楊璇，高菲，劉文君

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科，四川 瀘州 646000）

慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是造血干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，其發(fā)病率為1～2/100 000[1]。隨著CML病程的進(jìn)展其化療耐藥性也隨之增加，化療失敗是CML高死亡率的關(guān)鍵因素。因此，發(fā)現(xiàn)能提高治療效果的新方法并且克服藥物的耐藥性具有重要意義。微小RNA（MicroRNAs，miRNA）是大小為18～25個(gè)核苷酸，進(jìn)化高度保守的內(nèi)生非編碼小RNAs。其在腫瘤中異常表達(dá)，并且能作為癌基因通過結(jié)合目標(biāo)mRNA的3'-UTR抑制mRNA的翻譯或裂解目標(biāo)mRNAs誘導(dǎo)其退化[2]。除了實(shí)體腫瘤，miRNA也在許多不同的血液惡性腫瘤中異常表達(dá)，如慢性淋巴白血病、急性髓系白血病、骨髓增殖性腫瘤。對CML，ROKAH等[3]發(fā)現(xiàn)與對照組細(xì)胞相比，下調(diào)K562細(xì)胞中的miRNA-31、miRNA-34a、miRNA-155及miRNA-564后，miRNA在CML發(fā)病機(jī)制中具有潛在的作用，miRNAs可能是CML治療的新靶點(diǎn)[4]。大黃的藥用成分是大黃素甲醚，曾被用作瀉藥，有護(hù)肝、抗炎及抗菌的特性。研究發(fā)現(xiàn)大黃素甲醚能夠干預(yù)癌細(xì)胞的生理活動(dòng)，其中包括細(xì)胞凋亡[5-6]，細(xì)胞生長周期[7]及轉(zhuǎn)移[8]。然而，大黃素甲醚在血液惡性腫瘤中的作用尚未闡明。本研究將探討miRNA-146a對CML細(xì)胞（K562/ADM）耐藥性的影響以及大黃素甲醚對K562/ADM多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人CML細(xì)胞系K562細(xì)胞和耐阿霉素細(xì)胞系K562/ADM（由中國上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供），CCK-8試劑盒（購自中國碧云天公司），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒、增加通透性試劑盒（購自BD公司），Hoechst33258（購自美國Sigma公司），總miRNA提取試劑盒、TaqMan探針、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國Applied Biosystems公司），總RNA提取試劑盒（購自中國天根生化科技有限公司），miRNA-146a mimic、miRNA-con的慢病毒載體及miRNA-146a inhibitor（購自德國Qiagen公司），LipofectamineTM2000（購自美國Invitrogen公司），抗鼠CXCR4-PE抗體（購自美國eBioscience公司），CXCR4及β-actin抗體（購自中國Abcam公司），辣根過氧化物酶（購自中國Boster公司），Transwell小室（購自美國Corning公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將2種細(xì)胞懸浮于含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素雙抗完全培養(yǎng)基中并接種在培養(yǎng)瓶，維持細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，置于二氧化碳CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，飽和濕度90%的37℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。在K562/ADM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5 mg/ml的ADM維持細(xì)胞系的耐藥性，實(shí)驗(yàn)前用無ADM培養(yǎng)基至少培養(yǎng)2周。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8檢測運(yùn)用藥物干預(yù)2種細(xì)胞前，在96孔板中調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×103個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h。按CCK-8說明書用移液槍吸取100 μl細(xì)胞懸液加入96孔板中，同時(shí)設(shè)置對照組（加入等量培養(yǎng)液）和空白調(diào)零組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔再加10 μl的CCK-8溶液，在450 nm處用酶標(biāo)儀測量各孔的OD值求得均值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率=（OD對照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。半數(shù)抑制率計(jì)算采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析（LOGIT方法），耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=空白對照組IC50/逆轉(zhuǎn)組 IC50。

