李澤，孟哲，李宇娜，陶海龍，白中樂(lè)，李凌

[鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科（河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室），河南 鄭州 450052]

心肌纖維化指在致病因素作用下，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)量沉積，最終導(dǎo)致心臟收縮舒張功能受損的病理性改變[1]。血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）能夠誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量生成，導(dǎo)致ROS的生成和清除失衡，進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生和進(jìn)展[2-3]。

丹參酮ⅡA是我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的重要活性成分。丹參酮ⅡA磺酸鈉（sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS）是丹參酮ⅡA經(jīng)磺化而得到的水溶性藥物。研究表明[4-6]，STS具有抗氧化應(yīng)激、抗纖維化及保護(hù)心肌等作用。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子 2（nuclear factor erythroid 2-ralated factor 2，Nrf2）和其胞質(zhì)接頭蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）參與調(diào)控細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究旨在觀察STS能否減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化，以及這種抗纖維化的作用是否依賴(lài)于Nrf2信號(hào)通路，為其應(yīng)用于臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Ang Ⅱ（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），Alzet微量滲透泵（美國(guó)Durect公司），STS（上海第一生化藥業(yè)有限公司），細(xì)胞核/細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、組織蛋白抽提試劑盒（北京康維世紀(jì)生物科技有限公司），Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），兔抗大鼠Keap1多克隆抗體、小鼠抗大鼠Nrf2單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），兔抗大鼠Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）、血紅素加氧酶1（HO-1）及醌氧化還原酶1（NQO1）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗大鼠GCLC多克隆抗體（上海生工生物工程有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）Master Mix、SYBR ? Green real time PCR Master Mix（日本Toyobo公司），總谷胱甘肽（total glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及脂質(zhì)氧化丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 方法

1.3.1 心肌纖維化模型復(fù)制及處理40只健康SD大鼠隨機(jī)分成5組，分別為對(duì)照組、模型組、低劑量STS組、中劑量STS組、高劑量STS組。采用SNIJDER等[7]所用方法，皮下植入微量滲透泵緩釋AngⅡ復(fù)制大鼠心肌纖維化模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。將大鼠用10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉后，背部肩胛區(qū)除毛，消毒后切開(kāi)皮膚，對(duì)照組植入預(yù)裝0.9%生理鹽水的微量滲透泵，模型組與各STS組植入預(yù)裝Ang Ⅱ[435 ng/（kg·min）]的微量滲透泵，縫合切口。從術(shù)后24 h開(kāi)始，對(duì)照組及模型組分別給予0.9%生理鹽水[10 ml/（kg·d）]腹腔注射，低、中、高劑量STS組分別給予STS[5、10及20 ml/（kg·d）]腹腔注射，共注射3周。

1.3.2 取材及切片最后一次腹腔注射后24 h，將大鼠處死后立即開(kāi)胸摘取心臟，0.9%生理鹽水灌洗，于室間隔處分離左心室，取部分左心室置于10%甲醛固定（標(biāo)本用10%甲醛固定后脫水、石蠟包埋并切片）；剩余部分立即置于液氮中冷凍后置于-80℃冰箱冷凍保存，以用于其他指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.3 心肌組織病理形態(tài)學(xué)檢查石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精入水，用蘇木素-伊紅（HE）染色液及馬松（Masson）染色液染色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變，并對(duì)心肌纖維化程度進(jìn)行Masson染色評(píng)分。評(píng)分采用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。CVF=膠原面積/心肌組織總面積×100%。

1.3.4 Western blot檢測(cè)取左心室心肌組織，采用細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒分別提取細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白用于Nrf2的檢測(cè)，采用組織蛋白抽提試劑盒提取總蛋白用于Keap1、Collagen I、Collagen Ⅲ、HO-1、NQO1和GCLC的檢測(cè)。采用BCA蛋白定量分析試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，每孔30 μg蛋白上樣，6%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBS-Tween洗膜3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBS-Tween洗膜3次，滴加ECL發(fā)光試劑，于Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）自動(dòng)曝光，采集圖像后分析條帶光密度值。細(xì)胞核蛋白采用Lamin B為內(nèi)參，細(xì)胞質(zhì)蛋白采用β-tubulin為內(nèi)參，總蛋白采用DAPDH為內(nèi)參。

