胡耀華，陽慧，吳翔，符春苗，邵運(yùn)祿，鄭才玲，卓書偉

（海南省中醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.婦產(chǎn)科，海南 海口 570203）

T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白（T cell immunoglobulin domain and mucin domain，TIM）家族是McIntire等于2001年發(fā)現(xiàn)的1個(gè)新的基因家族，在人體中包括TIM-1、TIM-3和TIM-4[1]。TIM-1是甲型肝炎病毒受體-1（hepatitis A virus cellular receptor 1，HAVCR-1），TIM-4是TIM-1的天然配體[2]。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)甲型病毒性肝炎患者痊愈后具有較強(qiáng)的免疫能力[3]，且TIM家族參與T細(xì)胞的增殖活化調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，而T細(xì)胞在體液免疫抗體產(chǎn)生的過程中起到重要作用，所以筆者猜測(cè)TIM-1和TIM-4可能在參與細(xì)胞免疫的同時(shí)，也參與機(jī)體的體液免疫的強(qiáng)化，本研究通過檢測(cè)甲型肝炎患者外周血TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平以及血清中白介素4（interleukin-4，IL-4），白介素 10（interleukin-10，IL-10）和總 Ig（IgG和IgA），探討TIM-1、TIM-4是否對(duì)體驗(yàn)免疫有強(qiáng)化作用，為將來開發(fā)低毒的HAV疫苗從而間接提高體液免疫能力用以抗腫瘤和感染提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年11月-2016年11月本院收治的甲型病毒性肝炎患者60例（研究組）。男性46例，女性14例；年齡28～42歲，平均（33±8.3）歲。所有患者依靠甲型肝炎典型癥狀和血清中抗HAV IgM陽性確診為甲型肝炎，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2000年9月西安中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)修訂的病毒性肝炎防治方案。選取同期于本院體檢中心健康體檢的志愿者60例為對(duì)照組。男性40例，女性20例；年齡26～43歲，平均（31±9.6）歲。入選患者及志愿者均對(duì)本研究?jī)?nèi)容充分知情，且均自愿簽署知情同意書后入組，符合倫理學(xué)要求。

1.2 靜脈血標(biāo)本

于恢復(fù)期采集甲型病毒性肝炎患者靜脈血抗凝（EDTA-Na2）全血2 ml及不抗凝血3 ml，分離血清。同時(shí)采集健康體檢志愿者靜脈血抗凝（EDTA-Na2）全血2 ml及不抗凝血3 ml，分離血清。

1.3 甲型肝炎患者和正常對(duì)照人群外周血單個(gè)核細(xì)胞TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用生物信息學(xué)知識(shí)，根據(jù)GeneBank中 的TIM-1 mRNA、TIM-4 mRNA和 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA全長(zhǎng)序列，用Primer Express軟件設(shè)計(jì)目的基因TIM-1、TIM-4和內(nèi)參照基因GAPDH引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的獲取及總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄將聚蔗糖-泛影葡胺分離液和預(yù)先稀釋的抗凝全血加入離心管中，密度梯度離心法2 000 r/min水平離心20 min后，小心吸取密集在血漿層和分層液界面中呈白色霧狀的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/L。Trizol法抽提外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，人TIM-1和TIM-4基因的cDNA文庫按照逆轉(zhuǎn)錄說明書寶生物工程（大連）有限公司合成。按照pMD18-T Simple載體說明書連接上述人TIM-1和TIM-4加A的片段。并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，在鏈霉素選擇性培養(yǎng)基上篩選，按藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑選白斑并用PCR菌液PCR證實(shí)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)根據(jù)NCBI GenBank中人GAPDH，TIM-1和TIM-4的基因序列，應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物：GAPDH正 向5'-CCAAACTACCTTCAACTCCATC-3'，反 向 5'-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3'；TIM-1正向 5'-CGTAATCCGAGGCATAAT-3'，反向 5'-AAGCGA CAACCCAAAGGT-3'；IM-1正向 5'-GCTAATCCCACG CATAAT-3'，反向 5'-ATGGAACAACCCAAATGT-3'。利用Prime-STAR HSDNA聚合酶（TaKaRa）分別擴(kuò)增人TIM-1和TIM-4全長(zhǎng)片段，退火溫度為60℃，純化PCR產(chǎn)物。qRT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，具體為real-time PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2 μl，25 mmol/L Mg2+3.5 μl，10 mmol/L dNTPs 0.4 μl，10 μmol/L引物各0.5 μl，普通TaqDNA聚合酶1 u（1 u/μl），質(zhì)粒 DNA 1 μl，牛血清白蛋白 BSA（1 mg/ml）2 μl，SYBR GreenI 20×1 μl，滅菌 H2O 8.1 μl。空白對(duì)照管加1.0 μl滅菌焦碳酸二乙酯（DEPC）水代替質(zhì)粒DNA，蓋上蓋后瞬間離心，使樣品聚集在毛細(xì)管底部，然后上機(jī)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4 min，然后3步反應(yīng)：95℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，再分別進(jìn)行熒光檢測(cè)，并做熔解曲線對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行鑒定，最后反應(yīng)冷卻至40℃。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)序檢驗(yàn)其特異性。

