆蛋白的糖基化改性和加工過程中，盡量選擇低溫、低糖、低pH值，以便降低有害產(chǎn)物AGEs的形成。此外，添加食源性黃酮如槲皮素等，對(duì)熒光性AGEs的形成具有良好的抑制效果，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。通過SDS-PAGE和LC-MS/MS方法，表明槲皮素通過捕獲糖基化中間產(chǎn)物MGO形成加合物，進(jìn)而抑制可能由于MGO引起的大分子交聯(lián)AGEs的生成，并保留了糖對(duì)蛋白的修飾改性，提高了乳化性能。本研究為提高大豆食品安全性，降低加工和改性過程中有害AGEs的形成提供了理論依據(jù)和新的思路。

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