高 超 趙曉曦 劉曙光 張?jiān)?林 巍 張瑞東

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是B和T淋巴細(xì)胞分化阻滯于某一不成熟階段，并且發(fā)生克隆性擴(kuò)增的血液系統(tǒng)惡性疾病。淋巴細(xì)胞發(fā)育的早期階段發(fā)生體細(xì)胞V(D)J重排，可產(chǎn)生具有高度多樣性的抗原受體，即免疫球蛋白(Ig)和T細(xì)胞受體(TCR)。雖然Ig和TCR基因重組機(jī)制相同，但在正常情況下，B和T系的系別特異性在發(fā)育分化過(guò)程中被嚴(yán)格調(diào)控，Ig和TCR基因重排，也被稱為免疫基因型，分別是B和T淋巴細(xì)胞特異性的標(biāo)志，但在惡性淋巴細(xì)胞中則可出現(xiàn)跨系表達(dá)的特點(diǎn)[1]。Ig和TCR基因克隆性重排的檢測(cè)可作為臨床診斷白血病和淋巴瘤的輔助指標(biāo)，并且作為分子靶標(biāo)廣泛應(yīng)用于ALL的微小殘留病(MRD)監(jiān)測(cè)[2-5]。既往研究顯示，兒童B細(xì)胞前體-ALL(BCP-ALL)Ig和TCR重排模式與患兒年齡和特定的染色體易位相關(guān)[6-7]，其克隆特性還與患者的預(yù)后有關(guān)[8]。

BCP-ALL根據(jù)白血病細(xì)胞的發(fā)育階段可分為祖B(pro-B)ALL、普通B(common-B)ALL和前B(pre-B)ALL 3個(gè)類型，其中祖B-ALL為最不成熟的B淋巴細(xì)胞原始細(xì)胞，CD10不表達(dá)，由于其在BCP-ALL中的發(fā)病率較低，因此其Ig和TCR基因重排特點(diǎn)尚缺少詳細(xì)的研究報(bào)道。此外，雖然祖B-ALL的免疫表型相同，但患者的免疫基因型卻可能存在差異。本研究對(duì)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)收治的祖B-ALL初診患兒的IgH、IgK、IgL、TRD、TRG和TRB基因重排發(fā)生率及克隆特性進(jìn)行分析，并探討其與患兒臨床和生物學(xué)特征及預(yù)后的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡明祖B-ALL發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 知情同意和倫理 本研究進(jìn)行Ig和TCR基因重排檢測(cè)和臨床資料收集均取得患兒監(jiān)護(hù)人的知情同意。研究方案獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①2003年4月至2009年12月我院收治的祖B細(xì)胞ALL初診患兒；②生物樣本庫(kù)有足量的臨床檢查剩余骨髓樣本用于進(jìn)行Ig和TCR基因重排檢測(cè)。

1.3 分組 以初診IgH、IgK、IgL、TRD、TRG和TRB基因重排情況作為分組依據(jù)，各標(biāo)志中檢出單克隆、雙克隆和寡克隆重排[9]者為陽(yáng)性組；多克隆[9]和無(wú)重排者為陰性組。陽(yáng)性組根據(jù)重排克隆特性分為單克隆亞組和雙/寡克隆亞組。

1.4 Ig和TCR重排分析

1.4.1 骨髓樣本基因組DNA提取 根據(jù)DNA提取試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)說(shuō)明書(shū)提取骨髓凍存樣本的基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣本的純度和濃度。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 采用BIOMED-2研究[9]中的多重PCR引物擴(kuò)增Ig和TCR基因，包括①IgH：VH-DH-JH、DH-JH；②IgK：VK-JK、VK-Kde、Intr-Kde；③IgL：Vλ-Jλ；④TRD：Vδ-Dδ-Jδ、Vδ-Jδ、Vδ-Dδ、Dδ-Dδ；⑤TRG：Vγ-Jγ；⑥TRB：Vβ-Dβ-Jβ、Vβ-Jβ、Dβ-Jβ。其中，V(D)J為完全重排，DD或DJ為不完全重排。PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表1，使用Roche公司所產(chǎn)Taq酶及其配套緩沖液。PCR反應(yīng)條件：95℃ 7 min，95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)。

表1 多重PCR 方法檢測(cè)Ig/TCR基因重排反應(yīng)體系

1.4.3 異源雙鏈反應(yīng)和電泳分析 將PCR產(chǎn)物于95℃變性5 min，迅速置于冰上1 h，進(jìn)行異源雙鏈反應(yīng)。取5 μL反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物行6%丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓100伏，90 min。電泳結(jié)束后，采用銀染法進(jìn)行顯色分析。

