吳茜 楊彬彬 王佳偉

特發(fā)性視神經(jīng)炎(optic neuritis，ON)是青壯年人最易罹患的致盲性視神經(jīng)疾病，與免疫介導(dǎo)的炎性脫髓鞘有關(guān)。視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disordes，NMOSD)是以視神經(jīng)、脊髓及延髓極后區(qū)等受累為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，是中青年人群中非外傷性致殘的主要疾病。2004年Lennon等[1]在視神經(jīng)脊髓炎(NMO)患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種特異性抗體，并證實該抗體的靶抗原為位于星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上的水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)，此發(fā)現(xiàn)確定了NMO是不同于多發(fā)性硬化(MS)的獨立疾病。NMO患者約70%血中可檢測到AQP4抗體，提示NMO是一種B細(xì)胞免疫為主的抗體介導(dǎo)的免疫性疾病。但仍有部分NMOSD患者AQP4抗體陰性，其與抗體陽性患者在臨床表現(xiàn)和預(yù)后不同，提示可能兩者存在不同的免疫機制。

濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper，Tfh)是輔助性T細(xì)胞(Th，其標(biāo)志為CD4+)的特殊亞型，負(fù)責(zé)輔助B細(xì)胞遷移、增殖、分化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生高親和力抗體的T細(xì)胞，Tfh主要功能是激活B淋巴細(xì)胞，刺激其產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。研究表明，CD4和趨化因子受體5(CXCR5)雙陽性(CD4+CXCR5+)T細(xì)胞，CD4、CXCR5和程序性死亡因子-1(PD-1)三陽性(CD4+CXCR5+-PD-1+)T細(xì)胞在自身免疫性疾病患者的血液中表達(dá)增高與抗體的產(chǎn)生相關(guān)，因此， CD4+CXCR5+、CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞被認(rèn)為是Tfh細(xì)胞最常用的標(biāo)志物[2]，因此本研究通過測定CD4+CXCR5+、CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞對Tfh細(xì)胞進(jìn)行研究。

現(xiàn)有研究認(rèn)為Tfh與體液免疫反應(yīng)有關(guān)，但Tfh是否參與了ON和NMOSD的體液免疫機制尚不十分清楚，迄今尚未見對比研究特發(fā)性O(shè)N和NMOSD患者外周血和腦脊液Tfh的表達(dá)變化的報道。本文對比研究了ON和NMOSD的Tfh變化，以探討Tfh是否參與了ON和NMOSD的體液免疫過程及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1觀察對象選擇2015-03—2017-05在作者科室住院的急性O(shè)N患者41例，其中男20例、女21例，年齡14～63歲，平均年齡(39.07±14.32)歲，病程0.13～156個月，病程中位數(shù)0.7個月上、下四分位數(shù)分別為0.32、6.0，個月。在作者科室住院的NMOSD急性期患者55例，其中男9例、女46例，年齡18～73歲，平均年齡(40.51±14.45)歲，病程0.23～180個月，病程中位數(shù)0.7個月，上、下四分位數(shù)分別為0.7、36個月。ON的診斷符合下列標(biāo)準(zhǔn)：急性發(fā)病的單眼或雙眼ON，無其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，血清AQP4抗體陰性，不符合NMOSD和MS的診斷，除外系統(tǒng)性免疫疾病、感染及其他原因的視神經(jīng)病變。NMOSD的診斷依據(jù)國際視神經(jīng)脊髓炎診斷小組(IPND)2015年初頒布的NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并排除MS、播散性腦脊髓炎及其他疾病。所有患者在入院前1個月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。另選健康志愿者26名作為健康對照組，其中包括作者科室的醫(yī)護(hù)人員、研究生和作者醫(yī)院的健康查體者，男10名、女16名，年齡16～75歲，平均年齡(36.77±14.86)歲，入選時身體健康、無發(fā)熱、無感染(查體化驗血常規(guī)及其感染指標(biāo)正常)，既往無免疫性疾病病史。健康對照組年齡與兩患者組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究項目經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2方法入院后NMOSD組和ON組患者均經(jīng)甲基潑尼龍沖擊治療(靜脈滴注1000 mg×3 d，500 mg×3 d，序貫減量至口服維持量)。所有患者均行腦和脊髓MRI檢查，詳細(xì)記錄病史和臨床表現(xiàn)。

