高義霞,陶超楠,鄭 婷,朱玉芳,周向軍，*

(1.天水師范學院生物工程與技術(shù)學院,甘肅天水 741001;2.甘肅省大櫻桃工程技術(shù)研究中心,甘肅天水 741001)

α-淀粉酶是一種隨機水解α-1,4糖苷鍵的Ca2+依賴性內(nèi)切淀粉酶,其催化淀粉轉(zhuǎn)化生成少量葡萄糖和糊精,已廣泛用于食品、化工等行業(yè)中。目前,國內(nèi)外有關(guān)α-淀粉酶的研究,主要集中在其高產(chǎn)菌篩選和鑒定、基因重組、表達及其抑制劑等方面[1-6]。α-淀粉酶抑制劑是一種糖苷酶抑制劑,可有效抑制消化道內(nèi)淀粉酶活性,阻止食物糖類的水解和吸收,降低人體血糖含量,抑制脂肪合成,臨床上常用于糖尿病、肥胖癥、高血糖和高血脂等疾病預(yù)防[7-8]。

乳苣(MulgediumtataricumL.)，又名蒙山萵苣、紫花山萵苣及苦菜等,為菊科乳苣屬藥食兩用草本植物。乳苣全草可藥用,主要化學成分為倍半萜和三萜類化合物[9],具有抗菌、抗癌及消炎等作用[10-12]。山楂葉、白蕓豆等活性成分對α-淀粉酶具有一定抑制作用[13-14],但有關(guān)乳苣中α-淀粉酶抑制劑的研究還未見報道。研究不同溶劑乳苣提取物對α-淀粉酶的抑制作用、動力學及作用機制等,不僅有助于從不同角度探討酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,且為尋找天然、安全降糖藥物提供重要的科學依據(jù)。

本實驗以乳苣全草為材料,α-淀粉酶為研究對象,研究水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶的抑制作用、類型、動力學參數(shù)、紫外光譜和表面疏水性等影響,旨在為糖尿病、肥胖癥和高血脂等疾病預(yù)防提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

乳苣(MulgediumtataricumL.) 甘肅省白銀市靖遠縣農(nóng)田和水渠邊,經(jīng)鑒定為菊科乳苣屬乳苣。乳苣全草,室溫風干,粉碎,過80目篩備用；α-淀粉酶(58.7 U/mg)、8-苯胺-1-萘磺酸(>97%純度) Sigma產(chǎn)品;可溶性淀粉、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉和亞硫酸氫鈉 國產(chǎn)分析純；3,5-二硝基水楊酸(DNS) 甲液:6.9 g結(jié)晶苯酚溶于15.2 mL 10% NaOH溶液,蒸餾水稀釋至69 mL,再加入6.9 g亞硫酸氫鈉；乙液:225 g酒石酸鉀鈉溶于300 mL 10% NaOH溶液,再加入880 mL 1% 3,5-二硝基水楊酸溶液，混合甲乙溶液,棕色瓶放置一周后使用；0.05 mol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液:七水合磷酸氫二鈉3.35 g,二水合磷酸二氫鈉1.95 g,450 mL蒸餾水溶解,調(diào)pH6.8,蒸餾水定容至500 mL。

UV1800型紫外可見分光光度計、RF-5301PC型熒光分光光度計 日本島津;AL204精密分析天平 瑞士梅特勒;電熱恒溫水浴鍋:上海精宏實驗設(shè)備有限公司;雷磁PHS-3D型pH計 上海精密科學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1α-淀粉酶反應(yīng)進程曲線制作 采用Bernfeld法[15],稍作修改。取11.4 mL 0.05 mol/L pH6.8磷酸緩沖液于50 mL三角瓶中,加入0.6 mL 0.5 mg/mLα-淀粉酶液,充分混勻,50 ℃水浴20 min。加入3.0 mL 1%可溶性淀粉(預(yù)先經(jīng)50 ℃水浴)作為底物,混勻計時。酶促進程曲線制作：前5 min每隔30 s,后5 min每隔1 min,取0.5 mL酶解液沸水滅活3 min,加入DNS試劑1.0 mL,沸水5 min,加水補至5.0 mL后540 nm測吸光值,制作酶促進程曲線,確定線性時間。

