張西萌 韓笑 付溥博 曾 靜 魏海燕 陳鑫 魏詠新

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026）

1 前言

克羅諾桿菌屬原名阪崎腸桿菌，在自然界中分布廣泛，在水、土壤、食品中均可分離出該菌?？肆_諾桿菌屬能導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥，并可引起神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥和死亡，因該菌感染引起的死亡率高達(dá)50%以上[1]。該菌屬[2，3]包括1個(gè)新組合、4個(gè)新種和3個(gè)新亞種。新組合為阪崎腸克羅諾桿菌；4個(gè)新種分別為蘇黎世克羅諾桿菌、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌、穆汀斯克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌；3個(gè)新亞種分別為都柏林克羅諾桿菌都柏林亞種、都柏林克羅諾桿菌洛桑亞種、都柏林克羅諾桿菌乳粉亞種。此外還有1個(gè)克羅諾桿菌基因種1不是新種，但屬于克羅諾桿菌屬，即克羅諾桿菌屬共有6個(gè)種[4]。在目前采用的克羅諾桿菌屬檢測方法中，傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法仍是最常用的鑒定方法，而最常見的顯色培養(yǎng)基為DFI瓊脂，可選擇的其他類似培養(yǎng)基并不多見。因此，本研究通過國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.40方法及伯樂公司研發(fā)的新型培養(yǎng)基RSA快速篩選方法對(duì)50株克羅諾桿菌屬及30株非克羅諾桿菌屬進(jìn)行RAPID'Sakazakii Agar（以下簡稱RSA）顯色培養(yǎng)基鑒定及應(yīng)用研究。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

共選取50株目標(biāo)菌株，其中1株為ATCC 29544標(biāo)準(zhǔn)菌株，其余49株分離株分別來源于奶粉、嬰幼兒食品、蛋白粉、黃油、芝士、冰淇淋、面包粉等食品，詳見表1。

2.1.2 試劑

RAPID'Sakazakii Agar克羅諾桿菌屬顯色培養(yǎng)基：RSA 伯樂 2C0010，法國；腦心浸液肉湯：BRAINHEART INFUSION BHI梅里埃 1001221840，法國；克羅諾桿菌屬顯色培養(yǎng)基：DFI陸橋 121227，國產(chǎn)；緩沖蛋白胨水：Baffer Peptone Water BPW OXIOD 1143896，英國；改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯：Modified Lauryl Sulfate Tryptose Broth mLST陸橋 121128，國產(chǎn)；萬古霉素：Vancomycin陸橋130108，國產(chǎn)。

2.1.3 儀器設(shè)備

微生物鑒定儀：法國梅里埃 VITEK2 COMPACT30，法國；恒溫培養(yǎng)箱（37℃）：MMM FC222，德國；全溫振蕩器（36℃±1℃）：培英 THZ-C-1，國產(chǎn)；渦旋振蕩器：IKA ms3Ds25，德國；McFarland標(biāo)準(zhǔn)比濁儀：梅里埃 DENSICHEK，意大利。

2.2 方法

2.2.1 RSA培養(yǎng)基主要原理

利用克羅諾桿菌屬特異性產(chǎn)生α-葡萄糖酶，在此酶的作用下酶底物 5-溴-4氯-3吲哚α-D-甲基葡萄糖苷顯示藍(lán)至藍(lán)綠色菌落。44℃培養(yǎng)后脫氧膽酸鈉和結(jié)晶紫會(huì)抑制其他雜菌和干擾菌的生長。

2.2.2 RSA快速篩選培養(yǎng)基選擇性研究

2.2.2.1 特異性分析

采用包括ATCC 29544參比菌株在內(nèi)的49株克羅諾桿菌屬針對(duì)RSA快速篩選培養(yǎng)基進(jìn)行特異性研究。

2.2.2.2 交叉反應(yīng)分析

為了測試該培養(yǎng)基與非克羅諾桿菌屬是否存在交叉反應(yīng)，采用包括腸桿菌科的大腸埃希菌、沙門菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等30株非目標(biāo)菌，同時(shí)選取國標(biāo)法采用的DFI顯色培養(yǎng)基與RSA培養(yǎng)基進(jìn)行交叉反應(yīng)測試。

2.2.3 RSA快速篩選培養(yǎng)基檢測相對(duì)準(zhǔn)確性研究

2.2.3.1 添加實(shí)驗(yàn)

目標(biāo)菌株：克羅諾桿菌屬 ATCC 29544；

干擾菌株：大腸埃希菌為 ATCC 25922；

目標(biāo)菌添加水平：0=陰性對(duì)照，1 600 CFU/100 g樣品，120 CFU/100 g；

干擾菌添加水平：2.5×106CFU/100 g樣品。

添加方法：將添加菌株在BHI平板上活化，接種單個(gè)菌落于 10 mL BHI液體培養(yǎng)基中，36℃150～200 rpm 搖床過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)液用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，克羅諾桿菌屬培養(yǎng)液稀釋到10-4和10-5，菌液濃度分別為1 600 CFU/mL和120 CFU/mL；大腸埃希菌菌液添加濃度為2.5×106CFU/mL。分別取1 mL菌液，添加到經(jīng)高壓滅菌的100 g樣品中，按照GB 4789.40和RSA快速篩選方法進(jìn)行檢驗(yàn)，添加樣品類型主要是乳粉和乳制品。