1.4 ELISA檢測(cè)外周血IL-4、IL-10、腫瘤壞死因子α和總Ig（IgG、IgM和IgA）水平

采用ELISA檢測(cè)外周血IL-4、IL-10、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）和總 Ig（IgG、IgM和IgA）水平。具體步驟：取抗凝血，采用12 000 r/min離心5 min。吸取上清液100 μl。室溫（18～25℃）溫育30 min，倒掉板內(nèi)液體，用清洗緩沖液洗板3次拍干，每孔滴加100 μl酶結(jié)合物室溫（18～25℃）溫育30 min，洗板3次拍干，滴加顯色液A和B各100 μl，室溫（18～25℃）避光溫育15 min后加終止液100 μl，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平比較

由qRT-PCR反應(yīng)曲線得到閾值循環(huán)數(shù)（threshold cycle number，Ct）值，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，采用GAPDH作為內(nèi)參照。ΔCt=Ct目的基因-Ct GAPDH 基因表達(dá)相對(duì)量 =2-ΔΔCt×100。其中甲型肝炎患者TIM-1、TIM-4 mRNA閾值循環(huán)數(shù)為分別為 Ct=39.662～ 2.136logX（r=0.682），Ct=30.279～3.028logX（r=0.748）。測(cè)得甲型肝炎患者恢復(fù)期以及對(duì)照組血清中的TIM-1和TIM-4的mRNA。結(jié)果見表1，甲型肝炎恢復(fù)期患者血清中TIM-1和TIM-4的mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 兩組外周血清中IL-4和IL-10水平比較

甲型病毒性肝炎恢復(fù)期患者血清中IL-4、IL-10和TNF-α的水平均高于對(duì)照組（P＜0.01）。其中IL-4水平在2次測(cè)量中變異較大，第2次測(cè)量中高于對(duì)照組。見表2。

2.3 兩組組外周血清中總Ig水平比較

甲型病毒性肝炎恢復(fù)期患者血清IgG和IgA水平都高于對(duì)照組（P＜0.05）。其中IgG的變異性較大，IgA的變異較?。患仔筒《拘愿窝谆颊吲c對(duì)照組IgM比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表1 兩組TIM-1和TIM-4 mRNA水平比較 （±s）

表1 兩組TIM-1和TIM-4 mRNA水平比較 （±s）

組別 TIM-1 TIM-4研究組 3.879±0.328 3.562±0.298對(duì)照組 0.453±0.091 0.289±0.017 t值 5.128 6.224 P值 0.000 0.000

表2 兩組外周血清中IL-4、IL-10及TNF-α水平比較（pg/ml，±s）

表2 兩組外周血清中IL-4、IL-10及TNF-α水平比較（pg/ml，±s）

組別 IL-4 IL-10 TNF-α研究組 102.3±15.1 140.3±6.7 69.2±9.8對(duì)照組 46.5±2.6 13.2±5.4 31.2±3.4 t值 4.136 5.668 5.002 P值 0.001 0.000 0.000