1.2.2 乳苣提取物制備及其對α-淀粉酶的抑制作用 乳苣的水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物制備參考高義霞等方法[16]。取0.05 mol/L pH6.8磷酸緩沖液3.8 mL,加入0.5 mg/mLα-淀粉酶0.2 mL,混勻后加入各提取物(水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物)，使其終濃度分別為0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL,充分混勻,50 ℃水浴20 min,加入50 ℃預(yù)熱的1%可溶性淀粉溶液1.0 mL,1.5 min后沸水滅活,加入DNS試劑1 mL,沸水5 min,室溫中冷卻后,蒸餾水定補至5.0 mL,520 nm處測吸光值。以0.2 mL磷酸鹽緩沖溶液代替酶液,作為空白對照。α-淀粉酶抑制率(%)=(A0-A1)/A0×100。式中:A0為未添加提取物吸光值,A1為添加提取物吸光值。

1.2.3 乳苣提取物對α-淀粉酶的抑制類型和動力學參數(shù) 取1%可溶性淀粉1.0 mL,分別測定0.0、0.5、2.0、4.0 mg/mL各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)時,α-淀粉酶活性隨其濃度變化趨勢,以酶含量為橫坐標,吸光值為縱坐標,判斷不同提取物對α-淀粉酶的抑制類型。固定α-淀粉酶濃度為0.02 mg/mL,測定可溶性淀粉濃度分別為0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL時,水和石油醚提取物對應(yīng)的Ki,可溶性淀粉濃度分別為0.5、1.0和2.0 mg/mL時,正丁醇提取物對應(yīng)的Kis或Ki[17-18]。

1.2.4 乳苣提取物對α-淀粉酶紫外和表面疏水性的影響 固定α-淀粉酶濃度為0.5 mg/mL,測定各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)分別為0.0000、0.0125、0.0250、0.0375和0.0500 mg/mL時,作用10 min后其對α-淀粉酶紫外光譜的影響,同時作對照實驗;固定ANS為8.0 mmol/L,α-淀粉酶濃度為0.5 mg/mL,各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)分別為0.00、0.25、0.50和1.00 mg/mL,作用10 min。在激發(fā)波長344 nm,400～600 nm掃描,測定其對α-淀粉酶表面疏水性影響,同時作對照實驗[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復3次,采用SPSS 16.0中Profit分析方法計算半抑制濃度IC50,利用Origin 7.5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶促反應(yīng)進程曲線

酶活力測定,首先需確定線性反應(yīng)時間,線性時間應(yīng)在初速度范圍內(nèi)選擇,而初速度對應(yīng)的時間范圍需通過酶促反應(yīng)進程曲線來選擇。進程曲線常以單位時間內(nèi)產(chǎn)物增加量與反應(yīng)時間的關(guān)系曲線表示。

反應(yīng)起始階段,曲線斜率幾乎不變,但隨時間延長,曲線平緩,速率降低,可能原因是底物濃度降低、產(chǎn)物濃度增加引起的逆反應(yīng)加強、產(chǎn)物對酶抑制或酶本身部分失活等[20]。酶促反應(yīng)進程曲線見圖1。吸光值隨時間延長幾乎成線性增加,隨后逐漸趨于平緩,產(chǎn)物增加量減慢。1.5 min內(nèi)線性較好,相關(guān)系數(shù)達0.99以上,時間延長則線性降低,不利于后續(xù)數(shù)據(jù)擬合。因此,酶活測定時間選擇1.5 min。