1.3.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)將K562/ADM細(xì)胞懸浮于含有不同濃度大黃素甲醚的RPMI 1640瓊脂糖混合物中，并接種于底面鋪有RPMI 1640瓊脂糖固體培養(yǎng)基的6孔板中。不更換新鮮培養(yǎng)基，將其置于溫度為37℃，飽和濕度95%、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)14 d。選取超過50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)并用結(jié)晶紫染色，細(xì)胞拍照記錄。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst 33258檢測細(xì)胞凋亡用不同濃度的大黃素甲醚干預(yù)K562/ADM 48 h，收集細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，按每份100 μl的細(xì)胞懸液進(jìn)行分裝備用。每個(gè)樣本加入2 μl的Annexin V-FITC和2 μl的PI染色混勻后，避光，室溫孵育5 min；上機(jī)前加入400 μl的Binding Buffer，流式細(xì)胞儀對1×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。Annexin V-FITC陽性的細(xì)胞為進(jìn)行性凋亡的細(xì)胞，而FITC陰性細(xì)胞為存活的細(xì)胞。

Hoechst33258同樣被用來檢測凋亡細(xì)胞，細(xì)胞與Hoechst33258的高親和力表明細(xì)胞凋亡。處理后的K562/ADM細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后每孔加入500 μl預(yù)冷的乙醇固定10 min。然后加入1 μmol/L Hoechst 33258染色10 min后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。200個(gè)細(xì)胞在3個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域被計(jì)數(shù)并計(jì)算凋亡細(xì)胞核染色的發(fā)生率。

1.3.4 miRNA-146a下調(diào)、過表達(dá)及測定K562/ADM或K562細(xì)胞接種在96孔板中孵育過夜，然后根據(jù)LipofectamineTM2000說明書將細(xì)胞與miRNA-146a mimic、miRNA-146a抑制劑及空白的miRNA-con載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效率用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）進(jìn)行分析確定。

在miRNA檢測中，應(yīng)用總miRNA提取試劑盒提取總miRNA，miRNA-146a通過探針qRT-PCR檢測。應(yīng)用總RNA提取試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR法擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參照基因人GAPDH，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)已發(fā)布的序列[9]合成。應(yīng)用比較ΔCt法對qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.5 siRNA下調(diào)CXCR4的表達(dá)CXCR4 siRNA寡核苷酸序列由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)已發(fā)布的序列[10]合成，同時(shí)設(shè)計(jì)合成1條競爭序列作為對照。取對數(shù)生長期的K562/ADM細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/ml，孵育過夜，根據(jù)LipofectamineTM2000說明書將細(xì)胞與siRNA載體及競爭的siRNA載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)孵育48 h后用Western blot分析其下調(diào)作用進(jìn)行驗(yàn)證。

處理后，收集K562/ADM細(xì)胞加裂解液至冰上30 min后粉碎細(xì)胞，收集蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。蛋白經(jīng)特殊的一抗和抗兔多克隆抗體處理后被檢測，β-actin作為內(nèi)參照，經(jīng)TBST再次清洗后加入辣根過氧化物酶進(jìn)行檢測。信號檢測使用化學(xué)發(fā)光底物，結(jié)果用Band Scan軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)在使用增加通透性的試劑盒之前先用抗鼠CXCR4-PE抗體固定K562/ADM細(xì)胞，然后用同樣的抗體對細(xì)胞進(jìn)行第2次固定。使用FACS Calibur和Flow Jo軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.7 質(zhì)粒的構(gòu)建及熒光素酶活性的檢測①質(zhì)粒的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[11]。利用人基因組特定引物通過PCR對包括3'-UTR的片段進(jìn)行擴(kuò)增（正向5'-G CTCTAGACACAGATGTA-AAAGAC-3'；反向 5'-GCTC TAGACCACTGGTACAAAATCTTTATGTAAG-3'），并且插入1個(gè)pGL3載體到反向熒光素酶基因的終止密碼子，從而引起pGL3-3'-UTR/CXCR4的構(gòu)成。②熒光素酶活性的檢測。293T受體細(xì)胞暫時(shí)性地與0.2 μg的pGL3-3'-UTR/CXCR4結(jié)構(gòu)結(jié)合，0.02 μg的pRL-TKRenilla熒光素質(zhì)粒包含標(biāo)準(zhǔn)化的Renilla熒光素及5 pmol的miRNA-146a的過表達(dá)或?qū)φ召|(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后溶解，根據(jù)設(shè)備說明書用雙熒光素酶分光光度計(jì)檢測系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶的活性測量。

