胡倍國(guó)， 曾柏全*， 鄒 輝， 朱光冕， 章旖旎

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

隨著石油和煤炭的開采，化石資源儲(chǔ)量日益減少，環(huán)境污染問(wèn)題也日益凸顯，利用生物質(zhì)作為原料生產(chǎn)可再生能源和化學(xué)品具有很大的發(fā)展前景[1]。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)主要包括農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢棄物、森林工業(yè)剩余物、能源作物、城市固體廢物等，這些生物質(zhì)原料極其豐富[2]。但木質(zhì)纖維素主要成分之間緊密結(jié)合，且很難被微生物直接利用，在生物煉制之前需要進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理過(guò)程的實(shí)質(zhì)是通過(guò)增加纖維素的可及度和溶解半纖維素或木質(zhì)素，使纖維素更容易被微生物利用消耗酶解，對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理的目的，就是要改變木質(zhì)纖維素的這些結(jié)構(gòu)性質(zhì)使其能夠被酶降解[3]。影響木質(zhì)纖維素生物降解速率的主要因素有：纖維素的結(jié)晶度、可及度、木質(zhì)素和半纖維素的包裹、纖維素聚合度和半纖維素的乙?；潭取３Ｒ?jiàn)的預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法，以及上述兩種或兩種以上方法組合。選擇合適的預(yù)處理方法，能夠有效提高酶解速率降低生物煉制成本，由于大多數(shù)預(yù)處理需要在強(qiáng)酸強(qiáng)堿或高溫高壓下進(jìn)行，產(chǎn)生較多對(duì)后續(xù)酶解和微生物發(fā)酵有抑制作用的副產(chǎn)物。這些副產(chǎn)物的濃度高低將直接影響到微生物的生長(zhǎng)代謝，以及目標(biāo)產(chǎn)物的得率[4]。

本文綜述了近年來(lái)，木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法、副產(chǎn)物生成途徑和危害、以及脫除的策略，以期提高木質(zhì)纖維素利用效率。

1 木質(zhì)纖維素

1.1 木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)

木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、提取物和無(wú)機(jī)成分組成[5]。木質(zhì)纖維素通過(guò)水解提供后獲得單糖，用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料或化工產(chǎn)品。

纖維素是由β-D-葡萄糖通過(guò)β-1,4-糖苷鍵結(jié)合起來(lái)形成的鏈狀高聚物，性質(zhì)比較穩(wěn)定。葡萄糖單體通過(guò)重復(fù)單元形成纖維二糖結(jié)構(gòu)[6]，大約30～50個(gè)葡聚糖長(zhǎng)鏈通過(guò)氫鍵連接，聚合在一起形成直徑為3 nm～5 nm的纖維素微原纖維結(jié)構(gòu)[7]，并以束狀的形式相連接，這種特殊而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使得纖維素對(duì)生物和化學(xué)處理有著頑固的抵抗力。

半纖維素是由己糖、戊糖殘基組成的支鏈雜多糖，可以攜帶乙?；鵞8]，水解后產(chǎn)物有己糖、戊糖和少量糖醛酸。與纖維素相比，半纖維素的結(jié)晶度更低更不穩(wěn)定，支鏈結(jié)構(gòu)對(duì)水解稍微有一些抵抗力，并且它們更容易在酸堿介質(zhì)中水解成它們的單體成分[9]。

木質(zhì)素是由苯基丙烷通過(guò)醚鍵和碳-碳鍵以非線性和隨機(jī)的方式，連接形成的三維空間結(jié)構(gòu)，屬于芳香族類聚合物，通過(guò)化學(xué)鍵與半纖維素和纖維素相連[10]，木質(zhì)素能夠?yàn)橹参锾峁┙Y(jié)構(gòu)支撐作用，這也是植物細(xì)胞壁中最頑抗的部分。木質(zhì)素比例越高，對(duì)化學(xué)和酶降解的抗性就越強(qiáng)，軟木比硬木和大多數(shù)農(nóng)業(yè)廢棄物的木質(zhì)素含量更高。

1.2 木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法

木質(zhì)纖維素經(jīng)過(guò)預(yù)處理能夠降低纖維素的結(jié)晶度，去除部分木質(zhì)素，溶解半纖維素，提高纖維素的可接觸表面積，使纖維素更容易進(jìn)行酶解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，生產(chǎn)各種化工產(chǎn)品。表1中列舉了用于木質(zhì)纖維素常用的預(yù)處理類型。

表1 常見(jiàn)的預(yù)處理方法及其特點(diǎn)