1.4.4 結(jié)果判讀[9]在目的片段位置出現(xiàn)單一條帶且邊緣清晰者為單克隆基因重排，出現(xiàn)2條為雙克隆或雙等位基因重排，2條以上條帶為寡克隆重排，目的條帶位置上方為模糊涂片樣為多克隆重排。

1.4.5 克隆性重排序列分析 克隆性重排樣本經(jīng)純化后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，采用ABI PRISM 3730型測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，序列經(jīng)BLAST和IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

1.5 免疫表型檢測(cè) 取肝素抗凝骨髓2 mL(標(biāo)本中原始及幼稚細(xì)胞≥30%)，分離單個(gè)核細(xì)胞，將骨髓細(xì)胞濃度調(diào)至2×107·mL-1，取50 μL骨髓液與異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的單克隆抗體各1種(每種20 μL)以及10 μL PC5標(biāo)記的CD45單克隆抗體混勻，室溫反應(yīng)30 min，清洗1次，加入100 μL多聚甲醛固定15 min，離心棄上清，加入溶血?jiǎng)┝呀饧t細(xì)胞，離心棄上清，最后加入1%多聚甲醛1.5 mL，置于流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，Becton Dickinson公司產(chǎn)品)檢測(cè)并分析。胞漿抗原的檢測(cè)參照IntraPrepTM滲透劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光抗體及滲透劑購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司和美國(guó)Pharmingen公司。所用抗體包括FITC標(biāo)記的MsIgG1(同型對(duì)照)、CD2、CD7、CD10、CD20、CD33、HLA-DR、CyIgM、Igλ、MPO，PE標(biāo)記的MsIgG1(同型對(duì)照)、CD5、CD13、CD19、CD22、CD34、CD41、CD117、CD170、CyCD3、CyCD79a。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：淋系、髓系、干/祖細(xì)胞抗原陽(yáng)性細(xì)胞≥20%，胞漿染色抗原陽(yáng)性細(xì)胞≥10%。分型標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲白血病免疫分型協(xié)作組的積分原則(EGIL)[10]。

1.6MLL基因重排檢測(cè)[11]分離患兒初診骨髓樣本中的單個(gè)核細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒 (美國(guó)Life Technology公司)說(shuō)明提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度。采用隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物 (美國(guó)Invitrogen公司)將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用巢式PCR擴(kuò)增和6%丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色方法鑒定MLL基因重排是否存在及其類型。

1.7 Ig/TCR基因重排相關(guān)因素采集 參照我院急性淋巴細(xì)胞白血病2003(BCH-ALL-2003)和中國(guó)兒童白血病治療協(xié)作組急性淋巴細(xì)胞白血病2008(CCLG-ALL-2008)方案分層標(biāo)準(zhǔn)[12]，本文采集可能影響祖B-ALL患兒Ig/TCR基因重排的臨床和生物學(xué)因素：①性別；②年齡；③初診外周血WBC計(jì)數(shù)；④MLL基因重排；⑤免疫表型分子標(biāo)記。并采集可能受Ig/TCR基因重排影響的結(jié)局指標(biāo)：①臨床治療危險(xiǎn)度；②潑尼松反應(yīng)；③誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)(第33 d)MRD；④鞏固治療開(kāi)始時(shí)(第78 d)MRD；⑤預(yù)后。

1.8 隨訪 入組患兒根據(jù)病歷記錄隨訪其是否發(fā)生復(fù)發(fā)和死亡，如無(wú)上述不良事件發(fā)生，則通過(guò)電話隨訪其預(yù)后情況，截止日期為2018年6月30日。無(wú)事件生存(EFS)觀察時(shí)間為自診斷之日起至發(fā)生事件之日或研究隨訪截止日期。事件定義為死亡、復(fù)發(fā)或第二腫瘤。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用精確概率法χ2檢驗(yàn)比較陽(yáng)性組與陰性組初診臨床特征，潑尼松反應(yīng)及誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)和鞏固治療開(kāi)始前MRD的差異。生存率分析采用Kaplan-Meier法；Ig和TCR重排陽(yáng)性組和陰性組間EFS的比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)的祖B-ALL初診患兒40例，其中男25例(62.5%)；中位年齡4歲8個(gè)月(7個(gè)月至13歲3個(gè)月)。30例(75.0%)接受BCH-ALL-2003方案，10例(25.0%)接受CCLG-ALL-2008方案規(guī)范治療。28例(70.0%)處于長(zhǎng)期持續(xù)緩解狀態(tài)，10例(25.0%)骨髓復(fù)發(fā)，2例(5.0%)中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)。