1.3.8 遷移實(shí)驗(yàn)K562/ADM經(jīng)不同濃度的大黃素甲醚干預(yù)48 h后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液放于上層小室，100 ng/ml CXCL12放在下層小室。隨后孵育8 h，未遷移的細(xì)胞在表面被移除，遷移細(xì)胞染色計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-146a在K562/ADM細(xì)胞中的表達(dá)

根據(jù)CCK-8分析，K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞經(jīng)ADM干預(yù)48 h后的IC50分別為0.15和3.50 μmol/L，K562/ADM細(xì)胞的耐藥倍數(shù)是K562細(xì)胞的23倍多，見表1。與K562細(xì)胞比較，K562/ADM細(xì)胞中miRNA-146a的表達(dá)較低，表明miRNA-146a在K562細(xì)胞對ADM的獲得性耐藥中具有重要作用。見表2。

2.2 下調(diào)miRNA-146a對K562細(xì)胞ADM抵抗性的影響

轉(zhuǎn)染miRNA-146a inhibitor后miRNA-146a的表達(dá)水平降低。細(xì)胞生存實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)miRNA-146a后的K562細(xì)胞的生存率高于K562細(xì)胞及對照組（IC50分別為2.80、0.15及0.18 μmol/L，見表1）。另外，流式細(xì)胞術(shù)同樣顯示下調(diào)miRNA-146a能增強(qiáng)K562細(xì)胞抵抗ADM誘導(dǎo)的凋亡（見表3和圖1），總的來說，該結(jié)果顯示miRNA-146a與K562細(xì)胞對ADM耐藥有關(guān)。

表1 ADM干預(yù)48 h的IC50 （n =3，μmol/L，±s）

表1 ADM干預(yù)48 h的IC50 （n =3，μmol/L，±s）

IC50細(xì)胞系K562/ADM 3.50±0.30 K562/ADM+NC 3.20±0.15 K562 0.15±0.06 K562+NC 0.18±0.03 K562+miRNA-146a inhibitor 0.18±0.03 K562/ADM+miRNA-146a mimic 0.42±0.05 K562/ADM+大黃素甲醚（2 μmol/L） 1.70±0.30 K562/ADM+大黃素甲醚（5 μmol/L） 0.68±0.12 F值 93.679 P值 0.000

表2 miRNA-146a在K562/ADM及K562細(xì)胞中的表達(dá)（n =3，±s）

表2 miRNA-146a在K562/ADM及K562細(xì)胞中的表達(dá)（n =3，±s）

細(xì)胞系 miRNA K562 0.98±0.03 K562/ADM 0.29±0.02 t值 33.147 P值 0.000

2.3 上調(diào)miRNA-146a對K562/ADM細(xì)胞ADM敏感性的影響

miRNA-146a的作用通過應(yīng)用miRNA-146a mimic被進(jìn)一步研究。與K562/ADM細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的K562/ADM細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miRNA-146a mimic的K562/ADM細(xì)胞中的miRNA-146a表達(dá)增高，見表4和圖2。CCK-8檢測顯示K562/ADM細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-146a mimic以后，與K562/ADM細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的K562/ADM細(xì)胞相比能增強(qiáng)K562/ADM細(xì)胞對ADM的敏感性（IC50為0.42、3.50和3.20 μmol/L，見表1）。相應(yīng)地，上調(diào)miRNA-146a能使K562/ADM細(xì)胞對ADM誘導(dǎo)凋亡的作用更敏感。

