羅深恒，白喜龍，景 磊，李玉銀，刁愛(ài)坡

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

溶酶體于1955年被發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)由單層膜圍繞、內(nèi)含多種酸性水解酶類的囊泡狀細(xì)胞器[1-2]．溶酶體的主要功能是消化作用，同時(shí)還具有降解表面受體、失活病原微生物、修復(fù)細(xì)胞膜等功能[3]．近年來(lái)研究表明，溶酶體調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)的多種死亡信號(hào)[3-4]．當(dāng)它受到一些外界因子，如腫瘤壞死因子[5-6]、Fas[7]、p53[8]、微管穩(wěn)定劑[9]、氧化應(yīng)激[7,10]和星形孢菌素[11]刺激時(shí)，溶酶體膜發(fā)生通透化，其內(nèi)部的組織蛋白酶從溶酶體腔釋放到細(xì)胞質(zhì)．一旦這些組織蛋白酶被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，特別是半胱氨酸組織蛋白酶B和L以及天冬氨酰蛋白酶 D，可誘發(fā)線粒體外膜通透化，繼而引發(fā)半胱天冬蛋白酶或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的凋亡[11-13]，或者調(diào)節(jié)半胱天冬蛋白酶或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡[6,14]．另外，由于不同因素引起的溶酶體膜穩(wěn)定性下降可導(dǎo)致與溶酶體相關(guān)疾病的發(fā)生，如矽肺、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[15].

目前已被鑒定的溶酶體相關(guān)蛋白包括溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP1、LAMP2)、溶酶體內(nèi)在蛋白(LIMP2)以及溶酶體膜糖蛋白(LGP85)．這些蛋白都高度糖基化，能保護(hù)溶酶體膜不被其內(nèi)部的水解酶降解[16-18]，防止溶酶體通透化，從而維持溶酶體穩(wěn)定性.

前列腺跨膜蛋白(transmembrane prostate androgen-induced protein，TMEPAI)是 N-端含有一個(gè)跨膜區(qū)(TMD)的Ⅰ型跨膜蛋白，由287個(gè)氨基酸組成. 編碼TMEPAI的基因最早于2000年由Xu等[19]在前列腺癌細(xì)胞中通過(guò)基因表達(dá)系列分析受雄激素調(diào)控的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的，TMEPAI基因定位于染色體 20q13，TMEPAI在眾多癌細(xì)胞中高表達(dá)，包括乳腺癌[20-21]、肺癌[22]、骨癌[23]、卵巢癌[24]、前列腺癌[25]、結(jié)腸癌、腎癌及胃癌細(xì)胞[26-28]．TMEPAI在癌細(xì)胞中的表達(dá)受部分生長(zhǎng)因子(EGF和 TGF-β)調(diào)控，如在肺癌細(xì)胞中，TMEPAI的持續(xù)高表達(dá)需要 TGF-β的刺激，EGF能夠協(xié)同 TGF-β共同調(diào)節(jié)誘導(dǎo) TMEPAI的表達(dá)[29].本實(shí)驗(yàn)室近期研究發(fā)現(xiàn) TMEPAI蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位于溶酶體和晚期內(nèi)吞體，并能夠通過(guò)促進(jìn) TGF-β受體(TβR)的溶酶體降解負(fù)調(diào)控 TGF-β信號(hào)[22]．

鑒于 TMEPAI是溶酶體膜相關(guān)蛋白并且在癌細(xì)胞中高表達(dá)，那么其功能是否可以增加溶酶體的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的抗凋亡能力．基于此猜想，本研究擬構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) TMEPAI細(xì)胞株，通過(guò) MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光技術(shù)研究細(xì)胞內(nèi)TMEPAI蛋白表達(dá)對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響，為探索TMEPAI在腫瘤細(xì)胞發(fā)生中的作用提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、細(xì)胞及質(zhì)粒