圖1 酶促反應(yīng)進程曲線Fig.1 Enzymatic reaction curve

2.2 乳苣提取物對α-淀粉酶的抑制作用

由圖2可知,在0～8.0 mg/mL范圍內(nèi),水、正丁醇和石油醚提取物對α-淀粉酶抑制作用均隨其濃度增大而增強(p<0.05)。當提取物濃度大于2.0 mg/mL時,水、正丁醇和石油醚提取物抑制率均超過50%,大于8.0 mg/mL時,石油醚提取物抑制率接近100%。在0～2.0 mg/mL范圍內(nèi),隨氯仿提取物濃度增加,其對α-淀粉酶的抑制作用出現(xiàn)波動,在2.0～8.0 mg/mL范圍內(nèi),氯仿提取物對α-淀粉酶抑制作用逐漸增強(p<0.05);在0～6.0 mg/mL范圍內(nèi),乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶幾乎無抑制作用,當大于6.0 mg/mL時,抑制作用急劇增強(p<0.05);利用SPSS 16.0軟件中的Profit分析方法,其中,響應(yīng)頻率為抑制率,協(xié)變量為抑制劑濃度[21],求得水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶IC50分別為2.002、4.086、1.248、4.299和6.904 mg/mL。后續(xù)實驗選擇抑制作用較穩(wěn)定且較強的水、正丁醇和石油醚提取物。

圖2 不同乳苣提取物對α-淀粉酶抑制作用Fig.2 Inhibition effects of Mulgedium tataricum L.extracts on α-amylase

2.3 乳苣提取物對α-淀粉酶的抑制類型和動力學特征

圖3、圖5和圖7中,C為各溶劑提取物濃度。在底物濃度和水/正丁醇提取物濃度不變條件下,體系吸光值隨α-淀粉酶含量增加呈線性增加。不同水/正丁醇提取物濃度條件下,各直線幾乎相交于原點,且直線斜率隨提取物濃度增加而下降,表明水/正丁醇提取物對α-淀粉酶的抑制作用,不是通過降低有效酶量導致活力下降的,而是通過抑制酶活性導致催化效率降低,表現(xiàn)為可逆抑制作用[22];石油醚提取物對α-淀粉酶抑制作用則與此不同,以吸光值對酶含量作圖,為一組平行直線,見圖7。隨石油醚提取物濃度不斷增大,直線平行從原點向右移動,說明石油醚提取物在反應(yīng)初期對酶為不可逆抑制,使酶永久失活,從而減少有效酶量。因此,石油醚提取物與α-淀粉酶間存在一定化學計量數(shù)的抑制關(guān)系,僅當酶的物質(zhì)的量大于石油醚提取物時,即有過量酶分子時,才表現(xiàn)出活力。此時,不同抑制劑濃度條件下的反應(yīng)初速度,隨酶量增加表現(xiàn)為與對照組一樣,為相互平行的直線[23]。但對照組未通過原點,可能是該體系中存在某些未知α-淀粉酶激活因素或某些激活因素占優(yōu)。

圖3 水提取物對α-淀粉酶抑制類型Fig.3 Inhibition type of water extract on-amylase

圖5 正丁醇提取物對α-淀粉酶抑制類型Fig.5 Inhibition type of butanol extracts on α-amylase

圖7 石油醚提取物對α-淀粉酶抑制類型Fig.7 Inhibition type of petroleum ether extracts on α-amylase

圖4中,以1/V對1/S作圖,V為反應(yīng)速度,S為底物濃度。雙倒數(shù)作圖得到一組橫軸截距不變的直線,水提取物不影響米氏常數(shù)(Km),只影響最大反應(yīng)速度(Vmax),抑制類型為非競爭性抑制。這表明水提取物與α-淀粉酶活性中心外必需基團結(jié)合,且這種結(jié)合并不影響酶與底物結(jié)合,同時,底物與酶的結(jié)合,也不影響酶與水提取物的結(jié)合,兩者相互獨立。但由于酶-底物-水提取物不能進一步形成產(chǎn)物,所以不能通過增加底物濃度來降低其對酶的抑制程度[24]。以雙倒數(shù)作圖各斜率對水提取物濃度作圖,求得Ki為1.653 mg/mL。