2.2.3.2 培養(yǎng)條件的影響

培養(yǎng)條件主要是評(píng)估關(guān)鍵因素對(duì)方法檢出率的影響，在此設(shè)定的關(guān)鍵因素是培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。方法：單一菌株的添加；添加方法和添加目標(biāo)菌株的量：同2.2.3.1；添加基質(zhì)：經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明不含克羅諾桿菌屬的嬰兒配方奶粉。溫度、時(shí)間組合為36℃，16 h；36℃，20 h；38℃，16 h；38℃，20 h。每個(gè)組合做 2 個(gè)平行樣品。

2.2.3.3 實(shí)際樣品的檢測

在超市購買50個(gè)乳和乳制品樣品，樣品類別包括3個(gè)階段的嬰兒（幼兒）配方奶粉及各種品牌酸奶制品，分別用GB 4789.40和RSA快速篩選方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 特異性

RSA快速篩選培養(yǎng)基特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 RSA快速篩選培養(yǎng)基特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1結(jié)果顯示：在RSA快速篩選培養(yǎng)基上，ATCC29544參比菌株表現(xiàn)特征性的“藍(lán)綠色”菌落；49株分離株，除BJ-E.sa-56、57表現(xiàn)為藍(lán)色菌落外，其余菌株均表現(xiàn)“藍(lán)綠色”特征菌落；BJ-E.sa-56和57進(jìn)一步鑒定為克羅諾桿菌屬。因此，RSA快速篩選培養(yǎng)基的特異性準(zhǔn)確率為96%。

3.2 交叉反應(yīng)

非目標(biāo)菌在DFI顯色培養(yǎng)基與RSA培養(yǎng)基的測試結(jié)果見表2。

表2 30株非目標(biāo)菌在RSA快速篩選培養(yǎng)基上的菌落特征

表2結(jié)果顯示：30株非目標(biāo)菌中一些菌株在RSA培養(yǎng)基上被抑制，不能生長，能生長的菌株多呈紫色和藍(lán)色；在DFI顯色培養(yǎng)基上呈白色或者是白的有黑心的菌落。由此結(jié)果得出：RSA快速篩選培養(yǎng)基具有非常好的分辨力。

3.3 相對(duì)準(zhǔn)確性

3.3.1 添加實(shí)驗(yàn)

混菌添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 混菌添加實(shí)驗(yàn)

（續(xù)表 3）

表3結(jié)果顯示：10個(gè)不同樣品，每個(gè)做2個(gè)平行樣，共計(jì)20個(gè)樣品的測試，在高濃度雜菌干擾的情況下，添加水平為1 600 CFU/100 g樣品時(shí)，DFI顯色培養(yǎng)基的檢出率為16/20，即80%；RSA 選擇性培養(yǎng)基的檢出率為20/20，即100%。添加水平為120 CFU/100 g樣品時(shí)，DFI顯色培養(yǎng)基的檢出率為13/20，即65%；RSA 選擇性培養(yǎng)基的檢出率為20/20，即100%。因此，RSA選擇性培養(yǎng)基在高濃度雜菌干擾的情況下，選擇性和檢出率均優(yōu)于DFI顯色培養(yǎng)基。

3.3.2 培養(yǎng)條件

不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響見表4。

表4 培養(yǎng)溫度和時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

表4結(jié)果顯示：許可范圍內(nèi)，在80 CFU/100 g和20 CFU/100 g添加水平，溫度在變化2℃和培養(yǎng)時(shí)間變化2 h的情況下，對(duì)RSA快速篩選方法的檢出率沒有影響。

3.3.3 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

實(shí)際樣品檢測實(shí)驗(yàn)中，通過兩種檢測方法均未檢出陽性樣品。

4 結(jié)論與討論

克羅諾桿菌屬對(duì)新生兒危害極大，致死率高達(dá)50%以上，因此受到世界各國高度重視。在我國，該項(xiàng)目是國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品（0-6個(gè)月）中必檢項(xiàng)目。

