游洲，魯錦志,黃慶，易村犍

長(zhǎng)江大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 434000

隨著我國(guó)二孩政策開(kāi)放，生育需求逐漸增加，然而不孕不育的發(fā)生率逐漸增高，如何防治不孕不育成為目前生殖醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前研究表明，引起不孕不育的原因很多，感染因素是其中之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，在不孕不育患者中，解脲支原體(Ureaplasma urealyticum, UU)和沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, CT) 感染率增高[1～3]，解脲支原體及沙眼衣原體感染與不孕不育的關(guān)系也成為很多研究者及臨床工作者關(guān)注的問(wèn)題。解脲支原體和沙眼衣原體是常見(jiàn)生殖道感染病原體，人體感染UU和CT可造成極大危害。UU和CT感染可使男性患前列腺炎、附睪炎、睪丸炎、精囊炎和尿道炎等，女性感染后可出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如盆腔炎、輸卵管妊娠、子宮內(nèi)膜炎等[4,5]。然而感染UU和CT是否為不孕不育病因之一，目前尚未定論。本研究收集不孕不育患者生殖道分泌物標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)UU和CT，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，擬明確生殖道解脲支原體和沙眼衣原體感染與不孕不育的相關(guān)性，為不孕不育的臨床防治提供相關(guān)指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年12月于荊州市第一人民醫(yī)院生殖中心診治的不孕不育患者作為不孕不育組。選取標(biāo)準(zhǔn)：1年以上正常性生活，未采取任何避孕措施而未妊娠者；排除標(biāo)準(zhǔn)：女性排除先天性不孕因素、子宮內(nèi)膜異位癥、排卵障礙及內(nèi)分泌失調(diào)，男性排除無(wú)精癥、少精癥、單純精漿變、性功能障礙和遺傳因素。不孕不育組：年齡19～45歲，均齡(29.3±4.7)歲，男性患者181例，女性患者301例，含夫婦91對(duì)；另隨機(jī)抽取婦科門(mén)診同時(shí)期已育健康體檢者842例為對(duì)照組：年齡19～50歲，均齡(31.2±6.3)歲，男性463例，女性379例。兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。調(diào)查者均已簽署知情同意書(shū)并自愿參與此研究，醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 試劑和儀器

1)儀器 BYQ6007E-380恒溫金屬浴，AgilentStratagene MX3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，XW-80A漩渦混勻器，TG1WS臺(tái)式高速離心機(jī)。

2)試劑 解脲支原體核酸與沙眼衣原體核酸檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)于上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司(UU批號(hào)：20160802，CT批號(hào)：20160301)。

1.3 取材

1)女性標(biāo)本 用陰道窺器充分暴露子宮頸，先用無(wú)菌棉簽將宮頸外口分泌物拭凈，再將一次性專用無(wú)菌棉拭子伸入宮頸口內(nèi)1～2cm，旋轉(zhuǎn)1周，停留約10s后取出(應(yīng)略帶粘膜)。為避免污染，拭子不能碰到宮頸外及陰道壁，將分泌物置于無(wú)菌配套樣本管，用無(wú)菌棉球?qū)⒃嚬苋o，將標(biāo)本立即封閉送檢。

2)男性標(biāo)本 將一次性男性專用拭子伸入尿道口內(nèi)1～2cm，旋轉(zhuǎn)1周，停留約10s后取出(應(yīng)略帶粘膜)置于無(wú)菌配套樣本管，用無(wú)菌棉球?qū)⒃嚬苋o，將標(biāo)本立即封閉送檢。

1.4 檢測(cè)方法

1)標(biāo)本處理 將棉拭子從生物安全柜取出后置于EP管內(nèi)，用1mL無(wú)菌生理鹽水漂洗樣本后去掉棉拭子轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中。

2)DNA提取 吸取漂洗液200μL，將EP管放入離心機(jī)內(nèi)以13000r/min離心10min，小心棄上清，可保留10～15μL殘液，100℃加熱裂解10 min，13000r/min離心10min，取樣品上清液4μL，加入反應(yīng)管中。

3) DNA的擴(kuò)增過(guò)程 將分別含4μL標(biāo)本DNA、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品DNA的反應(yīng)管置于離心機(jī)以5000r/min以內(nèi)轉(zhuǎn)速離心后放入全自動(dòng)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，每次檢測(cè)均分為空白對(duì)照、陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照。PCR儀參數(shù)設(shè)定：93℃ 3min預(yù)變；93℃ 45s后進(jìn)入55℃ 1min持續(xù)10個(gè)循環(huán)當(dāng)做熒光本底信號(hào)；93℃ 30s后進(jìn)入55℃ 45s持續(xù)30個(gè)循環(huán)，在55℃時(shí)收集熒光。

4)結(jié)果判定 擴(kuò)增結(jié)果以Ct值表示。如果增長(zhǎng)曲線不呈S型或Ct≥40，結(jié)果為陰性，不呈S型表示樣品DNA含量低于檢測(cè)下限；如果增長(zhǎng)曲線呈S型且Ct≤38，則結(jié)果為陽(yáng)性；38

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS22.0軟件處理、分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，不孕不育組夫妻間感染解脲支原體、沙眼支原體則采用相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的病原體感染率比較

不孕不育組共檢出UU感染296例，陽(yáng)性率為61.4%(296/482)，對(duì)照組檢出UU感染344例，陽(yáng)性率為40.9%(344/842)。 兩組比較，不孕不育組UU感染率明顯較高(χ2=51.865，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不孕不育組共檢出CT感染26例，陽(yáng)性率為5.4%(26/482)，對(duì)照組檢出CT感染19例，陽(yáng)性率為2.3%(19/842)。兩組比較，不孕不育組CT感染率明顯較高(χ2=9.191，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的病原體感染率比較