2.4 調(diào)節(jié)miRNA-146a對K562細(xì)胞ADM耐藥的影響

下調(diào)或者上調(diào)K562細(xì)胞中的miRNA-146a未能引起P-gp或者M(jìn)RP-1的mRNA的改變。相反，miRNA-146a的表達(dá)與CXCR4 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見表5。另外，流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分析也顯示miRNA-146a的表達(dá)與CXCR4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（見表6和圖3）。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示CXCR4 siRNA抑制CXCR4表達(dá)的增加是由miRNA-146a inhibitor引起的（見表7和圖4）。另外，通過miRNA-146a inhibitor的誘導(dǎo)下調(diào)CXCR4的表達(dá)能降低K562細(xì)胞的耐藥性（見表8和圖5），表明miRNA-146a通過CXCR4在K562耐藥細(xì)胞中發(fā)揮其功能。

表3 miRNA-146a在各組K562細(xì)胞中的miRNA表達(dá)及對細(xì)胞凋亡的影響 （n =3，±s）

表3 miRNA-146a在各組K562細(xì)胞中的miRNA表達(dá)及對細(xì)胞凋亡的影響 （n =3，±s）

細(xì)胞系 miRNA 細(xì)胞凋亡率/%K562 1.00±0.04 16.61±1.22 K562+NC 0.97±0.03 14.93±0.73 K562+miRNA-146a inhibitor 0.25±0.06 2.62±0.09 F值 266.016 258.755 P值 0.000 0.000

表4 miRNA-146a在各組K562/ADM細(xì)胞中的miRNA表達(dá)及對細(xì)胞凋亡的影響 （n =3，±s）

表4 miRNA-146a在各組K562/ADM細(xì)胞中的miRNA表達(dá)及對細(xì)胞凋亡的影響 （n =3，±s）

細(xì)胞系 miRNA 細(xì)胞凋亡率/%K562/ADM 0.97±0.07 12.31±1.20 K562/ADM+NC 0.95±0.05 15.34±2.34 K562/ADM+miRNA-146a mimic 2.69±0.21 48.11±6.45 F值 174.361 73.108 P值 0.000 0.000

圖1 miRNA-146a inhibitor干預(yù)后各組K562細(xì)胞的凋亡情況

圖2 過表達(dá)miRNA-146a對K562/ADM細(xì)胞凋亡的影響

2.5 大黃素甲醚對K562/ADM細(xì)胞ADM敏感性的影響

大黃素甲醚減少K562/ADM細(xì)胞的生存能力，且呈劑量依賴性。當(dāng)K562/ADM細(xì)胞受到相同劑量大黃素甲醚干預(yù)時(shí)，孵育48 h的抗惡性細(xì)胞增生的作用比24 h更明顯。然而，當(dāng)將大黃素甲醚的干預(yù)時(shí)間延長到72 h，未觀察到進(jìn)一步的細(xì)胞抑制作用（見表1）。給予大黃素甲醚2和5 μmol/L干預(yù)48 h后并未顯示出對K562/ADM細(xì)胞毒性作用（生長抑制率＜10%），所以選擇該劑量檢查大黃素甲醚能否逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞的耐藥性。CCK-8結(jié)果顯示選用2和5 μmol/L濃度的大黃素甲醚干預(yù)細(xì)胞后能降低K562/ADM細(xì)胞對ADM的IC50，IC50分別從3.50 μmol/L降到1.70和0.68 μmol/L。結(jié)果顯示，大黃素甲醚能增強(qiáng)K562/ADM細(xì)胞對ADM的敏感性，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)在2和5 μmol/L濃度下分別為2.03和5.30倍（見表1）。逆轉(zhuǎn)耐藥也可以經(jīng)克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與單獨(dú)用ADM干預(yù)的細(xì)胞比較，當(dāng)大黃素甲醚和ADM聯(lián)合作用于K562/ADM時(shí)，細(xì)胞集落數(shù)及集落大為減少，支持大黃素甲醚能增強(qiáng)K562/ADM細(xì)胞對ADM的敏感性。見表10和圖6。流式細(xì)胞儀分析表明與單獨(dú)用ADM干預(yù)比較，大黃素甲醚濃度在2和5 μmol/L能增加K562/ADM細(xì)胞的凋亡，見表11和圖7A。另外，Hoechst染色也進(jìn)一步表明通過大黃素甲醚能增強(qiáng)ADM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，見圖7B。雖然大黃素甲醚自身不能誘導(dǎo)凋亡，但是通過核凝結(jié)能明確其對K562/ADM細(xì)胞的凋亡具有影響。