Muytjens等[5]研究了克羅諾桿菌屬和相關(guān)菌株的酶反應(yīng)特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌屬和其他腸桿菌之間存在主要的不同點(diǎn)：克羅諾桿菌屬α-葡萄糖苷酶活性均為陽性，而其他腸桿菌科均為陰性。因此本研究采用的兩種顯色培養(yǎng)基均利用上述原理，添加了酶底物與之反應(yīng)，來鑒別克羅諾桿菌屬。1985年Farmer等[6]檢測了57株克羅諾桿菌屬，其中53株α-葡萄糖苷酶活性為陽性。1983年Aldova等[7]評(píng)估了從捷克斯洛伐克分離的73株克羅諾桿菌屬吐溫80脂酶活性，結(jié)果顯示97.13%的菌株含有該酶。由上述文獻(xiàn)記載可以得出，并非全部克羅諾桿菌屬都產(chǎn)α-葡萄糖苷酶，因此本研究所采用菌株中2株分離株未顯出目標(biāo)菌藍(lán)綠色菌落，也屬正?，F(xiàn)象。

本研究通過對(duì)50株目標(biāo)菌及30株非目標(biāo)菌對(duì)克羅諾桿菌屬RSA顯色培養(yǎng)基進(jìn)行特異性和交叉性分析、混菌添加、溫度條件、實(shí)際樣品檢測等方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中特異性分析實(shí)驗(yàn)表明該培養(yǎng)基顯示出了良好的分辨力，準(zhǔn)確度高達(dá)96%以上，其中與其他菌株顯色不同的2株分離株來源于同一國家，同一品牌，且這兩株分離株的耐藥實(shí)驗(yàn)顯示，在選擇的20種抗生素實(shí)驗(yàn)中，這兩株菌相似度極高，抑菌圈直徑基本一致，因此推測這兩株具有同源性。交叉性分析實(shí)驗(yàn)選取30株非目標(biāo)菌，包括多株與克羅諾桿菌屬近似的革蘭陰性腸道菌及部分革蘭陽性菌，結(jié)果全部菌株都與目標(biāo)菌顏色有明顯差別，易分辨?；炀砑訉?shí)驗(yàn)和溫度實(shí)驗(yàn)檢出率均為100%，優(yōu)于同類比對(duì)培養(yǎng)基。

微生物檢測實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基的質(zhì)量優(yōu)劣將直接影響到檢測工作的精準(zhǔn)性和可靠性。針對(duì)致病菌檢測，如能選擇一種檢出率高于同類產(chǎn)品且易于觀察的高品質(zhì)培養(yǎng)基，對(duì)整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確率會(huì)有大幅度提高。通過上述5項(xiàng)研究結(jié)果充分表明，與傳統(tǒng)克羅諾桿菌屬顯色培養(yǎng)基相比，本次實(shí)驗(yàn)所采用的RSA顯色培養(yǎng)基具有準(zhǔn)確率高、特征性菌落易觀察等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該培養(yǎng)基還具備多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)：首先操作步驟比傳統(tǒng)GB 4789.40方法節(jié)省了選擇性增菌環(huán)節(jié)，檢測時(shí)限縮短1天，其次培養(yǎng)基不需添加任何添加劑，稱取量比其他培養(yǎng)基低，從而降低了檢測成本。綜上所述，RSA顯色培養(yǎng)基具有多項(xiàng)同類產(chǎn)品不具備的優(yōu)點(diǎn)，利于操作及保存，是理想的克羅諾桿菌屬檢測的培養(yǎng)基。

本研究所采用的RSA培養(yǎng)基顯示出良好的分辨力，準(zhǔn)確度高達(dá)96%以上，干擾菌添加實(shí)驗(yàn)和溫度實(shí)驗(yàn)檢出率均為100%，優(yōu)于同類比對(duì)培養(yǎng)基，其可以作為一種選擇性培養(yǎng)基在微生物檢測行業(yè)推廣使用。

[1]Joint FAO/WHO workshop on Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powderedinfantformula，Geneva，2-5.February 2004 EB/OL.http：//www.who.int/food-safety/micro/meetings/en/report.pdf.

[2]裴曉燕，劉秀梅.阪崎腸桿菌的生物學(xué)性狀與健康危害[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2004，16（6）：550-555.

[3]NOTIFICATION LIST.Notification that new names and new combinations have appeared in volume 58，part 6，of the IJSEM[A].Int J Systematic and Evolutionary Microbiol，2008，（58）：1995-1996.

[4]趙貴明，袁飛，楊海榮，等.阪崎腸桿菌的分類變化及新種屬生物學(xué)特性[J]. 衛(wèi)生研究，2010，39（2）：248-250.

[5]Muytjens H L，van der Rosvan de Repce J，van Druten H A.Enzymatic profiles of Enterobacter sakazakii and relatedspecies with specialreference to the alphaglucosidase reaction and reproducibility of the test system[J].J Clin Micro2biol，1984，20（4）：684-686.

[6]Farmer J J，Davis B R，Hickman Brenner F W，etal.Biochemicalidentification ofnew speciesand biogroupsof Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens[J].J Clin Microbilo，1985，21（1）：46-76.

[7]Aldova E，Hausner O，Postupa R.Tween 2 esterase activity in Enterobacter sakazakii[J].Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg，1983，256（l）：103-108.