大腸桿菌(E．coli)TOP10、肺癌細(xì)胞 A549及質(zhì)粒pEF-IRES-puro 均為本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.1.2 主要試劑

Taq DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DAN marker、蛋白 預(yù)染 marker，F(xiàn)ermentas 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、膠回收試劑盒，上海生工生物工程有限公司；LipofectamineTM2000、Alexa Fluor?555 goat anti-rabbit IgG、Alexa Fluor?488 donkey anti-mouse IgG、Alexa Fluor?680 goat anti-rabbit IgG，Invitrogen公司；細(xì)胞完全培養(yǎng)基F-12K、胰酶、胎牛血清、DPBS，GIBIO公司；Flag抗體、嘌呤霉素(puromycin)、吖啶橙(acridine orange，AO)、DNA 染料(hoechst 33342)，Sigma 公司；TMEPAI抗體為本實(shí)驗(yàn)室純化所得；LAMP2抗體，Abcam公司；Rab7抗體，Santa Cruz 公司；β-actin抗體，天津三箭生物技術(shù)有限公司；引物合成和基因測(cè)序由北京華大基因公司完成．

1.2 方法

1.2.1 pEF-IRES-TMEPAI-Flag重組載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)目的基因 TMEPAI的核酸序列和表達(dá)載體pEF-IRES-puro 的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物，其中上、下游引物 P1、P2分別添加 AflⅡ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)示)．P1∶5'-CGCGCTT AAG ATGCACCGCTTGATGGG-3'；P2∶5'-CTGTCT AGACTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGCTC GAGAGAGGGTGTCCTTTCTGTTTATCC-3'．以實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒 pEGFP-N3-TMEPAI為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到 TMEPAI基因片段．真核表達(dá)載體pEF-IRES-puro以及 TMEPAI基因純化產(chǎn)物經(jīng) AflⅡ和XbaⅠ雙酶切后純化回收．酶切產(chǎn)物經(jīng)T4,DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10，挑取單克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后，經(jīng)AflⅡ和XbaⅠ酶切及PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，進(jìn)一步測(cè)序鑒定．

1.2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立

最適嘌呤霉素篩選濃度的確定：在 6孔板中接種適量A549細(xì)胞，37,℃、5%,CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%～90%,，更換含有不同濃度嘌呤霉素(0～2,μg/mL)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)．每天鏡下觀察，隔天更換含有嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)液．培養(yǎng)3～5,d后，導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡的嘌呤霉素最低濃度為最低致死濃度，即最適嘌呤霉素篩選濃度(一般以4,d完全致死為準(zhǔn))．

穩(wěn)定細(xì)胞系的建立：在 100,mm 培養(yǎng)皿中接種適量細(xì)胞，37,℃、5%,CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%,時(shí)，利用LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24,h后更換含有最適嘌呤霉素篩選濃度的新鮮培養(yǎng)液．每天更換含有篩選濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)．待單克隆長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)時(shí)，將單克隆挑起并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，收集細(xì)胞，免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系是否建立成功．

1.2.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMEPAI蛋白的表達(dá)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單克隆細(xì)胞，加入適量 RIPA裂解緩沖液(50,mmol/L,Tris-HCl(pH,7.4)，150,mmol/L NaCl，1%,Triton X-100)(含蛋白酶抑制劑)在冰上裂解 30,min，離心收集上清加入 SDS上樣緩沖液，經(jīng)12%,SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，5%,的脫脂奶粉室溫封閉 1,h，于 4,℃下進(jìn)行一抗(TMEPAI 1∶500、β-actin 1∶2,000)孵育過(guò)夜，PBST洗膜后再與二抗孵育2,h后，PVDF膜在Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)下掃描成像．