圖4 水提物的1/V-1/S曲線Fig.4 1/V-1/S curve of water extraction

由圖6可知,雙倒數(shù)作圖得到一組斜率不同,并交于第三象限的直線,抑制類型為線性混合抑制類型,即兼具反競爭性和非競爭性抑制。線性混合抑制作用類似于非競爭性抑制作用,酶可首先與底物或抑制劑結(jié)合,酶與底物結(jié)合不影響其與抑制劑進一步結(jié)合,反之,酶與抑制劑結(jié)合也不影響其與底物進一步結(jié)合。但線性混合型抑制中,酶與底物或抑制劑結(jié)合次序不同,則具有不同的反應(yīng)常數(shù)[25]。以雙倒數(shù)作圖各斜率和截距分別對正丁醇提取物濃度作圖,求得Ki和Kis分別為0.795和0.435 mg/mL,前者約為后者1.828倍,表明正丁醇提取物與酶-底物絡(luò)合物的親和力強于其與游離酶親和力[26]。當?shù)孜餄舛群驼〈继崛∥锞鶠?.0 mg/mL時,α-淀粉酶活性幾乎被完全抑制,故圖6未設(shè)置此組實驗。

圖6 正丁醇提取物的1/V-1/S曲線Fig.6 1/V-1/S curve of butanol

由圖8可知,雙倒數(shù)作圖得到一組斜率不同,并幾乎交于Y軸的直線,為競爭性抑制。這表明石油醚提取物可能與底物具有某些結(jié)構(gòu)相似性,與底物共同競爭酶活性中心結(jié)合位點,不能與酶-底物絡(luò)合物結(jié)合,主要通過誘導酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而使酶催化活性降低[27],屬于底物型不可逆抑制,亦即鄒承魯教授提出的競爭性不可逆抑制[28-29],求得Ki為2.893 mg/mL。

圖8 石油醚提取物的1/V-1/S曲線Fig.8 1/V-1/S of petroleum ether extracts

2.4 乳苣提取物對α-淀粉酶紫外光譜的影響

α-淀粉酶最大吸收波長在280 nm附近,主要由色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)側(cè)鏈的光吸收引起,其波長或吸收強度變化可反映Trp和Tyr殘基所處微環(huán)境的改變,故可選擇紫外吸收光譜探討α-淀粉酶結(jié)構(gòu)變化。由圖9～圖11可知,未加α-淀粉酶時,0.05 mg/mL的水、正丁醇和石油醚提取物在280 nm均無特征吸收峰。當水、正丁醇和石油醚提取物濃度增大時,α-淀粉酶紫外吸收均逐漸增強,表明上述提取物與α-淀粉酶相互作用后,改變了Trp和Tyr等芳香族殘基的微環(huán)境,從而引起α-淀粉酶吸收強度改變[30]。但α-淀粉酶紫外光譜均無明顯紅移或藍移現(xiàn)象,這說明各提取物與α-淀粉酶相互作用,僅通過氫鍵、范德華力、離子鍵和疏水相互作用等非共價作用,輕微改變其空間構(gòu)象,并不發(fā)生共價作用。

