張曼卡，馬慧敏，張 健，李玉鳳，葉小慧，李 鑫,

1.北京大學地壇醫(yī)院教學醫(yī)院中西醫(yī)結合中心，北京 100015；2.首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院中西醫(yī)結合中心；3.首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所；4.北京大學地壇醫(yī)院教學醫(yī)院傳染病研究所

自身免疫性肝炎是一種病因未明、病理機制十分復雜的慢性肝臟炎癥性疾病,其主要表現(xiàn)是肝功能異常、免疫球蛋白升高、自身抗體陽性及特異的肝臟組織病理學異常改變[1-3]。其發(fā)病機制被認為是肝臟的促炎和抗炎機制的失衡所致。它是由于環(huán)境觸發(fā)作用于遺傳上的易感人群，導致T細胞介導的免疫應答直接作用于肝臟細胞的抗原[4]。因此，能夠?qū)Ω蝺?nèi)淋巴細胞亞群進行分析對闡釋這一疾病的復雜病理機制顯得至關重要。然而，目前尚未有專門的肝內(nèi)淋巴細胞分離培養(yǎng)方法。因此，本研究旨在通過建立一種較為簡便且具有很高重復性的提取大鼠肝內(nèi)淋巴細胞的方法，為進一步研究肝臟免疫疾病奠定實驗工作基礎。

1 材料與方法

1.1材料無特殊病原體級大鼠，體質(zhì)量250～350 g, 雌雄不限，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。大鼠實驗前12 h禁食、不禁水。本研究在北京地壇醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準下進行。1640培養(yǎng)基(Gibco，1868632)、胎牛血清(Biology Industries，1616316)、L型-谷氨酰胺 (Amresco生物公司)、淋巴細胞分離液(Lymphoprep公司，12GES16)、Cell Strainer(BD公司)、一次性留置針(金環(huán)，29S0301)、PERCP標記抗大鼠CD3抗體(ebioscience,4289855)，蔡司(ZEISS)倒置熒光顯微鏡、Eppendorf高速冷凍離心機。

1.2方法

1.2.1 大鼠原代肝淋巴細胞的分離與培養(yǎng): 主要包括灌肝、研磨、純化及培養(yǎng)等步驟, (1)灌肝: 取體質(zhì)量為345 g的無特殊病原體級SD大鼠1只, 術前12 h禁食、不禁水；用質(zhì)量濃度為40 g/L的戊巴比妥那將大鼠麻醉后, 用大頭針將大鼠呈仰臥位置固定于泡沫板；之后，將質(zhì)量濃度為750 g/L的乙醇噴灑于大鼠皮膚以進行體外消毒；5 min后以U形切口剪開皮層，再次消毒之后剪開肌層，切口上至劍突，下至恥骨聯(lián)合，左右至腋后線；將剪開的皮瓣固定；暴露腹腔后，將靜脈留置針置入肝門靜脈中，拔出針芯，將預冷的磷酸鹽緩沖液作為灌注液沖出肝臟內(nèi)血液，用眼科剪剪斷下腔靜脈使灌流液流出，整個過程速度適中，時間控制在5 min左右;待肉眼觀察灌流液顏色清亮時，小心剝離肝臟周邊黏連組織或結締組織，摘除肝臟，將其放入盛有預冷磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)皿中。(2)研磨：將剝離的肝臟置入超凈臺中進行下一步操作。先用磷酸鹽緩沖液沖洗肝臟2遍以沖洗表面的血污水，倒掉漂洗液后再用眼科剪將肝臟剪成約10 mm×10 mm的小塊，使用Cell Strainer配合10 ml注射器針芯將肝臟研磨至細胞懸液。(3)純化與培養(yǎng)：收集細胞懸液后以50×g的速度，離心3 min，將上清收入離心管中放冰上待用，再將離心沉淀加入磷酸鹽緩沖液重懸，重復離心取上清2次；將3次收集的上清1 200×g，5 min離心，將沉淀用8 ml磷酸鹽緩沖液重懸，將8 ml細胞懸液緩慢鋪層于4 ml淋巴細胞分離液上，450×g，升9降1，離心20 min，之后吸取中間白膜層于8 ml預冷的磷酸鹽緩沖液中，1 500×g，10 min離心，棄上清；1 200×g，5 min離心，棄上清。計數(shù)后，以1×106密度培養(yǎng)于24孔板中，培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基。然后置入體積分數(shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察1次細胞形態(tài)及培養(yǎng)液狀況。

