董逸翔，陳華，矯金玲，陶敏

性發(fā)育特征初顯年齡較正常兒童平均年齡提前2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上[1]，或男童在9歲、女童在8歲前出現(xiàn)第二性征者[2]稱為性早熟。在臨床上根據(jù)其發(fā)病機(jī)制和病因又分為中樞性與外周性兩大類。

現(xiàn)今已證實(shí)兒童性成熟年齡的提前主要是外界因素作用的結(jié)果，其中營(yíng)養(yǎng)飲食結(jié)構(gòu)的改變尤為重要[3]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)高脂肪飼料喂養(yǎng)的幼齡雌性SD大鼠，其陰道開口及第一次發(fā)情間期均提早出現(xiàn)，其子宮、卵巢指數(shù)增高，血清促黃體生成素（LH）水平上升，表明高脂飲食可促使大鼠青春期啟動(dòng)提前[4]。本實(shí)驗(yàn)將繼上述研究，以下丘腦GnRH mRNA與垂體GnRH-R mRNA為觀察指標(biāo)[5]，從基因?qū)用嫣接懜咧嬍硨?duì)性發(fā)育中樞下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物分組 出生21d清潔級(jí)斷乳SD雌性大鼠10窩，購自上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為2008001601321，平均體質(zhì)量為（45±5）g，飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。按配對(duì)設(shè)計(jì)原則，依據(jù)窩別與體質(zhì)量選取20只大鼠，分為高脂組與標(biāo)準(zhǔn)組，各組10只，分別喂飼高脂肪飼料及標(biāo)準(zhǔn)飼料，并于溫度18～23℃，濕度60%～80%，每天14 h光照的環(huán)境下自由攝食、飲水。

1.2 動(dòng)物飼料 標(biāo)準(zhǔn)飼料、高脂飼料由南通特洛非飼料科技有限公司提供，高脂飼料的脂肪供能比在標(biāo)準(zhǔn)飼料的基礎(chǔ)上上調(diào)至45%[6]。各組飼料具體成分見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 高脂組予高脂肪飼料，標(biāo)準(zhǔn)組予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食、飲水，從實(shí)驗(yàn)第1天（大鼠21日齡）至大鼠處死日（大鼠36日齡），每天9：00觀察大鼠陰道口開放情況。對(duì)陰道口開放的大鼠，每天進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片觀察其性周期的變化。待高脂組大鼠均出現(xiàn)陰道口開放時(shí)，即實(shí)驗(yàn)第16天、大鼠36日齡時(shí)，于當(dāng)天15：00在水合氯醛麻醉下處死所有大鼠，獲取下丘腦及垂體，置于－80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。組織總RNA提取、cDNA第一鏈合成、PCR反應(yīng)及檢測(cè)等操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，最后以Realtime-PCR技術(shù)，將 -actin作為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量“2－△△Ct”值來表示目的基因下丘腦GnRHmRNA和垂體GnRH-RmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 試劑及引物 RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑均購自北京天根生化科技有限公司，批號(hào)分別為 L1029、L0924、L1008；PCR引物根據(jù)Gene Bank提供序列由上海生工生物工程公司合成，其核苷酸序列如下：-actin正向5’-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3’，反向 5’-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3’，產(chǎn)物 155bp；下丘腦GnRHmRNA正向5’-TGGTATCCCTTTGGC TTT-3’，反向 5’-CTCCTC CTT GCC CAT CTC-3’，產(chǎn)物188bp；垂體GnRH-RmRNA正向5’-GACGGT GAC TTT CTT CCT TTT C-3’，反向 5’-CTC TCC AGCATA CCA CTGAACA-3’，產(chǎn)物 169 bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析統(tǒng)計(jì)。由于相對(duì)表達(dá)量“2－△△Ct”為非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)時(shí)先轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下丘腦GnRH mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 高脂組大鼠下丘腦GnRHmRNA相對(duì)表達(dá)水平高于標(biāo)準(zhǔn)組（=2.307＜ 0.05），見表 2。

2.2 垂體GnRH-R mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 高脂組大鼠垂體GnRH-RmRNA相對(duì)表達(dá)水平高于標(biāo)準(zhǔn)組（=4.359＜ 0.01），見表 3。