2.2 Ig和TCR基因重排檢出率和克隆特性 40例祖B-ALL患兒均檢測(cè)到至少1種Ig或TCR克隆性重排，其中37例(92.5%)檢出Ig基因重排，29例(72.5%)檢出TCR基因重排；26例(65.0%)同時(shí)檢出Ig和TCR基因重排。表2顯示，IgH基因重排檢出率最高(90.0%)，單克隆重排率為52.8%，完全重排和不完全重排分別為31和11例，其中6例同時(shí)具有完全和不完全重排；其次為T(mén)RD基因重排(52.5%)，但其單克隆性重排比例為95.2%，重排類型主要為Vδ-Dδ和Dδ-Dδ不完全重排。IgK中VK-JK和VK-Kde/Intr-Kde重排發(fā)生率分別為20.0%和25.0%。TRB中完全重排和不完全重排比例分別為12.5%和7.5%，1例患兒同時(shí)具有上述兩種重排。

表2 祖B-ALL患兒Ig和TCR基因重排檢出率及克隆特性[n(%)]

2.3 Ig和TCR基因重排與臨床和生物學(xué)特征的關(guān)系 表3顯示，TRD基因重排陽(yáng)性患兒白血病細(xì)胞表達(dá)CD22的頻率顯著低于TRD基因未重排者，分別為38.1%(8/21)和73.7%(14/19)，P=0.031。與陰性組相比，TRD重排陽(yáng)性患兒高WBC的比例較高，IgK重排陽(yáng)性患兒CD22表達(dá)陽(yáng)性者比例較高，TRB重排陽(yáng)性患兒伴有髓系或T系跨系標(biāo)記的比例較高，14例MLL基因重排陽(yáng)性患兒均未發(fā)生TRB基因重排。Ig和TCR基因重排與其他臨床和生物學(xué)特征，以及潑尼松反應(yīng)和MRD水平無(wú)相關(guān)性(表3)。

2.4 Ig和TCR重排與患兒預(yù)后的關(guān)系 40例祖B-ALL患兒隨訪中位時(shí)間為132(3～180)個(gè)月， 5年EFS為(72.4±7.1)%。各Ig和TCR基因克隆性重排均不與患兒預(yù)后相關(guān)(表4)。如表4和圖1所示，IgH雙/寡克隆重排亞組5年EFS顯著低于IgH單克隆重排亞組，(58.8±12.3)%vs(84.2±8.4)%，P=0.044。其他標(biāo)志因單克隆和雙克隆/寡克隆重排檢出的例數(shù)較少，未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表3 祖B-ALL患兒Ig和TCR克隆性重排與臨床生物學(xué)特征及預(yù)后的相關(guān)性(n)

表4 祖B-ALL患者Ig和TCR基因重排對(duì)EFS的影響

圖1 祖B-ALL患兒IgH基因重排特性對(duì)預(yù)后的影響

3 討論

歐洲白血病治療協(xié)作組BIOMED-2研究顯示，多重PCR檢測(cè)可使Ig/TCR基因重排的檢出率達(dá)到100%[9]。本研究采用該引物體系，結(jié)合異源雙鏈分析和測(cè)序，40例祖B-ALL患兒均檢測(cè)到至少1種克隆性Ig/TCR基因重排，提示這一方法適合于臨床應(yīng)用。

本研究祖B-ALL患兒IgH、VK-JK和IgL的檢出率與文獻(xiàn)報(bào)道的兒童B前體-ALL相似，但是VK-Kde/Intr-Kde和跨系表達(dá)的TRD、TRG、TRB的發(fā)生率均顯著低于B前體-ALL，祖B-ALL患兒分別為25%、52.5%、30%和17.5%，B前體-ALL患兒分別為43%、71%、60%和34%[10]。此外，本研究祖B-ALL患兒IgH不完全重排DH-JH的發(fā)生率高于文獻(xiàn)報(bào)道的B前體-ALL，完全重排VH-DH-JH則較低[13]。以上結(jié)果提示，免疫表型不同的BCP-ALL，其Ig和TCR基因重排類型也不同，免疫表型更不成熟的祖B-ALL，其免疫基因型也更不成熟。

正常的祖B細(xì)胞不表達(dá)CD19，前B-Ⅰ細(xì)胞已表達(dá)CD10；而祖B-ALL已表達(dá)CD19，尚未表達(dá)CD10，故其免疫表型對(duì)應(yīng)的分化階段在正常的祖B細(xì)胞和前B-Ⅰ之間。正常的Ig基因重排開(kāi)始于前B-Ⅰ，先發(fā)生DH-JH基因重排，然后是VH-DH-JH，IgK和IgL重排發(fā)生在前B-Ⅱ階段。本研究結(jié)果顯示，祖B-ALL患兒IgH、IgK和IgL重排的發(fā)生率分別為90%、32.5%和10%，提示祖B-ALL的免疫基因型不能完全反映其對(duì)應(yīng)階段正常B細(xì)胞的免疫基因型，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是祖B-ALL細(xì)胞丟失了對(duì)功能性重排的正確選擇和重組酶系統(tǒng)的持續(xù)激活[14]。此外，由于白血病細(xì)胞中的重組酶持續(xù)激活，還可能導(dǎo)致診斷后發(fā)生克隆演化。