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)TMEPAI在細(xì)胞中定位

將適量細(xì)胞接種于已預(yù)先放置無(wú)菌細(xì)胞爬片的30,mm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約 70%,，取出細(xì)胞爬片用預(yù)冷的甲醇-20,℃固定 5,min，DPBS洗滌 1次后一抗(Flag 1∶100、LAMP2 1∶200、Rab7 1∶100)室溫孵育 3,h，DPBS洗滌 3次后二抗(Alexa Fluor?555,goat anti-rabbit IgG 1 ∶ 200 、Alexa Fluor?488 donkey anti-mouse IgG 1∶200、hoechst 33342 10,μg/mL)室溫孵育 30,min，共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照．

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔．96孔板每孔接種 5,000個(gè)細(xì)胞．待細(xì)胞貼壁后，分別加入 0、1、2、4、8、16、32、64、128,μmol/L 氯喹．處理48,h后，每孔加入20,μL MTT溶液(5,mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4,h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液．每孔加入 200,μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩 10,min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定490,nm處吸光度．

1.2.6 吖啶橙(AO)染色分析過(guò)表達(dá)TMEPAI對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響

熒光顯微鏡分析：將適量對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于放有細(xì)胞爬片的30,mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24,h后，DPBS洗滌2次，加入含有2,μmol/L AO的DPBS，于37,℃孵育 15,min，DPBS洗滌 3次，細(xì)胞爬片在熒光顯微鏡下觀察拍照．

流式細(xì)胞術(shù)分析：將適量細(xì)胞接種于 60,mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng) 24,h后，胰酶消化細(xì)胞，收集 1×106個(gè)細(xì)胞于DPBS中，加入2,μmol/L AO，于37,℃避光孵育15,min．流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光強(qiáng)度．

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理分析，采用 t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，檢驗(yàn)結(jié)果P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*、**和***分別表示與對(duì)照組比較 P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001．

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pEF-IRES-TMEPAI-Flag的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的 pEGFP-N3-TMEPAI重組載體為模版，利用引物 P1、P2，定向擴(kuò)增目的片段(圖1(a))．PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切純化后連接，轉(zhuǎn)化 E．coli TOP10宿主菌．挑取 Amp+抗性陽(yáng)性克隆菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行 PCR檢測(cè)(圖 1(b))，在 913,bp處有明顯條帶，與 TMEPAI目的基因大小一致．進(jìn)一步將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖 1(c))，結(jié)果大小分別為載體片段 5,700,bp和目的片段 913,bp．基因測(cè)序結(jié)果顯示，目的基因與 GenBank中 TMEPAI基因序列(GenBank No．NM_020182.4)完全一致．以上結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pEF-IRES-TMEPAI-Flag構(gòu)建成功．

圖1 重組質(zhì)粒pEF-IRES-TMEPAI-Flag的構(gòu)建和鑒定Fig. 1 Construction and identification of the recombinant plasmid pEF-IRES-TMEPAI-Flag

2.2 穩(wěn)定表達(dá)TMEPAI細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)篩選獲得 2個(gè)空載體對(duì)照的細(xì)胞株，分別為 pEF-IRES-puroⅠ、pEF-IRES-puroⅡ；3個(gè)穩(wěn)定表達(dá) TMEPAI-Flag的細(xì)胞株，分別為TMEPAI-FlagⅠ、TMEPAI-FlagⅡ、TMEPAI-FlagⅢ.采用Western blot檢測(cè)穩(wěn)定株TMEPAI蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖 2所示，其中 A549為正常 A549細(xì)胞；pEFIRES-puroⅠ/Ⅱ?yàn)榭蛰d體對(duì)照組；TMEPAI-FlagⅠ/Ⅱ/Ⅲ為穩(wěn)定表達(dá) TMEPAI-Flag的 A549細(xì)胞株．正常的 A549細(xì)胞與空載體對(duì)照組的 A549細(xì)胞中TMEPAI的表達(dá)量較低，而穩(wěn)定表達(dá) TMEPAI-Flag的A549細(xì)胞中TMEPAI蛋白水平顯著提高．由此表明，穩(wěn)定表達(dá)TMEPAI的A549細(xì)胞株構(gòu)建成功，其中 TMEPAI-FlagⅢ表達(dá)量最高，因此選用該穩(wěn)定株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)．