表3 甲型病毒性肝炎患者和對(duì)照組外周血清中總 Ig 水平比較 （IU/ml，±s）

表3 甲型病毒性肝炎患者和對(duì)照組外周血清中總 Ig 水平比較 （IU/ml，±s）

組別 IgG IgM IgA 總Ig研究組 250±140 15±6 210±60 640±220對(duì)照組 150±121 13±5 140±36 470±180 t值 3.668 0.768 2.854 3.275 P值 0.000 0.423 0.000 0.000

3 討論

TIM家族目前在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3個(gè)（TIM-1、TIM-3和TIM-4），作為T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)分子對(duì)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)起著重要作用[4]。TIM-1又稱HAVCR-1，是HAV的特異性受體；TIM-4是TIM-1的配體，特異性的表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（antigen present cell，APC）表面，且更多見于樹突狀細(xì)胞細(xì)胞（dendritic cell）表面[5]。研究發(fā)現(xiàn)，甲型肝炎患者痊愈后血清中的TIM-1和TIM-4的mRNA水平高于對(duì)照組，同時(shí)總Ig（IgG和IgA）水平也高于對(duì)照組。也就是說相比于對(duì)照組，HAV感染后患者的體液免疫能力會(huì)高于對(duì)照組，這與筆者的流行病學(xué)觀察結(jié)果一致。

IL-4和IL-10主要是由Th2（T help cell）分泌，是血液中重要的抗炎癥因子，具有促進(jìn)B細(xì)胞增值分化以及漿細(xì)胞分泌抗體的功能。TNF-α是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，參與細(xì)胞免疫和體液免疫。甲型病毒性肝炎患者愈后血清中IL-4、IL-10和TNF-α表達(dá)多于對(duì)照組，這可能是由于TIM-1和TIM-4傳遞一種細(xì)胞信號(hào)刺激Th2使其分泌的IL-4和IL-10增多，同時(shí)刺激單核巨噬分泌TNF-α增多。這與國(guó)外甲型病毒性肝炎患者恢復(fù)期Th2的功能增強(qiáng)的研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)TIM-4可誘導(dǎo)TIM-1胞內(nèi)尾巴區(qū)酪氨酸磷酸化，提供1個(gè)共刺激信號(hào)，增強(qiáng)IL-4啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并激活T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）轉(zhuǎn)錄和活化蛋白1（AP-1）促使T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生[6-8]。最新在斑馬魚上關(guān)于TIM-1和TIM-4的研究也證實(shí)TIM-1可以增強(qiáng)體液免疫能力而且具有記憶能力，這與甲型肝炎患者長(zhǎng)期的自我保護(hù)的能力是一致的[9]。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)，TIM-1和TIM-4可以相互作用通過影響樹突狀細(xì)胞DC來影響體液免疫的能力，且與Th2細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子IL-4和IL-10相關(guān)[11-12]。最近流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，甲型病毒性肝炎患者預(yù)后患哮喘和類風(fēng)濕等過敏性和自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)降低，而對(duì)于其他病毒感染也會(huì)有較強(qiáng)的抵抗能力，研究認(rèn)為可能是由于TIM-1和TIM-4之間傳遞一種雙向調(diào)節(jié)信號(hào)，可以既提高免疫耐受同時(shí)激活免疫防御[10-11]。但是實(shí)驗(yàn)還存在一些不足：TIM-1和TIM-4的具體相互關(guān)系以及如何刺激Th2細(xì)胞還是不清楚；筆者只是通過IL-4和IL-10間接反映Th2細(xì)胞的能力，至于是由于Th2細(xì)胞的增值還是活化還不清楚；同時(shí)樣本量還是偏小。下一步將通過基因敲除的大鼠同時(shí)結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步探討TIM-1和TIM-4與Th2細(xì)胞的具體作用機(jī)制；利用流式細(xì)胞方法進(jìn)一步檢測(cè)Th2細(xì)胞的數(shù)量來探討Th2細(xì)胞的增值和活化；利用基因芯片技術(shù)進(jìn)一步從TIM-1和TIM-4基因多態(tài)性角度進(jìn)一步闡述其對(duì)體液免疫調(diào)節(jié)的復(fù)雜機(jī)制。