這些類型大致分為物理預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理、物理-化學(xué)組合預(yù)處理和生物預(yù)處理[11]。除了常見(jiàn)的預(yù)處理方法外，一些不太常用但有著很大潛力的預(yù)處理方法也值得關(guān)注。包括電預(yù)處理和反芻動(dòng)物仿生模擬預(yù)處理。電預(yù)處理通過(guò)使用脈沖電場(chǎng)、電子流、外電場(chǎng)等方式對(duì)木質(zhì)纖維素處理，達(dá)到增加表面積、滲透率和改變生物質(zhì)化學(xué)鍵的效果，從而提高木質(zhì)纖維素酶解效率[12-13]。反芻動(dòng)物仿生模擬預(yù)處理是從仿生學(xué)的角度，結(jié)合物理法（反芻動(dòng)物咀嚼）、化學(xué)法（胃液酸處理）和生物法（瘤胃微生物群和酶分解）進(jìn)行預(yù)處理，達(dá)到極高的消解率[14]。Ozbayram 等[15]用小麥秸稈作底物，接種綿羊瘤胃菌群厭氧發(fā)酵，甲烷的產(chǎn)量增加了27%。這些預(yù)處理方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)不同的生物質(zhì)種類的特點(diǎn)選擇對(duì)應(yīng)的預(yù)處理方法尤為重要。

2 抑制物的形成、影響及脫除策略

木質(zhì)纖維素通過(guò)預(yù)處理可以降低纖維素的結(jié)晶度，去除部分或全部木質(zhì)素，溶解半纖維素，提高纖維素的可接觸表面積，使生物質(zhì)更容易進(jìn)行酶解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，發(fā)酵生產(chǎn)各類產(chǎn)品。但由于大多數(shù)預(yù)處理需要在劇烈的條件下進(jìn)行，如強(qiáng)酸強(qiáng)堿、高溫高壓等，不可避免的產(chǎn)生了一些對(duì)微生物發(fā)酵有抑制作用的產(chǎn)物，抑制微生物的生長(zhǎng)代謝，降低了目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量，使得對(duì)預(yù)處理的研究成為高效利用木質(zhì)纖維素的難點(diǎn)之一，對(duì)抑制物類型、產(chǎn)生及脫除策略的研究是提高木質(zhì)纖維素利用效率，提高微生物發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物得率的關(guān)鍵。抑制物通常分為三類分別是：脂肪酸、呋喃衍生物和芳香族化合物，這些副產(chǎn)物抑制物的生成過(guò)程如圖1所示。

圖1 木質(zhì)纖維素預(yù)處理后降解產(chǎn)物形成示意圖

2.1 抑制物的形成

脂肪酸主要包括甲酸、乙酸和乙酰丙酸。其中，乙酸主要由半纖維素的乙?；鶖嗔研纬桑姿岷鸵阴１嶂饕砂肜w維素和纖維素降解形成的己糖和戊糖脫水，形成呋喃甲醛和 5-羥甲基糠醛（HMF），繼續(xù)降解形成甲酸和乙酰丙酸[29]。例如，由于硬木比軟木乙酰化碳水化合物含量更高，導(dǎo)致其預(yù)處理后水解產(chǎn)物中脂肪酸的含量也更高[30]。

糠醛和5-羥甲基糠醛是五碳糖和六碳糖的呋喃衍生物，它是存在于木質(zhì)纖維素預(yù)處理漿料中含量最高毒性最大的副產(chǎn)物，化學(xué)性質(zhì)活潑。對(duì)乙醇發(fā)酵的酶以及微生物細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。芳香族化合物一般由木質(zhì)素經(jīng)預(yù)處理釋放出來(lái)[31]。一些酚類化合物來(lái)自水解后糖的衍生合成物[32]。木質(zhì)纖維素原料的部分提取物也是酚類化合物來(lái)源之一。此外，無(wú)機(jī)離子（K+、Na+、Cl-）也是一類不可忽視的抑制物，它來(lái)自木質(zhì)纖維素原料的水解產(chǎn)物和添加的化學(xué)物質(zhì)[33]，如果離子不能穿過(guò)細(xì)胞膜，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞處于高滲透壓環(huán)境中脫水死亡[34]。

除了上述提到的有機(jī)酸、芳香族化合物和呋喃化合物以外，木質(zhì)纖維素的預(yù)處理中還存在少量其它的副產(chǎn)物，可以通過(guò)使用各種溶劑從漿液中提取出來(lái)。這些產(chǎn)物包括單寧和萜烯酸，如己酸、辛酸、壬酸和棕櫚酸，其類型和濃度很大程度上取決于原料種類、水解溫度、酸濃度以及預(yù)處理的總體劇烈程度。