圖2 Western blot 檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株TMEPAI表達(dá)Fig. 2 Detection of the expression of TMEPAI in stable cell lines by Western blot

采用免疫熒光法檢測(cè)構(gòu)建的 A549穩(wěn)定細(xì)胞株中TMEPAI的定位情況．如圖3所示，在穩(wěn)定細(xì)胞株中，TMEPAI與 LAMP2(溶酶體 marker)有明顯共定位，與 Rab7(晚期內(nèi)吞體 marker)有部分共定位，由此進(jìn)一步證明，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) TMEPAI-Flag的A549細(xì)胞株．

圖3 穩(wěn)定細(xì)胞株中TMEPAI的定位Fig. 3 TMEPAI localization in stable cell lines

2.3 TMEPAI過(guò)表達(dá)對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響

氯喹是一種溶酶體抑制劑，通過(guò)升高溶酶體腔內(nèi)pH使溶酶體膨大，并引起溶酶體通透化，從而抑制溶酶體功能[30]．利用不同濃度的氯喹處理穩(wěn)定細(xì)胞株，觀察TMEPAI表達(dá)對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖4所示．隨著氯喹處理細(xì)胞的濃度增加，48,h后正常 A549細(xì)胞的存活率逐漸降低，32,μmol/L時(shí)細(xì)胞基本完全死亡．而穩(wěn)定細(xì)胞株在氯喹處理濃度32,μmol/L 時(shí)仍有細(xì)胞存活．由此說(shuō)明，過(guò)表達(dá)TMEPAI可以增加溶酶體對(duì)氯喹的耐受性，使溶酶體穩(wěn)定性增強(qiáng)．

圖4 MTT檢測(cè)過(guò)表達(dá)TMEPAI對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of TMEPAI expression on the lysosome stability by MTT assay

2.4 吖啶橙染色分析過(guò)表達(dá) TMEPAI對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響

吖啶橙(AO)是一種溶酶體異質(zhì)性熒光染料，可透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入溶酶體內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的 pH影響AO分布的濃度，即pH低時(shí)AO濃度高，而pH高時(shí)AO濃度低．當(dāng)用紫外光激發(fā)時(shí)，AO在高濃度(當(dāng)其存在于溶酶體內(nèi))下顯示橘紅色熒光，而在低濃度(當(dāng)其存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中)下顯示綠色熒光[31].因此，AO染色的細(xì)胞內(nèi)橘紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，說(shuō)明溶酶體越穩(wěn)定，分別通過(guò)熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的強(qiáng)度．

利用熒光顯微鏡觀察 AO在穩(wěn)定表達(dá) TMEPAI細(xì)胞株內(nèi)的分布情況，結(jié)果如圖 5所示．與對(duì)照組相比，穩(wěn)定細(xì)胞株(TMEPA1-FlagⅢ)的紅色熒光較強(qiáng)，說(shuō)明過(guò)表達(dá) TMEPAI后，溶酶體的穩(wěn)定性增強(qiáng)，即TMEPAI增加了溶酶體的穩(wěn)定性．

圖5 AO染色檢測(cè)TMEPAI表達(dá)對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of TMEPAI expression on the lysosome stability by AO staining

采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)AO染色進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖 6所示．對(duì)照組高于紅色熒光閾值(溶酶體陽(yáng)性)的細(xì)胞數(shù)為 73.8%,，實(shí)驗(yàn)組(TMEPA1-FlagⅢ)的細(xì)胞數(shù)為 92.7%，較對(duì)照組增加了 18.9%．這說(shuō)明過(guò)表達(dá)TMEPAI后，細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，溶酶體的穩(wěn)定性增強(qiáng)．