表1 各組飼料成分及各成分含量 g

表2 兩組間下丘腦GnRH mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表3 兩組間垂體GnRH-RmRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

自20世紀(jì)60年代以來，隨世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展、營(yíng)養(yǎng)狀況改善，出現(xiàn)了兒童體格以及青春發(fā)育年齡提前的世界性趨勢(shì)，迄今為止已明確青春期發(fā)育會(huì)受到基因、營(yíng)養(yǎng)健康狀況、環(huán)境及社會(huì)經(jīng)濟(jì)等因素的影響。瑞典一項(xiàng)調(diào)查顯示[7]：將生活條件相對(duì)落后國(guó)家的女孩移民至比利時(shí)之后，有1/3出現(xiàn)了性發(fā)育提前；之后研究證實(shí)這一部分女孩在移民之前以低蛋白、低熱量的素食為主，移民后飲食結(jié)構(gòu)向高熱、高脂、高蛋白飲食轉(zhuǎn)變。我國(guó)也有相關(guān)調(diào)查表明，已確診為性早熟的患兒其日常飲食中攝取的動(dòng)物類食物較正常同齡兒童多[8]，這些都提示了青春期發(fā)育提前與飲食結(jié)構(gòu)以及肥胖率之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。

在人類正常青春期發(fā)育與中樞性性早熟發(fā)病過程中，HPGA功能的激活至關(guān)重要。性發(fā)育啟動(dòng)前，HPGA處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)[9]；性發(fā)育開始啟動(dòng)時(shí)，GnRH分泌增加，激活垂體分泌促黃體生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH），從而促進(jìn)性腺分泌，可見青春期的啟動(dòng)一定程度上源于HPGA的準(zhǔn)確發(fā)動(dòng)。對(duì)于人類，上述過程啟動(dòng)的年齡跨度很大，其調(diào)控因素復(fù)雜，但可以肯定的是很多情況下是發(fā)生在基因水平上的[10]。有國(guó)外研究顯示，人群中性成熟的年齡接近于正態(tài)分布，提示了性早熟性狀的差異并非只緣于單一位點(diǎn)的突變，而是由多基因共同決定的[11]。

作為研究性發(fā)育的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，SD大鼠的HPGA功能與人類相似，其性周期明顯短于人類，性發(fā)育特征表現(xiàn)明顯，便于實(shí)驗(yàn)觀察。大鼠青春期啟動(dòng)、HPGA激活，此時(shí)與性發(fā)育相關(guān)的一系列基因表達(dá)水平出現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)改變[12]，譬如下丘腦GnRH mRNA表達(dá)水平開始提升，并指導(dǎo)合成GnRH；垂體GnRH-R mRNA表達(dá)水平相應(yīng)提升，指導(dǎo)合成GnRH-R，兩者為配受體關(guān)系。當(dāng)GnRH脈沖式分泌水平上調(diào)、脈沖幅度增大、出現(xiàn)晝夜節(jié)律性變化時(shí)，接受GnRH刺激的垂體細(xì)胞膜表面GnRH-R也相應(yīng)增加，GnRH與GnRH-R結(jié)合所釋放的一系列生物信號(hào)促使垂體前葉分泌LH、FSH，進(jìn)而影響性腺分泌相關(guān)性激素，HPGA功能從而完全啟動(dòng)。

本實(shí)驗(yàn)說明，相比于正常標(biāo)準(zhǔn)飲食，高脂飲食更容易引發(fā)大鼠HPGA提前啟動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致性發(fā)育提前；從基因?qū)用嫔峡?，高脂飲食?duì)于HPGA的影響可以通過促進(jìn)大鼠下丘腦GnRH mRNA、垂體GnRHR mRNA這些性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，這都提示了合理飲食、避免攝入過多脂肪應(yīng)作為預(yù)防性早熟的重要措施。至于高脂飲食是否可影響其他性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，其作用又是通過哪些途徑發(fā)生；基于人類日常飲食結(jié)構(gòu)，不可能只進(jìn)食高脂飲食，故而高脂、高蛋白混合飲食是否可致HPGA提前啟動(dòng)，混合飲食相對(duì)于單純高脂飲食是否更易引發(fā)性早熟等問題仍需進(jìn)一步研究。

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