2.2 抑制物對(duì)酶解和微生物的影響

脂肪酸對(duì)微生物的抑制作用主要體現(xiàn)在三個(gè)方面：一、未解離的脂肪酸以擴(kuò)散方式通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，然后在細(xì)胞內(nèi)解離，使細(xì)胞內(nèi)pH降低，影響微生物的正常代謝，甚至可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[35]；二、脂肪酸的電離釋放出大量的質(zhì)子，為了維持恒定的細(xì)胞內(nèi)pH值，細(xì)胞通過(guò)位于質(zhì)膜上的ATP酶泵出質(zhì)子，結(jié)果導(dǎo)致微生物的生物量下降[36]；三、部分芳香族羧酸可以作為解偶聯(lián)劑，破壞線粒體膜上的質(zhì)子梯度，切斷呼吸鏈與氧化磷酸化之間的聯(lián)系，抑制線粒體上ATP的再生[37]。

糠醛和HMF抑制酵母的生長(zhǎng)并降低乙醇產(chǎn)量和生產(chǎn)效率[38]，影響細(xì)胞內(nèi)呼吸作用和糖酵解途徑的正常代謝。當(dāng)在厭氧條件下，釀酒酵母可將糠醛轉(zhuǎn)化成糠醇[39]，將HMF轉(zhuǎn)化為2,5-二羥甲基呋喃[40]?？啡┑倪€原與輔因子NADH有關(guān)，而HMF的降低與NADPH的消耗有關(guān)。Wahlbom等[41]通過(guò)具有利用木糖能力作為碳源的釀酒酵母重組菌株試驗(yàn)，往培養(yǎng)基中添加適量糠醛，研究發(fā)現(xiàn)，乙醇的產(chǎn)量反而增加了，這證實(shí)該釀酒酵母菌株具備將糠醛轉(zhuǎn)化為糠醇的能力。

芳香族化合物能夠影響微生物生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量，不同的芳香族化合物對(duì)微生物抑制作用效果不同，存在很大的差異性和可變性，這可能與其特定的官能團(tuán)有關(guān)。一種假說(shuō)認(rèn)為，酚類物質(zhì)主要通過(guò)對(duì)微生物細(xì)胞膜的功能和蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的比例產(chǎn)生干擾，從而抑制微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。此外，研究表明，酚類能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)沉淀，從而對(duì)纖維素酶水解有抑制作用。

2.3 抑制物的脫毒方法

對(duì)預(yù)處理后漿料進(jìn)行脫毒方式通常劃分為三種類型，分別是物理法、化學(xué)法和生物法，如表2所示為常見(jiàn)的預(yù)處理漿料脫毒方法和特點(diǎn)。根據(jù)抑制物類型、濃度、微生物耐受性等差異，選擇相匹配的脫毒方法顯得尤為重要。

2.3.1 物理法

物理法是對(duì)預(yù)處理后漿料脫毒最簡(jiǎn)便的方法，通過(guò)一些簡(jiǎn)單的處理，如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或烘干、吸附、薄膜過(guò)濾等方法，達(dá)到去除抑制物的效果。該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、不添加其他化學(xué)品等優(yōu)點(diǎn)[42]。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或烘干是利用加熱漿料使其中易揮發(fā)低沸點(diǎn)的副產(chǎn)物（如有機(jī)酸）去除。吸附法通常將活性炭加到預(yù)處理后的漿料中，使活性炭與抑制物結(jié)合并沉淀，達(dá)到去除抑制物的效果。李允超等[43]研究了竹炭對(duì)糠醛的吸附特性，在糠醛10 g/L的濃度下，竹炭添加量與糠醛吸附脫除率成相關(guān)，糠醛脫除率可達(dá)95%以上。Keshav等[44]通過(guò)活性炭吸附預(yù)處理后的棉花莖水解液中的副產(chǎn)物，能夠減少水解產(chǎn)物中總糠醛59.12%，酚醛樹脂 78.44%。此外，樓宏銘等[45]利用酶解木質(zhì)素粉碎后作為吸附劑，對(duì)預(yù)處理液中糠醛和 5-羥甲基糠醛進(jìn)行吸附試驗(yàn)，能夠?qū)⒖啡┖?-HMF的濃度降低到微生物能夠耐受的水平。