1.3.5 qRT-PCR檢測(cè)使用Trizol提取心肌組織總mRNA，按照說(shuō)明書(shū)的步驟，使用qRT-PCR Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，在ABI 7500 fast realtime PCR system qRT-PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt方法求得各個(gè)目的基因mRNA的相對(duì)含量。根據(jù)SYBR ? Green realtime PCR Master Mix的使用說(shuō)明，PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.6 心肌MDA、GSH含量及SOD活性的測(cè)定取左心室心肌組織，勻漿后取上清液，按照說(shuō)明書(shū)的步驟，采用比色法檢測(cè)心肌組織中MDA、總GSH含量以及總SOD的活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合條件，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合條件，采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STS減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化

2.1.1 STS對(duì)大鼠心肌病理形態(tài)學(xué)的改變HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠心肌組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列均勻致密。模型組大鼠心肌組織可見(jiàn)壞死、心肌纖維斷裂、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。各STS處理組心肌細(xì)胞損傷不同程度地減輕，于高劑量STS組改善更為明顯（見(jiàn)圖1A）。Masson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌纖維化明顯，心肌間質(zhì)可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維（見(jiàn)圖1B）。各Ang II處理組CVF值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.157，P=0.000）。并且隨著STS劑量的增加，各STS組CVF值逐漸降低（均P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

2.1.2 STS減少大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖2A）。Western blot結(jié)果顯示，各Ang Ⅱ處理組膠原蛋白表達(dá)量經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FCollagenI=8.233，P=0.002；FCollagenIII=8.345，P=0.001）。與模型組比較，低劑量STS組Collagen Ⅰ蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.412，P＜0.05），Collagen Ⅲ蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量 STS組 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖2B）。

2.2 STS對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，各Ang Ⅱ處理組Keap1、Nrf2 mRNA表達(dá)量經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FKeap1=4.001，P=0.027；FNrf2=6.918，P=0.003）。與模型組比較，低劑量STS組Keap1、Nrf2 mRNA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），中、高劑量STS組Keap1 mRNA含量減少，Nrf2 mRNA含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖3A）。Western blot結(jié)果顯示，各Ang Ⅱ處理組Keap1、細(xì)胞質(zhì)Nrf2、細(xì)胞核Nrf2蛋白表達(dá)量經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FKeap1=9.514，P=0.001；F細(xì)胞質(zhì)Nrf2=7.856，P=0.002；F細(xì)胞核Nrf2=7.252，P=0.003）。與模型組比較，中、高劑量STS組Keap1、細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白含量降低，細(xì)胞核Nrf2蛋白含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖3B）。

表2 各組 CVF 值比較 （n =8，±s）

表2 各組 CVF 值比較 （n =8，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 CVF值對(duì)照組 5.593±3.540模型組 28.796±8.9561）低劑量 STS 組 22.350±5.6792）中劑量 STS 組 19.425±4.3512）高劑量 STS 組 13.975±4.2532）

圖1 STS對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的影響

圖2 STS對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠心肌組織中I型、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

2.3 STS對(duì)大鼠心肌組織中抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，各Ang Ⅱ處理組HO-1、NQO1、GCLC mRNA表達(dá)量經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FHO-1=4.741，P=0.015；FNQO1=4.994，P=0.012；FGCLC=12.289，P=0.000）。與模型組比較，高劑量STS組HO-1、NQO1、GCLC mRNA含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖4A）。Western blot結(jié)果顯示，各Ang Ⅱ處理組HO-1、NQO1、GCLC蛋白表達(dá)量經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FHO-1=11.790，P=0.000 ；FNQO1=7.316，P=0.003 ；FGCLC=41.993，P=0.000）。與模型組比較，中、高劑量STS組HO-1、NQO1、GCLC蛋白含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖4B）。