本研究祖B-ALL患兒跨系TCR基因重排的比例為72.5%，與Meleshko等[15]在兒童BCP-ALL中報(bào)道的80%相近。在正常T淋巴細(xì)胞中，TCR基因重排發(fā)生的先后順序?yàn)門(mén)RD、TRG和TRB，而研究顯示存在于BCP-ALL中的TCR重排在正常的B前體細(xì)胞也存在，可能是白血病細(xì)胞中的生理性重組，且這一重組的生理順序又比較保守[16]。本研究結(jié)果顯示，祖B-ALL中TRD、TRG和TRB重排的發(fā)生率逐漸降低，依次為52.5%、30%和17.5%，這與祖B細(xì)胞分化阻滯于最不成熟的B淋巴細(xì)胞階段相吻合，同時(shí)也提示，同為相同免疫表型的祖B-ALL，其白血病細(xì)胞的分化時(shí)期仍有差異，發(fā)生TRD重排的白血病細(xì)胞阻滯階段可能早于TRB重排者。

既往兒童BCP-ALL中的研究顯示，與3～10歲患兒相比，<3歲或>10歲患兒DH-JH的比例較高，IgK、TRG和TRD重排發(fā)生的比例較低，而產(chǎn)生這一年齡差異的原因在于，<3歲患兒祖B-ALL的比例較高，而祖B-ALL的不完全I(xiàn)gH重排發(fā)生率高，完全重排的比例低；且少有IgK、TRG和TRD重排[6]。但是，其他的研究并未發(fā)現(xiàn)BCP-ALL患兒年齡與Ig和TCR重排的相關(guān)性[17]。本研究祖B-ALL患兒無(wú)論按照1～10歲，還是參照文獻(xiàn)3～10歲進(jìn)行分類(各標(biāo)志重排陽(yáng)性與陰性患兒P值均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果未在本文顯示)，均未發(fā)現(xiàn)年齡與基因重排的相關(guān)性，提示影響重排類型的因素在于免疫表型等生物學(xué)因素，而與年齡相關(guān)性不大。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞分化標(biāo)志CD22的表達(dá)與基因重排具有相關(guān)性，CD22陽(yáng)性患兒TRD基因重排的發(fā)生率顯著低于陰性患兒，而IgK基因重排的比例高于陰性患兒，提示發(fā)生TRD基因重排的祖B白血病細(xì)胞分化阻滯發(fā)生的時(shí)期較早。

多個(gè)研究均證實(shí)Ig和TCR基因重排與特定的融合基因具有相關(guān)性。Hubner等[18]研究顯示，TEL-AML1+白血病Ig和TCR重排的發(fā)生率較高，且重排模式獨(dú)特；Alexander等[15]研究顯示，E2A-PBX1陽(yáng)性患兒很少發(fā)生TRG基因重排。本研究祖B-ALL患兒中，MLL基因重排的比例較高(14/40，35%)，且14例MLL重排陽(yáng)性患兒均未見(jiàn)TRB基因重排，提示MLL重排陽(yáng)性患兒白血病細(xì)胞阻滯的階段可能更早。Jansen等[13]在嬰兒ALL中的研究顯示，MLL-AF4和MLL-ENL陽(yáng)性患兒Ig和TCR表現(xiàn)為不成熟的重排形式，而MLL-AF9陽(yáng)性者則主要是成熟的重排形式。

本研究并未發(fā)現(xiàn)Ig或TCR基因重排與祖B-ALL患兒的預(yù)后相關(guān)，但發(fā)現(xiàn)IgH雙/寡克隆患兒預(yù)后差于單克隆患兒，這與Green等[8]在兒童B前體ALL中報(bào)道的結(jié)果一致，即寡克隆/亞克隆患兒的復(fù)發(fā)率高達(dá)65%，5年EFS比單克隆患兒低40%。雙/寡克隆的白血病細(xì)胞來(lái)源于不同分化時(shí)期，形成2個(gè)或以上克隆，在兒童B-ALL中的發(fā)生率較高[19,20]，IgH不完全重排為30%～40%，完全重排可達(dá)50%～60%，其預(yù)后差于單克隆重排患者，提示雙/寡克隆重排的惡性克隆更不穩(wěn)定。

本研究通過(guò)多重PCR結(jié)合異源雙鏈和測(cè)序的方法，對(duì)祖B-ALL患兒Ig/TCR基因重排特點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其與患兒臨床和生物學(xué)特征具有相關(guān)性，且IgH雙/寡克隆性重排患兒預(yù)后不良，從而為祖B-ALL患兒的診斷治療及預(yù)后提供了重要信息。