表5 調(diào)節(jié)miR-146a對細(xì)胞中P-gp、MRP-1及CXCR4表達(dá)的影響 （n =3，±s）

表5 調(diào)節(jié)miR-146a對細(xì)胞中P-gp、MRP-1及CXCR4表達(dá)的影響 （n =3，±s）

P-gp mRNA MRP-1 mRNA CXCR4 mRNA K562 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.03 K562+NC 1.02±0.05 0.98±0.04 0.97±0.03 K562+miRNA-146a inhibitor 0.96±0.04 0.95±0.03 1.96±0.12 K562/ADM 1.00±0.04 1.00±0.06 0.98±0.03 K562/ADM+NC 0.98±0.04 0.94±0.07 0.97±0.03 K562/ADM+miRNA-146a mimic 1.02±0.04 0.95±0.03 0.49±0.09 F值 1.058 0.836 160.149 P值 0.429 0.549 0.000細(xì)胞系

表6 CXCR4在各組K562和K562/ADM細(xì)胞中的表達(dá) （n =3，±s）

表6 CXCR4在各組K562和K562/ADM細(xì)胞中的表達(dá) （n =3，±s）

CXCR4的相對蛋白表達(dá)量K562 0.98±0.05 1.00±0.05 K562+NC 0.97±0.05 1.04±0.07細(xì)胞系 表面CXCR4的相對表達(dá)量K562+miRNA-146a inhibitor 2.25±0.26 1.85±0.17 K562/ADM 1.00±0.03 1.00±0.02 K562/ADM+NC 1.03±0.07 0.96±0.05 K562/ADM+miRNA-146a mimic 0.35±0.12 0.43±0.05 F值 74.915 89.579 P值 0.000 0.000

表7 miRNA-146a調(diào)節(jié)CXCR4對K562細(xì)胞ADM 耐藥性的影響 （n =3，±s）

表7 miRNA-146a調(diào)節(jié)CXCR4對K562細(xì)胞ADM 耐藥性的影響 （n =3，±s）

CXCR4蛋白表達(dá)無處理組 0.99±0.13 0.96±0.08組別 CXCR4的mRNA表達(dá)miRNA-146a inhibitor 1.96±0.12 2.06±0.19 miRNA-146a inhibitor+Control siRNA 1.87±0.15 1.96±0.26 miRNA-146a inhibitor+CXCR4 siRNA 1.29±0.13 1.19±0.16 F值 7.831 26.696 P值 0.009 0.000

圖3 CXCR4在K562或K562/ADM細(xì)胞中的表達(dá)及與miRNA-146a表達(dá)的關(guān)系

圖4 miRNA-146a inhibitor轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞中CXCR4的蛋白表達(dá)經(jīng)CXCR4 siRNA降低

表8 miRNA-146a及CXCR4對K562細(xì)胞凋亡及活性的影響 （n =3，%，±s）

表8 miRNA-146a及CXCR4對K562細(xì)胞凋亡及活性的影響 （n =3，%，±s）

組別 細(xì)胞活性 細(xì)胞凋亡率無處理組 98.45±6.11 1.92±0.21 ADM（0.1 μmol/L） 57.34±6.23 16.62±2.53 ADM（0.1 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor 87.22±9.42 2.64±0.52 ADM（0.1 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor+Control siRNA 82.46±12.33 3.22±0.64 ADM（0.1 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor+CXCR4 siRNA 68.34±9.25 13.91±2.33 F值 9.525 7.750 P值 0.002 0.004