圖9 水提取物紫外光譜Fig.9 Ultraviolet spectrum of water extract

圖10 正丁醇提取物紫外光譜Fig.10 Ultraviolet spectrum of n-butyl alcohol extract

圖11 石油醚提取物紫外光譜Fig.11 Ultraviolet spectrum of petroleum ether extract

2.5 乳苣提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)表面疏水性與其來源、加工方法、加工條件和溶劑有關(guān),也與其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有關(guān)[31]。熒光探針ANS單獨存在時,最大發(fā)射波長在510 nm附近,熒光強度極小。水提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響見圖12。由圖12可知,當水提取物處理時,ANS最大發(fā)射波長由510 nm遷移至470 nm附近。隨水提取物濃度增大,ANS熒光強度逐漸增強,表明適宜濃度水提取物處理,可增強酶分子表面更多疏水區(qū)域暴露,誘發(fā)了α-淀粉酶的解折疊[32],從而可結(jié)合更多的ANS陰離子使熒光強度增強;正丁醇提取物對α-淀粉酶表面疏水性影響見圖13。由圖13可知,當正丁醇提取物處理時,ANS最大發(fā)射波長由510 nm遷移至450 nm附近。當正丁醇提取物較低(0.25 mg/mL)時,增強了熒光強度,這可能是低濃度正丁醇提取物與ANS結(jié)合,使酶分子部分伸展,導致蛋白質(zhì)表面更多疏水區(qū)域暴露,從而可結(jié)合更多ANS陰離子;但當正丁醇提取物濃度較高(0.5～1.0 mg/mL)時,正丁醇提取物與ANS陰離子同時競爭結(jié)合酶分子表面,因而導致與ANS陰離子結(jié)合減弱,熒光強度下降[33];石油醚提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響見圖14。由圖14可知,當石油醚提取物處理時,ANS最大發(fā)射波長由510 nm遷移至490～500 nm附近。與正丁醇提取物不同,當?shù)蜐舛?0.25 mg/mL)石油醚提取物處理時,其可能鑲嵌于酶分子的疏水性空穴中,并通過靜電相互作用部分穩(wěn)定了酶分子的空間結(jié)構(gòu),相當于阻止了疏水基團暴露,因而降低了熒光強度。當高濃度(0.5～1.0 mg/mL)石油醚提取物處理時,其主要作用是使酶分子的空間結(jié)構(gòu)完全伸展,疏水基團最大化暴露,因而增強了熒光強度。各提取物的熒光強度并未隨溶劑極性增大而降低,即未遵循“正溶劑動力學”效應(yīng)[34],原因是不同溶劑提取物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同,其對α-淀粉酶和ANS熒光強度的影響葉不同。另外,水提取物熒光強度明顯高于正丁醇和石油醚提取物,原因是水是質(zhì)子性溶劑,ANS與其形成氫鍵能力較強,相當于在ANS周圍形成了有序的簇集體系[35],有效保護了ANS熒光發(fā)射。正丁醇雖為質(zhì)子性溶劑,但質(zhì)子供體能力遠低于水分子,石油醚為非質(zhì)子性溶劑,因此兩者較為接近,且遠低于水提取物熒光強度。

圖12 水提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響Fig.12 Effects of water extract on surface hydrophobicity of α-amylase

圖13 正丁醇提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響Fig.13 Effects of n-butyl alcohol extract on surface hydrophobicity of α-amylase

圖14 石油醚提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響Fig.14 Effects of petroleum ether extract on surface hydrophobicity of α-amylase

3 結(jié)論與討論

水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯對α-淀粉酶的IC50分別為2.002、4.086、1.248、4.299和6.904 mg/mL,其中,石油醚提取物對α-淀粉酶的抑制作用最強。由于在0～2.0 mg/mL范圍內(nèi),氯仿提取物對α-淀粉酶的抑制作用出現(xiàn)波動,且氯仿毒性較大;在0～6.0 mg/mL范圍內(nèi),乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶幾乎無抑制作用,故后續(xù)實驗未考慮氯仿和乙酸乙酯提取物。由上述分析可見,乳苣的水、正丁醇和石油醚提取物是一種潛在有效的α-淀粉酶抑制劑,可通過分離純化進一步篩選其單體,以用于糖尿病、肥胖癥等疾病預(yù)防。另外,水、正丁醇、石油醚提取物均可增加α-淀粉酶的紫外吸收強度,但不改變其吸收峰位置,這主要是3種提取物均可改變α-淀粉酶空間構(gòu)象,使芳香族氨基酸而分布在酶分子表面,從而增強了紫外吸收能力,但未發(fā)生共價相互作用,不破壞酶分子的一級結(jié)構(gòu);水、正丁醇、石油醚提取物均可使ANS發(fā)生藍移,改變了其熒光發(fā)射峰位置。