2.3.2 化學(xué)法

化學(xué)法主要是指通過(guò)往木質(zhì)纖維素預(yù)處理漿料中添加化學(xué)品，使有毒物質(zhì)發(fā)生沉淀，達(dá)到脫毒的效果。最常見(jiàn)的是添加堿性試劑（如氨水、熟石灰、氫氧化鈉），使預(yù)處理漿料中的副產(chǎn)物沉淀。Ariksson等[46]對(duì)云杉稀酸水解產(chǎn)物進(jìn)行脫毒，比較了添加NH4OH、Ca(OH)2、Mg(OH)2、Ba(OH)2和NaOH對(duì)抑制物的脫除效果，結(jié)果表明，當(dāng)pH 10.0時(shí)，使用NH4OH進(jìn)行處理可以顯著降低糠醛和5-羥甲基糠醛的濃度，大大提高釀酒酵母的發(fā)酵能力。通過(guò)使用還原劑進(jìn)行漿料脫毒，可以在適合微生物生長(zhǎng)的條件下直接向發(fā)酵容器中添加化學(xué)藥品，操作簡(jiǎn)便，卻能使發(fā)酵效果得到顯著提高而不消耗漿料中的還原糖。Ariksson等[47]向云杉或甘蔗渣預(yù)處理漿液中添加連二亞硫酸鹽和亞硫酸鹽，進(jìn)行 SHF發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明用連二亞硫酸鹽處理能夠使云杉水解液發(fā)酵乙醇產(chǎn)率從0.2 g/(L·h)-1提高到2.5 g/(L·h)-1，甘蔗渣發(fā)酵乙醇產(chǎn)率從0.9 g/(L·h)-1提高到 3.9 g/(L·h)-1。

2.3.3 生物法

生物法主要是利用微生物或酶去降解消除抑制物。包括三個(gè)方面：一是在發(fā)酵前添加能降解抑制物的外源微生物；二是對(duì)發(fā)酵微生物進(jìn)行選育馴化，包括運(yùn)用基因工程技術(shù)，對(duì)發(fā)酵微生物進(jìn)行基因重組，提高對(duì)抑制物的耐受性，甚至具有降解抑制物的能力；三是添加生物酶進(jìn)行脫毒處理。Nichols等[48]研究了玉米秸稈稀酸水解液中接種真菌Coniochaeta ligniaria NRRL30616，對(duì)培養(yǎng)后的水解液中成分定量分析，發(fā)現(xiàn)多種芳香族化合物、脂肪酸、糠醛等抑制物都顯著降低，優(yōu)化了乙醇發(fā)酵中對(duì)木糖的利用能力。王旭等[49]對(duì)畢赤酵母基因組的研究中，成功鑒定出了對(duì)木質(zhì)纖維素水解醛類具有脫毒能力的基因，以及對(duì)糠醛和5-羥甲基糠醛的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答反應(yīng)作了深入研究。Saravanakumar T等[50]通過(guò)將漆酶固定在納米纖維上，40℃反應(yīng)36 h能夠完全脫除木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的糠醛、乙酰丁香酮和松柏醛。對(duì)于副產(chǎn)物的脫除有很好的借鑒作用。

表2 木質(zhì)纖維素漿料常見(jiàn)脫毒方法

3 結(jié)論與展望

隨著對(duì)以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)生物燃料和工業(yè)產(chǎn)品的深入研究，尋找木質(zhì)纖維素有效的預(yù)處理方法及處理后漿料脫毒策略，解決預(yù)處理過(guò)程中暴露的問(wèn)題，成為提高木質(zhì)纖維素高效利用的重要環(huán)節(jié)。為了提高對(duì)天然木質(zhì)纖維素的利用效率，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究。

一是不同種類的木質(zhì)纖維素原料組分和結(jié)構(gòu)特征差別較大，深入對(duì)不同種類的木質(zhì)纖維素的組分結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，探索對(duì)不同種類來(lái)源的木質(zhì)纖維素相適應(yīng)的預(yù)處理方法，是降低預(yù)處理成本，提高效率的有效途徑。

二是從自然界或通過(guò)基因工程技術(shù)選育出具有高效脫毒能力的菌株，是降低預(yù)處理后發(fā)酵漿料中抑制物含量的研究方向。

三是通過(guò)對(duì)預(yù)處理后漿料中抑制物成分的分析，摸索出有效的提取工藝流程，對(duì)抑制物進(jìn)行分離純化轉(zhuǎn)為多種化學(xué)產(chǎn)品，達(dá)到變廢為寶的處理效果。

盡管木質(zhì)纖維素的生物利用還存在很多問(wèn)題需要攻克，但是它作為各種生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品（如生物乙醇、甲烷、PHA等）的豐富廉價(jià)原料，具有很大的發(fā)展空間。合理有效的利用生物質(zhì)資源，可以減少對(duì)石油煤炭等化石燃料的依賴，促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施。

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