1.2.1神經(jīng)功能評分：在入院和出院時分別進(jìn)行擴(kuò)展的神經(jīng)功能障礙評分(expended disability status scale， EDSS)[4]，因本研究患者以視神經(jīng)病變?yōu)橹鳎瑔斡肊DSS可能有偏倚，同時進(jìn)行視覺功能評分(visual outcome scale，VOS)[5]。

1.2.2Tfh細(xì)胞和 AQP4抗體檢測：入院急性期患者均在應(yīng)用甲基潑尼松龍治療前抽血2 mL，分別加入EDTA抗凝管和未抗凝血管，每管1 mL，用ELISA法檢測AQP4抗體，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Tfh。對17例患者(ON組8例、NMOSD組9例)行腰穿查腦脊液，用流式細(xì)胞術(shù)測定腦脊液中Tfh。

ELISA試劑盒購自英國阿爾斯公司，用酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)檢測，嚴(yán)格按照說明書操作，以說明書規(guī)定的≥3 u/mL為抗體陽性。流式細(xì)胞術(shù)檢測血Tfh：(1)Tfh細(xì)胞及其同型對照管：Tfh細(xì)胞管中加入5 μL Anti-human CD4 PE-Vio770、5 μL Anti-human CXCR5-FITC、5 μL Anti-Human PD-1-PE；同型對照管中加入5 μL Anti-human CD4 PE-Vio770、5 μL REA Contorl-FITC、5 μL Mouse IgG2b-PE(試劑購于德國美天旎生物公司，Miltenyi Biotec)。(2)各管均加入100 μL的抗凝血，充分混勻，室溫避光孵育15 min；(3)各管均加入溶血素工作液1 mL，渦旋振蕩器上充分混勻，避光靜置10 min，至試管內(nèi)液體變透亮；(4)各管1500 r/min離心5 min，棄上清液；(5)各管均加入PBS溶液 1 mL洗滌，渦旋振蕩器上充分混勻，1500 r/min離心5 min，棄去上清；(6)各管均加入300 μL PBS溶液，重懸細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀(美國BD 公司，Becton Dicknson and Company)進(jìn)行檢測分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測腦脊液Tfh：(1)抗體試劑同型對照同血Tfh檢測，取腦脊液2 mL，1500 r/m離心5 min；(2)棄上清液，剩余底部細(xì)胞加入10%小牛血清孵育15 min；(3)加入溶血素工作液500 μL，渦旋振蕩器上充分混勻，避光靜置5 min；(4)各管1500 r/m離心5 min，棄上清液；(5)各管均加入PBS溶液 1 mL洗滌，渦旋振蕩器上充分混勻，1500 r/min離心5 min，棄去上清；(6)各管均加入300 μL PBS溶液，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

本研究中，比較Tfh細(xì)胞在兩種疾病的表達(dá)變化情況，以CD4+細(xì)胞設(shè)門，流式細(xì)胞儀自動檢測血和腦脊液中CD4+CXCR5+T細(xì)胞數(shù)和CD4+-CXCR5+PD-1+T細(xì)胞數(shù)分別占CD4+T細(xì)胞數(shù)的百分比(以下簡稱“比例”)，即CD4+CXCR5+T細(xì)胞數(shù)或CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞數(shù)÷CD4+T細(xì)胞數(shù)×100%。上述比例高代表Tfh細(xì)胞數(shù)高。