TIM-1和TIM-4是調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的重要分子，對(duì)T細(xì)胞的影響是很容易理解，但如何調(diào)節(jié)體液免疫一直不太清楚。通過T細(xì)胞影響體液免疫還是直接影響B(tài)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)體液免疫也不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，TIM-1和TIM-4可能是通過刺激Th2細(xì)胞分泌IL-4和IL-10來激活體液免疫。對(duì)甲型病毒性肝炎患者而言，HAV病毒會(huì)特異性的結(jié)合于TIM-1，TIM-1高表達(dá)會(huì)較持續(xù)的激活T細(xì)胞進(jìn)一步影響B(tài)細(xì)胞。從而達(dá)到進(jìn)一步保護(hù)機(jī)體的作用。本研究結(jié)果認(rèn)為，可以通過接種低毒性的甲肝疫苗，從而達(dá)到刺激TIM-1和TIM-4的表達(dá)，從而給機(jī)體提供較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫的能力。筆者相信通過對(duì)甲型病毒性肝炎患者血清中的TIM-1和TIM-4的進(jìn)一步研究，可為T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞提供一種新的方式[13]。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] MCINTIRE J J, UMETSU S E, AKBARI O, et al. Identification of Tapr (an airway hyperreactivity regulatory locus) and the linked Tim gene family[J]. Nat Immunol, 2001, 2(12): 1109-1116.

[2] RENNERT P D. Novel roles for TIM-1 in immunity and infection[J]. Immunology Letters, 2011, 141(1): 28-35.

[3] KIM H Y, EYHERAMONHO M B, PICHAVANT M, et al. A polymorphism in TIM1 is associated with susceptibility to severe hepatitis A virus infection in humans[J]. Journal of Clinical Investigation, 2011, 121(3): 1111-1118.

[4] RODRIGUEZ-MANZANET R, DEKRUYFF R, KUCHROO V K,et al. The costimulatory role of TIM molecules[J]. Immunol Rev,2009, 229(1): 259-270.

[5] MEYERS J H, CHAKRAVARTI S, SCHLESINGER D, et al.TIM-4 is the ligand for TIM-1, and the TIM-1–TIM-4 interaction regulates T cell proliferation[J]. Nature Immunology, 2005, 6(5):455-464.

[6] ZHAO C Q, LI T L, HE S H, et al. Specific immunotherapy suppresses Th2 responses via modulating TIM1/TIM4 interaction on dendritic cells[J]. Allergy, 2010, 65(8): 986-995.

[7] YEUNG M Y, DING Q, BROOKS C R, et al. TIM-1 signaling is required for maintenance and induction of regulatory B cells[J].American Journal of Transplantation, 2015, 15(4): 942-953.

[8] SUN H W, WU C, TAN H Y, et al. A new development of FG-CC’siRNA blocking interaction of Tim-1 and Tim-4 can enhance DC vaccine against gastric cancer[J]. Hepatogastroenterology, 2012,59(120): 2677-2682.

[9] XU X G, HU J F, MA J X, et al. Essential roles of TIM-1 and TIM-4 homologs in adaptive humoral immunity in a Zebrafish model[J].J Immunol, 2016, 196(4): 1686-1699.

[10] de SOUZA A J, ORISS T B, O’MALLEY K J, et al. T cell Ig and mucin 1 (TIM-1) is expressed on in vivo-activated T cells and provides a costimulatory signal for T cell activation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(47): 17113-17118.

[11] CHAKRAVARTI S, SABATOS C A, XIAO S, et al. Tim-2 regulates T helper type 2 responses and autoimmunity[J]. The Journal of Experimental Medicine, 2005, 202(3): 437-444.

[12] XIAO S, ZHU B, JIN H, et al. Tim-1 stimulation of dendritic cells regulates the balance between effector and regulatory T cells[J].Eur J Immunol, 2011, 41(6): 1539-1549.

[13] DU P, XIONG R, LI X, et al. Immune regulation and antitumor effect of TIM-1[J]. Journal of Immunology Research, 2016(2016):1-6.