圖6 流式細(xì)胞技術(shù)分析過(guò)表達(dá) TMEPAI對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Impact of TMEPAI expression on the lysosome stability by flow cytometry assay

3 討 論

溶酶體結(jié)構(gòu)和功能的完整性需要溶酶體膜蛋白以及腔內(nèi)水解酶的共同調(diào)節(jié)，溶酶體膜蛋白主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)內(nèi)腔 pH、胞質(zhì)蛋白的膜融合以及降解產(chǎn)物的外排．越來(lái)越多的研究表明，溶酶體蛋白通過(guò)溶酶體調(diào)控一系列細(xì)胞生理過(guò)程，如溶酶體跨膜蛋白LAPTM4B能夠維持溶酶體膜腔 pH，增強(qiáng)溶酶體的穩(wěn)定性[30]；轉(zhuǎn)錄因子 EB(transcription factor EB，TFEB)能夠酸化溶酶體內(nèi)腔，促進(jìn)水解酶的運(yùn)輸以及自噬體與溶酶體的融合[32-33]．TMEPAI是溶酶體定位蛋白質(zhì)[22]，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn) TMEPAI能夠增強(qiáng)溶酶體的穩(wěn)定性，抵抗藥物刺激(etoposide)引起的溶酶體通透化(lysosomal membrane permeabilization，LMP)[34]．溶酶體的通透化會(huì)使腔內(nèi)H+以及酸性水解酶釋放到胞質(zhì)中，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH失衡以及細(xì)胞器損傷．通過(guò) konckdown實(shí)驗(yàn)證明了干擾 TMEPAI表達(dá)能降低溶酶體膜的穩(wěn)定性，與本文的結(jié)果一致，證明了TMEPAI表達(dá)能增加溶酶體膜的穩(wěn)定性．

對(duì)于活細(xì)胞來(lái)說(shuō)，溶酶體內(nèi)高濃度的水解酶為其發(fā)揮功能起到重要作用，但它的不穩(wěn)定可能會(huì)給自身帶來(lái)潛在的危害．一旦溶酶體膜被破壞，將導(dǎo)致其內(nèi)部水解酶釋放至細(xì)胞質(zhì)，造成溶酶體通透化，引起無(wú)法控制的細(xì)胞內(nèi)容物降解．同時(shí)，大量的溶酶體膜破裂可引起細(xì)胞內(nèi)酸化，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡．此外，溶酶體通透化可能與活性氧(ROS)有關(guān)，溶酶體去穩(wěn)定化已被認(rèn)為是由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷所造成的[35]，并且 ROS可誘導(dǎo)溶酶體泄漏[36]．本文通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) TMEPAI細(xì)胞株，研究發(fā)現(xiàn) TMEPAI表達(dá)能增加溶酶體膜的穩(wěn)定性．Hu等[37]研究表明TMEPAI與ROS有關(guān)，由此推測(cè)TMEPAI可能通過(guò)抑制 ROS增加溶酶體穩(wěn)定性．Kirkegaard等[38]發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白 70(Hsp70)通過(guò)調(diào)節(jié)鞘磷脂代謝增加溶酶體膜的穩(wěn)定性．TMEPAI表達(dá)增加溶酶體膜的穩(wěn)定性可能增強(qiáng)了癌細(xì)胞的抗凋亡能力，實(shí)驗(yàn)也表明過(guò)表達(dá) TMEPAI可以抵抗氯喹對(duì)肺癌細(xì)胞 A549殺傷作用．因此，TMEPAI可能成為抗癌的潛在藥物靶點(diǎn)．

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究成功構(gòu)建了 pEF-IRES-TMEPAI-Flag表達(dá)載體，并建立了穩(wěn)定表達(dá)TMEPAI的細(xì)胞株，且證實(shí)了 TMEPAI蛋白在溶酶體表達(dá)．同時(shí)，發(fā)現(xiàn)TMEPAI表達(dá)可以增強(qiáng)溶酶體的穩(wěn)定性．

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