本實驗中,乳苣不同溶劑提取物對α-淀粉酶的抑制類型與其它植物提取物不完全一致。水提取物對α-淀粉酶為可逆非競爭性抑制;正丁醇提取物對α-淀粉酶為可逆混合性抑制,屬于反競爭性和非競爭性混合抑制,類似于非競爭性抑制作用。該類混合抑制的特點是雙倒數(shù)曲線相較于第三象限,ES+IEIS的平衡常數(shù)小于Kis;石油醚提取物對α-淀粉酶為不可逆競爭性抑制,屬于底物型不可逆抑制,亦即鄒承魯教授提出的競爭性不可逆抑制。劉華[27]研究表明,大黃酸對α-淀粉酶是一種可逆競爭性抑制劑,并與對照阿卡波糖進行了對比。另外,隨大黃酸濃度增加,大黃酸誘導α-淀粉酶空間構(gòu)象變得更加精密而不利于活性中心形成。劉自琴[36]研究表明,紅茶和綠茶浸提液對豬α-淀粉酶均為可逆非競爭性抑制,且該相互作用過程中,α-淀粉酶紫外吸收強度增加,綠茶浸提液使吸收峰發(fā)生紅移。這說明,不同的植物種類或溶劑提取物,對不同的酶具有不同的抑制類型,主要取決于提取物有效成分的化學結(jié)構(gòu)。

[1]Parashar D,Satyanarayana T. Enhancing the production of recombinant acidicα-amylase and phytase in Pichia pastoris under dual promoters[constitutive(GAP)and inducible(AOX)]in mixed fed batch high cell density cultivation[J]. Process Biochemistry,2016,51(10):1315-1322.

[2]Homoki J R,Nemes A,Fazekas E,et al. Anthocyanin composition,antioxidant efficiency,andα-amylase inhibitor activity of different Hungarian sour cherry varieties(PrunuscerasusL.)[J]. Food Chemistry,2016,194:222-229.

[3]Wei Yu-tuo,Wang Xiao-bao,Liang Jia-yuan,et al. Identification of a halophilicα-amylase gene fromEscherichiacoliJM109 and characterization of the recombinant enzyme[J]. Biotechnology Letters,2013,35(7):1061-1065.

[4]王培立. 高溫α-淀粉酶耐熱嗜酸的分子改良及其高效表達的研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學院,2016.

[5]Sun Li-jun,Chen Wei-qi,Meng Yong-hong,et al. Interactions between polyphenols in thinned young apples and porcine pancreaticα-amylase:Inhibition,detailed kinetics and fluorescence quenching[J]. Food Chemistry,2016,208:51-60.

[6]Yu Ji-hua,Li Yang-yang,Xiang Mian,et al. Molecular cloning and characterization ofα-amylase/subtilisin inhibitor from rhizome of Ligusticum chuanxiong[J]. Biotechnology Letters,2016,39(1):141-148.

[7]Patel H,Royall P G,Gaisford S,et al. Structural and enzyme kinetic studies of retrograded starch:Inhibition ofα-amylase and consequences for intestinal digestion of starch[J]. Carbohydrate Polymers,2017,164:154-161.

[8]Sun Li-jun,Warren F J,Netzel G,et al. 3 or 3′-galloyl substitution plays an important role in association of catechins and theaflavins with porcine pancreaticα-amylase:The kinetics of inhibition ofα-amylase by tea polyphenols[J]. Journal of Functional Foods,2016,26:144-156.

[9]錢春香,孫麗娜,薛璇璣,等. 乳苣全草石油醚部位化學成分的研究[J]. 中草藥,2017,48(7):1302-1305.

[10]王小雄. 菊科和木賊科三種藥用植物化學成分及其生物活性[D]. 蘭州:蘭州大學,2006.

[11]Wang Xiao-xiong,Lin Chang-jun,Jia Zhong-jian. Triterpenoids and sesquiterpenes from mulgedium tataricum[J]. Planta Med,2006,72(8):764-767.

[12]張彩艷,劉小敏,華子義,等. 乳苣水提物誘導肺癌細胞H1299和A549的凋亡[J]. 上海師范大學學報(自然科學版),2014,43(2):196-203.