2.4 STS對(duì)大鼠心肌組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平和抗氧化應(yīng)激的能力的影響

各Ang Ⅱ處理組MDA、GSH含量及SOD活性經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FMDA=7.216，P=0.012；FGSH=5.838，P=0.021；FSOD=8.306，P=0.008）。與模型組比較，中、高劑量STS組MDA含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），GSH含量、SOD活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖5）。

圖3 STS對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠心肌組織中Keap1和Nrf2表達(dá)的影響

圖4 STS對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠心肌組織中HO-1、NQO1和GCLC表達(dá)的影響

圖5 STS對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠心肌組織中MDA、GSH含量及SOD活性

3 討論

Ang Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）重要的效應(yīng)因子。Ang Ⅱ通過(guò)激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，促使ROS的生成[3]。過(guò)多的ROS引起氧化應(yīng)激增加，造成心肌肥大、ECM沉積，導(dǎo)致心肌纖維化。ECM中Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成增加和比例失調(diào)，增加心肌僵硬度，降低心室壁順應(yīng)性，引起心室收縮舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭[8-10]。

丹參是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，廣泛用于心血管疾病的治療[11]。丹參酮ⅡA是丹參的主要脂溶性活性成分。研究表明，丹參酮ⅡA能夠抑制Ang Ⅱ處理細(xì)胞的AT1R受體表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，減少ECM的沉積，減輕心肌纖維化[12-14]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，給予Ang Ⅱ處理后，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)可見(jiàn)大量纖維沉積，CollagenⅠ、Collagen Ⅲ含量增加，證實(shí)Ang Ⅱ可引起心肌纖維化的發(fā)生；給予STS處理后，各組大鼠心肌細(xì)胞變性壞死程度減輕、心肌纖維化面積減少，CollagenⅠ、Collagen Ⅲ含量減少，并且這種改善隨著STS劑量的增高而更加明顯，證明STS能夠減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化。

Nrf2屬于Cap’-n’-Collar（CNC）家族抗氧化轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，在生理?xiàng)l件下，Nrf2在胞漿中與其胞質(zhì)接頭蛋白Keap1偶聯(lián)后被泛素化而降解，其活性處于相對(duì)抑制狀態(tài)。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)移入核，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，啟動(dòng)其調(diào)控的抗氧化酶（HO-1、GCL及SOD等）和Ⅱ相解毒酶（NQO1、GST等）的表達(dá)[15-16]。HO-1降解產(chǎn)物參與細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)；NQO1、SOD能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基及親電子物質(zhì)的損傷；谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）的催化亞基（GCLC）含有GCL的所有底物結(jié)合位點(diǎn)和催化功能，Nrf2可以通過(guò)上調(diào)GCLC的表達(dá)增加GSH的合成，清除ROS，減輕細(xì)胞的氧化損傷。MDA是氧自由基與細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，MDA可衡量氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的損傷程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，中、高劑量STS組細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白含量減少，細(xì)胞核Nrf2蛋白含量增加，Nrf2 mRNA含量增加，HO-1、NQO1、GCLC含量增加，說(shuō)明STS處理可以促進(jìn)Nrf2核聚集，增強(qiáng)其下游抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的合成；與模型組比較，各STS組大鼠心肌組織中SOD活性增加，MDA含量降低，表明STS能增加大鼠心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，減輕心肌細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的STS可以使大鼠心肌細(xì)胞Keap1含量減低，故推測(cè)Nrf2核轉(zhuǎn)位增多可能與Keap1含量減少、結(jié)合能力的降低，進(jìn)而導(dǎo)致Nrf2降解減少有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明STS可以呈劑量依賴(lài)性地抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，這種心肌保護(hù)作用可能與STS能夠促使Nrf2核轉(zhuǎn)位，增加Nrf2調(diào)控的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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