2.6 大黃素甲醚調(diào)節(jié)miRNA-146a和干預(yù)CXCL 12/CXCR4信號對K562/ADM細(xì)胞耐藥的影響

結(jié)果表明，大黃素甲醚干預(yù)能導(dǎo)致K562/ADM細(xì)胞中miRNA-146a水平呈劑量依賴性增加，見表12。除此以外，本研究結(jié)果還表明大黃素甲醚增強(qiáng)敏感性的作用經(jīng)miRNA-146a inhibitor干預(yù)后幾乎完全消失，表明大黃素甲醚通過調(diào)節(jié)miRNA-146a逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞的多藥耐藥（見表13和圖8）。與大黃素甲醚對miRNA-146a的影響相一致，大黃素甲醚干預(yù)導(dǎo)致K562/ADM細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4的表達(dá)呈劑量依賴性降低（見表14和圖9）。另外，遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)大黃素甲醚干預(yù)后遷移受損（見表15和圖10）。大黃素甲醚通過上調(diào)miRNA-146a調(diào)節(jié)CXCR4的表達(dá)且干擾CXCR12與CXCR4的結(jié)合。

圖5 miRNA-146a及CXCR4對K562細(xì)胞凋亡的影響

圖6 單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測大黃素甲醚聯(lián)合ADM對K562/ADM細(xì)胞活性的影響

表9 不同濃度的大黃素甲醚對K562/ADM細(xì)胞活性的影響 （n =3，±s）

表9 不同濃度的大黃素甲醚對K562/ADM細(xì)胞活性的影響 （n =3，±s）

大黃素甲醚的濃度 細(xì)胞活性/%0 μmol/L 96.21±5.01 2 μmol/L 92.03±7.32 5 μmol/L 84.12±6.45 10 μmol/L 77.08±10.34 F值 97.678 P值 0.000

表10 大黃素甲醚聯(lián)合ADM對K562/ADM細(xì)胞活性的影響 （n =3，±s）

表10 大黃素甲醚聯(lián)合ADM對K562/ADM細(xì)胞活性的影響 （n =3，±s）

細(xì)胞克隆數(shù)無藥物組 100±6 ADM（1.5 μmol/L） 78±9 ADM（1.5 μmol/L）+2 μmol/L 大黃素甲醚 62±8 ADM（1.5 μmol/L）組 +5 μmol/L 大黃素甲 42±6 F值 33.382 P值 0.000組別

圖7 大黃素甲醚聯(lián)合ADM對K562/ADM細(xì)胞凋亡的影響

表11 大黃素甲醚聯(lián)合ADM對K562/ADM細(xì)胞凋亡的影響 （n =3，±s）

表11 大黃素甲醚聯(lián)合ADM對K562/ADM細(xì)胞凋亡的影響 （n =3，±s）

細(xì)胞克隆數(shù)無藥物組 1.61±0.23 ADM（1.5 μmol/L） 12.33±1.62 ADM（1.5 μmol/L）+2 μmol/L 大黃素甲醚 22.43±3.62 ADM（1.5 μmol/L）+5 μmol/L 大黃素甲醚 38.12±5.64 F值 68.015 P值 0.000組別

表12 大黃素甲醚干預(yù)下K562/ADM細(xì)胞中miRNA-146a miRNA 的相對表達(dá)量 （n =3，±s）

表12 大黃素甲醚干預(yù)下K562/ADM細(xì)胞中miRNA-146a miRNA 的相對表達(dá)量 （n =3，±s）

大黃素甲醚的濃度 miRNA-146a miRNA的相對表達(dá)量0 μmol/L 1.03±0.12 2 μmol/L 1.26±0.16 5 μmol/L 1.69±0.21 F值 12.011 P值 0.008

表13 K562/ADM細(xì)胞中降低miRNA-146a后大黃素甲醚對細(xì)胞活性及凋亡的影響 （n =3，±s）

表13 K562/ADM細(xì)胞中降低miRNA-146a后大黃素甲醚對細(xì)胞活性及凋亡的影響 （n =3，±s）

細(xì)胞凋亡率/%無藥物組 99.61±4.11 1.62±0.21 ADM（1.5 μmol/L） 61.09±6.5412.62±3.63組別 細(xì)胞活性率/%ADM（1.5 μmol/L）+大黃素甲醚（5 μmol/L） 21.23±4.0538.46±5.25 ADM（1.5 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor 67.34±8.33 9.32±1.04 ADM（1.5 μmol/L）+大黃素甲醚（5 μmol/L）+miRNA-146a inhibitor 53.03±6.0123.21±2.13 F值 67.886 63.231 P值 0.000 0.000