[13]陶益,陳錐,張玉峰.親和超濾耦聯(lián)液相色譜-質(zhì)譜快速檢測山楂葉中的α-淀粉酶抑制劑[J]. 分析化學,2013,41(2):229-234.

[14]馬艷麗,讓一峰,趙 偉,等. 白蕓豆α-淀粉酶抑制劑對α-淀粉酶抑制特性的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2017,38(12):109-112.

[15]Bernfeld P. Amylases,αandβ[J]. Methods in Enzymology,1955,1(1):149-158.

[16]高義霞,周向軍,楊聲,等. 不同溶劑提取乳苣的抗氧化作用研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(1):85-87.

[17]申啟榮.中藥黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選及抑制動力學研究[D]. 南昌:南昌大學,2015.

[18]曹少謙,劉亮,楊震峰,等. 幾種抑制劑對水蜜桃多酚氧化酶的抑制效應(yīng)[J]. 中國食品學報,2014,14(7):144-149.

[19]Cardamone M,Puri N K. Spectrofluorimetric assessment of the surface hydrophobicity of proteins[J]. Biochemical Journal,1992,282(2):589-593.

[20]王鏡巖,朱圣庚,徐長法. 生物化學[M](上冊,第三版). 北京:高等教育出版社,2002.

[21]趙斌,葛金芳,朱娟娟,等.小議在MTT法測細胞增殖抑制率中IC50的計算方法[J]. 安徽醫(yī)藥,2007,11(9):834-836.

[22]Seong H J,Young B R,Marcus J C,et al. Tyrosinase inhibitory polyphenols from roots of morus lhou[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(4):1195-1203.

[23]陳惠黎. 分子酶學[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1983:232-233.

[24]羅磊,周燕燕,朱文學,等. 金銀花多酚氧化酶特異性及抑制劑動力學研究[J]. 農(nóng)業(yè)機械學報,2014,45(7):202-208.

[25]龔仁敏. 酶可逆抑制作用中線性混合型抑制的動力學[J]. 安徽師范大學學報(自然科學版),1998,21(1):46-49.

[26]黃曉冬,吳雅清,許瑞安,等. 紅樹植物桐花樹葉片多酚提取物對酪氨酸酶活性抑制及抗自由基和抗菌活性分析[J].植物資源與環(huán)境學報,2014,23(1):30-38.

[27]劉華,李仕祥,鐘業(yè)俊,等.大黃酸對α-淀粉酶的抑制機理分析及分子模擬[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015,31(2):47-51.

[28]梁之彥. 生理化學[M]. 上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1985:238-240.

[29]楊同成. 赤小豆抑制劑對胰蛋白酶不可逆抑制作用的動力學探討[J]. 生物化學雜志,1991,7(2):221-224.

[30]雷芳.茶堿、咖啡因、可可堿對胰α-淀粉酶部分理化性質(zhì)的影響[D]. 成都:四川大學,2006.

[31]Huang Wei-ning,Sun Xiu-zhi. Adhesive properties of soy proteins modified by sodium dodecyl sulfate and sodium dodecyl benzene sulfonate[J]. Journal of the American Oil Chemists Society,2000,77(7):705-708.

[32]劉華,李仕祥,鐘業(yè)俊,等.木犀草素對酪氨酸酶活性抑制及構(gòu)象誘導作用[J]. 現(xiàn)代食品科技,2014,30(7):51-55.

[33]余晶梅.熒光探針法和疏水相互作用層析法分析蛋白表面疏水性[D]. 杭州:浙江大學,2014.

[34]吳世康.超分子光化學導論-基礎(chǔ)與應(yīng)用[M]. 北京:科學出版社,2005：170-174.

[35]孫延春.溶劑對TNS與ANS熒光光譜的影響[J]. 光譜實驗室,2009,26(6):1590-1593.

[36]劉自琴,黃惠華.綠茶和紅茶浸提液對α-淀粉酶的抑制作用研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2010,26(7):680-683.