2.2 不孕不育組夫妻間感染解脲支原體的相關(guān)性分析

不孕不育組91對(duì)夫妻中丈夫UU感染率為15.4%(14/91)，妻子感染率為48.4%(44/91)。夫妻間感染UU不具有相關(guān)性(r=0.075，P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 不孕不育組夫妻間感染沙眼衣原體的相關(guān)性分析

不孕不育組91對(duì)夫妻中丈夫CT感染率為9.9%(9/91)，妻子感染率為11.0%(10/91)。夫妻間感染CT具有相關(guān)性(r=0.707，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 不孕不育組夫妻間感染解脲支原體的相關(guān)性分析

注：r=0.075，P>0.05。

表3 不孕不育組夫妻間感染沙眼衣原體的相關(guān)性分析

注：r=0.707，P<0.05。

3 討論

不孕不育癥是目前很多已婚夫婦生育所面臨的嚴(yán)重問(wèn)題，其發(fā)病率因國(guó)家、民族和地區(qū)不同而異。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國(guó)家5%～8%的育齡夫婦存在不孕不育問(wèn)題，發(fā)展中國(guó)家更嚴(yán)重，高達(dá)30%[6]。不孕不育發(fā)病原因有很多種，如陰道因素、宮頸因素、內(nèi)分泌因素、精神神經(jīng)因素等。生殖道病原體感染是影響健康生育的原因之一[7,8]，而UU和CT是引起生殖道感染的主要病原體，兩者均為介于病毒、細(xì)菌之間的一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，常寄生于男女泌尿生殖道。在歐美國(guó)家，UU和CT感染引起的性傳播疾病名列第一位[9]，而我國(guó)，UU和CT感染逐年增加，已位于生殖道感染的前列，其中UU感染率普遍比CT高[10]。

本研究結(jié)果顯示，不孕不育組UU感染率為61.4%(296/482)，對(duì)照組UU感染率為40.9%(344/842)，兩組對(duì)比顯示不孕不育組UU感染率明顯較高(χ2=51.865，P<0.05)；不孕不育組CT感染率為5.4%(26/482)，對(duì)照組CT感染率為2.3%(19/842)，兩組對(duì)比顯示不孕不育組CT感染率明顯較高(χ2=9.191，P<0.05)。該結(jié)果與張建平等[11]人的研究結(jié)果一致，在他們的研究中不孕不育組UU感染率為47.8%，對(duì)照組UU感染率為4.0%，不孕不育組CT感染率為6.6%，對(duì)照組CT感染率為2.0%。這兩組數(shù)據(jù)提示UU和CT感染與不孕不育的發(fā)生可能存在致密聯(lián)系。另外，在本研究中不孕不育組及對(duì)照組，UU陽(yáng)性率都偏高(61.4%、40.9%)，這可能和不同地區(qū)人的生活習(xí)慣和地域環(huán)境有關(guān)，也可能和夫妻年輕化有關(guān)。CT總體感染率偏低，可能UU相對(duì)CT而言更容易被人體感染，與其各自的感染方式有關(guān)。解脲支原體粘附并定居在人體的泌尿生殖道上皮細(xì)胞[12]，可侵入單核巨噬系統(tǒng)細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)增殖[13]。UU具有很強(qiáng)的黏附性，可使其吸取上皮細(xì)胞膜的脂質(zhì)和膽固醇，損傷正常細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)上皮細(xì)胞造成損傷，破壞細(xì)胞粘膜屏障結(jié)構(gòu)，引發(fā)生殖道感染；沙眼衣原體感染人體后，主要在宮頸、尿道及精液中存活，通過(guò)性接觸、直接體液接觸等途經(jīng)傳播。UU與CT感染方式的不同，可能導(dǎo)致感染率的不同，具體原因需進(jìn)一步研究。

此外本研究結(jié)果還顯示，不孕不育組91對(duì)夫妻中丈夫UU感染率為15.4%，妻子UU感染率為48.4%，夫妻間感染UU不具有相關(guān)性。然而趙本書(shū)等[14]人研究指出夫妻間感染UU具有相關(guān)性，本研究與其結(jié)果并不一致，這可能與夫妻間的生活習(xí)慣、生活環(huán)境有關(guān)，也可能與男、女生殖器結(jié)構(gòu)不同，個(gè)體間的免疫力差異有關(guān)；而不孕不育組91對(duì)夫妻間中，丈夫CT感染率為9.9%，妻子CT感染率為11.0%，夫妻間感染CT具有相關(guān)性，這個(gè)結(jié)果與趙本書(shū)等人的結(jié)果一致。要進(jìn)一步明確本地區(qū)夫妻間感染UU和CT的相關(guān)性，可能需要擴(kuò)大調(diào)查范圍或需要更大的樣本量。

臨床患者感染UU或CT后常無(wú)癥狀或僅有輕微癥狀，常忽略就醫(yī)，從而延誤患者治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致慢性感染或反復(fù)感染，進(jìn)一步加重生殖道的損傷，引起不孕不育的發(fā)生[15]。本研究證實(shí)UU和CT感染和不育不孕之間存在一定相關(guān)性，為下步研究UU和CT引起不孕不育機(jī)制提供了理論依據(jù)。另外有文獻(xiàn)報(bào)道，UU和CT感染陽(yáng)性患者經(jīng)治療后轉(zhuǎn)陰，妊娠率顯著高于未轉(zhuǎn)陰者[16]。因此，臨床上將UU和CT也作為孕前篩查項(xiàng)目，對(duì)不孕不育夫婦雙方進(jìn)行檢測(cè)，可以提高不孕不育診療效果。

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