1.2.2 大鼠肝內(nèi)淋巴細胞的形態(tài)學觀察：采用蔡司倒置顯微鏡, 觀察肝內(nèi)淋巴細胞的形態(tài)結構, 主要包括細胞的大小形態(tài)及細胞表面光滑度等。

1.2.3 流式細胞術鑒定大鼠肝內(nèi)T淋巴細胞：將提取的細胞吸取轉(zhuǎn)移至流式管中，以1 200×g的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清； 每管染T細胞特性的標記CD3抗體1 μl，渦旋混勻，4 ℃ 避光染色 15 min；加 2 ml PBEB 渦旋，以 1200 r/min，離心5 min洗滌細胞，棄上清；向流式管中加入 200 μl PBS，流式上機收取細胞105個后使用流式數(shù)據(jù)分析軟件Flowjo進行分析。

2 結果

2.1肝內(nèi)淋巴細胞的形態(tài)學觀察細胞培養(yǎng)時,觀察到細胞為規(guī)則的圓形，細胞表面較為平滑，胞質(zhì)透明清亮，中間略隆起，直徑為6～7 μm，呈典型的淋巴細胞形態(tài)(見圖1)。

2.2流式細胞儀檢測我們采用流式細胞儀進行T淋巴細胞特異性表位CD3進行染色，上機收取105個細胞，F(xiàn)lowjo軟件分析顯示，T淋巴細胞比例為51.2%(見圖2)。

圖1 淋巴細胞形態(tài)學觀察(200×) A：細胞培養(yǎng)0 h； B：細胞培養(yǎng)24 h；C：細胞培養(yǎng)48 hFig 1 The morphological observation of lymphocytes (200×) A: cells were cultured for 0 hour; B: cells were

圖2 淋巴細胞流式畫門策略及T淋巴細胞鑒定Fig 2 The gating strategy for intrahepatic T cells and the identification of T lymphocytes

3 討論

肝臟是機體重要的免疫器官，在機體的免疫中占重要的地位。研究[5-7]發(fā)現(xiàn),淋巴細胞及其亞群的變化參與了一些肝臟疾病的發(fā)病過程,如乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、自身免疫性肝病等。因此，能夠?qū)α馨图毎麃喨哼M行精準的分析就顯得尤為重要。而此項工作的重要基礎是對肝內(nèi)淋巴細胞進行分離與純化。

然而，目前仍未有一種可被廣泛接受的分離提取原代肝內(nèi)淋巴細胞的方法。本實驗首先利用淋巴細胞與肝實質(zhì)細胞密度的不同，先利用離心法去除肝實質(zhì)細胞的影響。而后，由于淋巴細胞的體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，而淋巴細胞分離液是一種密度為1.075～1.090近似于等滲的溶液,故而我們使用它進行密度梯度離心,從而將肝內(nèi)淋巴細胞分離出來，同時利用流式細胞儀的定量分析,客觀、簡單地對肝內(nèi)淋巴細胞亞群進行鑒定檢測[8-11]。

由于淋巴細胞分類較多，表型不同，故現(xiàn)在仍缺乏一種鑒定全部淋巴細胞的可靠方法。本實驗選取其中的T淋巴細胞亞群進行鑒定分析。成功分離純化淋巴細胞后，還可以借助磁珠將感興趣的亞群進一步分選以便進一步實驗分析[12-14]。

原代細胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，原代肝內(nèi)淋巴細胞可以很好地模擬體內(nèi)肝臟的免疫環(huán)境，可以作為病理機制闡明及藥物實驗的可靠模型。

總之, 本實驗運用大鼠正常的肝臟組織，采用原位灌注及密度梯度離心法相結合成功分離和培養(yǎng)了大鼠肝內(nèi)淋巴細胞，這種方法操作較簡單, 重復性比較性好，成功率較高,解決了肝內(nèi)淋巴細胞分離培養(yǎng)的問題，為進一步開展肝臟的免疫學研究提供了非常好的體外細胞模型。

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