比較ON組和NMOSD組性別比例、病程、年復(fù)發(fā)率、CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例和AQP4抗體水平，兩組患者甲基潑尼松龍治療前后EDSS和VOS功能評分，以及患者組與健康對照組CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+-PD-1+T細(xì)胞比例；并分析患者血和腦脊液CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例的相關(guān)性，分析兩患者組Tfh表達(dá)與病程、年復(fù)發(fā)率、EDSS及VOS評分的相關(guān)性，患者AQP4抗體水平與CD4+CXCR5+、CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例、病程和EDSS評分的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。在描述病程時采用中位數(shù)及范圍表示，因統(tǒng)計分析時應(yīng)與其他指標(biāo)一致，在結(jié)果中和其他數(shù)據(jù)一樣采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。三組間及兩組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用單因素方差分析Scheffe檢驗法；兩組患者甲基潑尼松龍治療前后EDSS及VOS評分的自身比較采用配對t檢驗；兩組數(shù)據(jù)相關(guān)分析，如血Tfh表達(dá)和腦脊液Tfh表達(dá)相關(guān)分析、AQP4抗體水平與Tfh表達(dá)相關(guān)分析等采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組外周血Tfh比例具體結(jié)果見表1。ON組和NMOSD組外周血CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例均高于健康對照組(均P<0.01)，ON組和NMOSD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

2.2ON組和NMOSD組CD4+CXCR5+、CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例、AQP4抗體及臨床相關(guān)因素比較NMOSD組血清AQP4抗體水平和EDSS評分均顯著高于ON組，病程長于ON組，兩組患者外周血和腦脊液CD4+CXCR5+T細(xì)胞、CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例、年均復(fù)發(fā)次數(shù)和VOS評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05，表2、3)。NMOSD組和組患者甲基潑尼松龍治療后EDSS和VOS評分均顯著低于治療前評分(均P<0.01，表3)。

2.3兩組組患者相關(guān)臨床指標(biāo)的相關(guān)分析

2.3.1ON組Tfh表達(dá)及相關(guān)臨床指標(biāo)的相關(guān)分析：ON組外周血及腦脊液中CD4+CXCR5+與CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞兩種不同細(xì)胞比例均呈正相關(guān)(分別r=0.822、P=0.000，r=0.714、P=0.047)；腦脊液CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例分別與外周血中同種細(xì)胞比例無相關(guān)性(分別r=0.321、P=0.482，r=0.571、P=0.180)。

患者EDSS評分與VOS評分呈顯著正相關(guān)(r=0.614，P=0.000)。外周血和腦脊液CD4+CXCR5+及CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例與EDSS評分、VOS評分均無相關(guān)性(表4)。

表1 各組外周血CD4+CXCR5+、CD4+-CXCR5+PD-1+ T細(xì)胞比例比較 (±s,%)

注：ON為視神經(jīng)炎，NMOSD為視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病，表2、3同；與健康對照組比較，*P<0.01

表2 ON組和NMOSD組CD4+-CXCR5+和CD4+-CXCR5+-PD-1+T細(xì)胞比例及臨床相關(guān)指標(biāo)比較(±s)

注：AQP4抗體≥3 u/mL為陽性

表3 ON組和NMOSD組甲基潑尼松龍治療前后功能評分比較

表4 ON患者外周血和腦脊液Tfh表達(dá)與EDSS評分、VOS評分的相關(guān)性

表5 NMOSD患者外周血和腦脊液Tfh表達(dá)與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性

2.3.2NMOSD組 Tfh表達(dá)及相關(guān)臨床指標(biāo)的相關(guān)分析：外周血及腦脊液中CD4+CXCR5+與CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞兩種不同細(xì)胞比例均呈正相關(guān)(分別r=0.826、P=0.000，r=0.917、P=0.001)；腦脊液CD4+CXCR5+T細(xì)胞比例與外周血中該細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.717、P=0.030)，腦脊液CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例與外周血中該細(xì)胞比例無相關(guān)性(r=0.583、P=0.099)。

患者EDSS評分與VOS評分呈顯著正相關(guān)(r=0.327，P=0.016)。NMOSD患者血清AQP4抗體水平與病程和EDSS評分均顯著正相關(guān)(r=0.418、P=0.000，r=0.351、P=0.001)?；颊咄庵苎湍X脊液CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞與血CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例與EDSS評分、VOS評分、年均復(fù)發(fā)次數(shù)均無相關(guān)性(表5)。