表14 大黃素甲醚對K562/ADM細(xì)胞中CXCR4 表達(dá)的影響 （n =3，±s）

表14 大黃素甲醚對K562/ADM細(xì)胞中CXCR4 表達(dá)的影響 （n =3，±s）

CXCR4的蛋白相對表達(dá)量0 μmol/L 0.98±0.02 1.00±0.03 2 μmol/L 0.72±0.16 0.67±0.12 5 μmol/L 0.35±0.04 0.32±0.09 F值 32.685 44.474 P值 0.001 0.000大黃素甲醚的濃度 CXCR4的 mRNA相對表達(dá)量

圖8 K562/ADM細(xì)胞中降低miRNA-146a后大黃素甲醚對ADM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

圖9 大黃素甲醚對K562/ADM細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)的影響

表15 大黃素甲醚對CXC12和CXCR4結(jié)合的影響（n =3，%，±s）

表15 大黃素甲醚對CXC12和CXCR4結(jié)合的影響（n =3，%，±s）

細(xì)胞遷移率無藥物組 100±6 CXCL12（100 ng/ml） 195±21 CXCL12（100 ng/ml）+2 μmol/L 大黃素甲醚 121±16 CXCL12（100 ng/ml）+5 μmol/L 大黃素甲醚 106±9 F值 28.408 P值 0.000組別

3 討論

作為一組高度保守非蛋白編碼的RNAs，miRNA能調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中各種各樣目標(biāo)基因的表達(dá)，因此，其在細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)展及分化中具有重要作用。miRNA-146a第1次發(fā)現(xiàn)于先天免疫和炎癥反應(yīng)的微生物感染中，現(xiàn)在已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在致癌作用和實(shí)體腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中具有重要作用[12-13]。其在基因敲除小鼠骨髓和淋巴惡性腫瘤中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[14]。GARZON等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA-146a在骨髓CD34+細(xì)胞正常的捐贈(zèng)者中表達(dá)相對較高的水平，然而在急性髓系白血病患者中低表達(dá)，甚至在來自健康捐贈(zèng)者的外周血或骨髓中的單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞中的表達(dá)水平更低[15]。XU等也報(bào)道，miRNA-146a作為癌基因在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的作用及其通過抑制Smad4有助于miRNA-146a的增高[16]。然而，miRNA-146a在CML的作用仍有待闡明。筆者的研究結(jié)果表明，miRNA-146a在耐藥K562/ADM細(xì)胞中的表達(dá)低于對藥物較敏感的K562細(xì)胞，上調(diào)miRNA-146a通過抑制趨化因子受體CXCR4的表達(dá)能恢復(fù)K562/ADM細(xì)胞對ADM的敏感性，大黃素甲醚通過上調(diào)miRNA-146a抑制CXCR4表達(dá)而增加K562/ADM細(xì)胞對ADM的敏感性。