3 討論

本研究表明 ON組外周血CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞與血CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例均顯著高于健康對照組，由于CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞是Tfh的主要生物標(biāo)志，提示Tfh可能參與了特發(fā)性O(shè)N的體液免疫過程。本研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性O(shè)N患者外周血CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例較健康人增高，Tfh的主要功能為激活B淋巴細(xì)胞，刺激其產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)[6]，故提示ON患者Tfh異常增高可能與其發(fā)病有關(guān)，Tfh可能是特發(fā)性O(shè)N潛在的體液免疫指標(biāo)。此外，測定ON患者血CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例，可能對鑒別免疫介導(dǎo)的特發(fā)性O(shè)N與其他病因的ON有一定臨床參考意義。

近年來研究表明，Tfh激活參與了一些自身免疫性疾病的免疫病理過程，有報道MS患者外周血誘導(dǎo)性共刺激因子陽性(ICOS+)Tfh 和CD4+CXCR5+T 細(xì)胞比例較健康對照顯著增高，MS患者外周血 CXCR3+Th1-like T細(xì)胞比例減少，而CCR6+Th17-like Tfh比例增高[7]。有報道重癥肌無力患者外周血Tfh表達(dá)增高，并與MG評分相關(guān)[8]。迄今， NMO患者外周血Tfh表達(dá)增高的報道較為罕見，有報道NMO患者外周血CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例較MS和健康對照組增高，提示Tfh細(xì)胞增多與NMO有關(guān)[9]。

本研究表明NMOSD患者外周血CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+PD-1+T細(xì)胞比例較健康對照組增高，并且NMOSD腦脊液CD4+CXCR5+T細(xì)胞比例與外周血中該細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)，提示NMOSD患者存在Tfh參與的體液免疫功能異常，推測患者外周血Tfh激活，可能透過患者的血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，攻擊視神經(jīng)和腦脊髓等中樞神經(jīng)組織，參與NMOSD患者的體液免疫過程，Tfh還可能是NMOSD的潛在的體液免疫標(biāo)志物。

研究表明，AQP4抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC)和AQP4抗體介導(dǎo)的補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)作用，在NMOSD病變產(chǎn)生中起重要作用[10]。本研究NMOSD患者組血清AQP4抗體水平與病程和EDSS評分呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步證實AQP4抗體在NMOSD發(fā)病中的作用，AQP4抗體對患者的病情和預(yù)后判斷可能有一定參考意義，對NMOSD患者的免疫抑制治療有一定指導(dǎo)作用。本研究中Tfh細(xì)胞與AQP4抗體無相關(guān)性，ON和NMOSD患者Tfh與抗體的關(guān)系可能尚需進(jìn)一步研究。

本研究未發(fā)現(xiàn)Tfh表達(dá)在ON和NMOSD患者中存在統(tǒng)計學(xué)差異。本組特發(fā)性NO的診斷較嚴(yán)格，排除了其他原因引起的急性視神經(jīng)病，亦不符合NMOSD和MS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者血AQP4抗體均陰性，并且年平均復(fù)發(fā)次數(shù)不少于NMOSD患者，外周血和腦脊液Tfh表達(dá)均顯著增高，提示Tfh不僅參與了NMOSD的體液免疫過程，亦在ON的體液免疫機制中發(fā)揮作用，因此不能依據(jù)Tfh的變化鑒別ON和NMOSD。

本研究顯示經(jīng)甲基潑尼松龍沖擊及序貫治療后，ON組和NMOSD組EDSS和VOS評分均顯著降低，表明甲基潑尼松龍沖擊及序貫治療不僅是急性期NMOSD的經(jīng)典療法，也是急性期ON治療的有效方法。

綜上可見，本研究顯示兩組患者外周血和腦脊液Tfh表達(dá)與EDSS評分、VOS評分、年均復(fù)發(fā)次數(shù)均無相關(guān)性，Tfh表達(dá)與ON和NMOSD的病情及復(fù)發(fā)關(guān)系尚不能明確。因此Tfh變化情況可能不能作為判斷這兩種疾病患者病情和預(yù)后的指標(biāo)，Tfh在這兩組疾病體液免疫中的具體作用以及與相應(yīng)抗體的產(chǎn)生是否有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

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