越來越多的數(shù)據(jù)表明，miRNA因?yàn)槠湔{(diào)節(jié)耐藥相關(guān)基因的能力而參與在化療耐藥的腫瘤治療中。miRNA-146 a與耐藥性腫瘤細(xì)胞的相關(guān)性也在一些研究中被描述。與MCF-7敏感細(xì)胞比較，在順鉑耐藥性乳腺癌MCF-7細(xì)胞中miRNA-146a上調(diào)[17]。在肝癌細(xì)胞的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，耐IFN-α細(xì)胞中miRNA-146a的表達(dá)高于IFN-α敏感細(xì)胞[10]。ZHUO等在另一項(xiàng)關(guān)于肝癌細(xì)胞的研究中報(bào)道m(xù)iRNA-146a在耐藥細(xì)胞系中上調(diào)[18]。在結(jié)直腸癌中miRNA-146a的高表達(dá)與西妥昔單抗耐藥性和預(yù)后較差相關(guān)[19]。然而，相反的結(jié)果報(bào)道，miRNA-146a被發(fā)現(xiàn)在耐順鉑卵巢癌A2780細(xì)胞中低水平表達(dá)，盡管miRNA-146a inhibiter無法建立A2780細(xì)胞的耐藥性[20]。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miRNA-146a的低表達(dá)與前期臨床TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)[21]。另外，最近的研究表明，miRNA-146的藥物誘導(dǎo)能增強(qiáng)替莫唑胺誘導(dǎo)人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的敏感性[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a在耐ADM的K562細(xì)胞中的表達(dá)降低。此外，在敏感的K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miRNA-146a inhibiter后表明細(xì)胞抵抗ADM誘導(dǎo)凋亡，而轉(zhuǎn)染miRNA-146a mimic的K562/ADM細(xì)胞則恢復(fù)其對ADM的敏感性。還發(fā)現(xiàn)miRNA-146a能提高K562細(xì)胞對ADM的耐藥性。筆者推測miRNA-146a誘導(dǎo)耐藥性的作用在不同腫瘤中有特定的作用。鑒于miRNA-146a在癌細(xì)胞中的目標(biāo)不止1個(gè)信號通路，miRNA-146a是否促進(jìn)或抗耐藥可能取決于調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的特定關(guān)鍵信號通路。

CXCR4是在造血細(xì)胞和上皮癌細(xì)胞上表達(dá)的趨化因子受體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其通過調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用，從而保護(hù)白血病細(xì)胞免于自發(fā)和化療所致的死亡。因此，CXCR4被認(rèn)為是影響急性髓系白血病生存和耐藥白血病預(yù)后的一個(gè)關(guān)鍵因素。筆者的研究結(jié)果表明miRNA-146a與CXCR4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。另外，通過下調(diào)miRNA-146a建立的K562細(xì)胞對ADM的抵抗性可以通過CXCR4 siRNA降低，這表明CXCR4是介導(dǎo)下調(diào)miRNA-146a產(chǎn)生ADM耐藥結(jié)果的關(guān)鍵因素。除此以外，筆者發(fā)現(xiàn)miRNA-146a直接針對CXCR4 mRNA的3'-UTR并抑制其表達(dá)，與最近的一項(xiàng)研究是一致的[23]。有趣的是，最近的一項(xiàng)研究報(bào)道CXCR43'-UTR的過表達(dá)抑制miRNA-146a的活性，從而提高乳腺癌MCF-7細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，表明通過miRNA-146a調(diào)節(jié)CXCR4可能并是想象的那樣簡單[10]。然而，miRNA-146a和CXCR4之間更復(fù)雜的關(guān)系及其在K562細(xì)胞耐藥性中的作用需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

大黃素甲醚在2005年作為活性成分在多孢菌屬的培養(yǎng)中被分離出來。后來的研究發(fā)現(xiàn)大黃素甲醚分別在人類乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[6，8]。另外，ELF等報(bào)道大黃素甲醚在裸鼠異種移植中通過抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶抑制癌癥細(xì)胞增殖和腫瘤生長[24]。在本研究中，筆者為大黃素甲醚對miRNA-146a調(diào)節(jié)效應(yīng)及其逆轉(zhuǎn)耐藥的能力提供第1個(gè)證據(jù)，支持天然化合物可以針對多個(gè)信號通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的這個(gè)概念。

總之，本研究結(jié)果表明下調(diào)miRNA-146和上調(diào)CXCR4可能與K562/ADM細(xì)胞的耐藥性有關(guān)。另外，大黃素甲醚可以通過誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá)抑制CXCL12/CXCR4信號從而逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞對ADM的耐藥性。鑒于大黃素甲醚對正常細(xì)胞的毒性較低，其可以考慮作為1個(gè)潛在的CML的候選輔助治療劑。

參 考 文 獻(xiàn)：

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