張紅梅，劉曉慶，陳華濤，袁星星，崔曉艷，張智民，黃中文，陳 新

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014；2.河南科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)系，河南 新鄉(xiāng) 453003)

干旱、高鹽、低溫、高溫等極端條件，是植物生長(zhǎng)過(guò)程中所面臨的主要逆境脅迫因子。在逆境條件下，與植物抗逆相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，從而產(chǎn)生脅迫響應(yīng)。植物響應(yīng)非生物脅迫的基因可分為兩類：①功能基因，如編碼與脅迫有關(guān)的LEA蛋白、抗凍蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子合成酶以及逆境脅迫產(chǎn)生的ROS等清除系統(tǒng)的相關(guān)酶基因[1]；②編碼與抗逆相關(guān)參與信號(hào)傳遞蛋白激酶和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、bZIP、WRKY、AP2/EREBP和NAC等[2]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中發(fā)現(xiàn)最早的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指紋結(jié)構(gòu)的類型，WRKY蛋白可分成3組[3]：第Ⅰ組含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指紋結(jié)構(gòu)模式為C-X4-5-C-X22-23H-X-H，如SPF1、ABF1、PcWRKY1和AtWRKY33[4-7]等；第Ⅱ和Ⅲ組均含1個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，第Ⅱ組鋅指紋結(jié)構(gòu)模式與第Ⅰ組相同，如AtWRKY18(NP_567882)等；第Ⅲ組僅在組成鋅指紋的氨基酸有變化，為C-X7-C-X22-23-H-X-C，如AtWRKY70(NP_191199)等。

Ishiguro 和Nakamura[4]在甘薯中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1。隨后，其他研究者又相繼在水稻、擬南芥、棉花、煙草、大麥、小麥和豆類[8-14]等植物中克隆得到WRKY轉(zhuǎn)錄基因。WRKY轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物抗病與非生物脅迫的響應(yīng)，而且在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝等過(guò)程中起重要作用[15-20]。擬南芥AtWRKY22和AtWRKY29是MAPK通路中重要的下游組成成分[21]，對(duì)擬南芥抵抗真菌和細(xì)菌等抗性具有調(diào)節(jié)作用。李立芹[22]研究發(fā)現(xiàn)，煙草WRKY12基因受4 ℃低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtWRKY25和AtWRKY33 基因，能夠顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高溫和高鹽的耐受性[23-25]；過(guò)表達(dá)OsWRKY47能提高水稻的抗旱性[26]。擬南芥AtWRKY28基因受ABA、高鹽、機(jī)械損傷和低磷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[27-28]。大豆基因組中大約有300個(gè)WRKY基因(http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Gma)，但目前僅有少數(shù)第Ⅱ組成員的功能被鑒定，如GmWRKY111[29]、GmWRKY13、GmWRKY21和GmWRKY54[15]參與鹽、干旱和冷害等多種非生物逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，它們過(guò)量表達(dá)，能增強(qiáng)植物對(duì)鹽、干旱和冷害的適應(yīng)性。

大豆(Glycinemax)是我國(guó)最重要的油料作物之一，干旱、鹽害、低溫和低磷等非生物脅迫嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。已有研究表明，大豆很多WRKY參與非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，然而關(guān)于WRKY Group Ⅲ成員參與非生物脅迫響應(yīng)及功能分析的研究較少。Yang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，大豆WRKY家族第Ⅲ組的GmWRKY58和GmWRKY76在大豆發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。過(guò)量表達(dá)GmWRKY58和GmWRKY76基因的擬南芥比野生植株開(kāi)花早，這種提早開(kāi)花的表型與幾個(gè)促進(jìn)開(kāi)花基因的表達(dá)增加有關(guān)；病毒誘導(dǎo)大豆GmWRKY58和GmWRKY76基因沉默導(dǎo)致植物葉片擴(kuò)展減少和莖生長(zhǎng)停止等不良現(xiàn)象，但GmWRKY58在響應(yīng)非生物逆境脅迫的表達(dá)模式還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用熒光定量方法，分析不同非生物逆境脅迫下GmWRKY58基因的表達(dá)水平，明確其響應(yīng)的非生物逆境脅迫因子，為進(jìn)一步探究GmWRKY58基因在非生物脅迫應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本研究所用大豆材料為科豐1號(hào)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豆類作物研究室提供。采用改良的Zhang等[31]的方法于2015年6月大豆長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，取整齊度一致的幼苗放置在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)2 d，換至正常營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)液pH調(diào)至6.0。2 d以后將大豆幼苗分別于含200 mmol/L NaCl 和2% PEG8000的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行高鹽、干旱脅迫處理，分別在0，6，12，24，48 h取根、莖、葉樣；于4 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理，用2 mmol/L水楊酸(SA)噴施，分別取0，6，9，12，24，48 h葉片樣；低N(75.8 mmol/L)、低P(5 μmol/L)、低K(96.5 mmol/L)和缺Fe(0 mmol/L)處理0，6，12，24，48 h取根、葉樣，對(duì)照組分別采用正常營(yíng)養(yǎng)液。

挑選籽粒飽滿、大小一致的科豐1號(hào)種子種植于土壤中，待真葉自然展開(kāi)后，于2015年5月19日取根、莖、葉，2015年6月19日取花，2015年7月3日取幼莢，2015年8月8日取幼嫩種子。每處理3 次重復(fù)。將樣品迅速置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大豆總RNA 提取與cDNA合成

采用RNA提取試劑盒(RNA plant plus Reagent，TIANGEN)提取大豆不同組織、不同處理時(shí)間點(diǎn)樣品的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV reverse transcriptase，TaKaRa)操作說(shuō)明書合成cDNA第一鏈[32]。

1.3 基因克隆

從Phytozome(http：//www.phytozome.net/)網(wǎng)站下載大豆GmWRKY58 核酸序列，采用Premier 5 設(shè)計(jì)特異引物，上游引物為GmWRKY58 F：5′-ATGA

GTATTCTCTTCCCAAGAAG-3′，下游引物為GmWRKY58 R：5′-CTAAAGCAATTGGCTTTCATC-3′。

以大豆cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。25 μL的PCR反應(yīng)體系中包括10×Taq緩沖液3.0 μL，Taq聚合酶0.5 μL，2.5 μL的dNTPs (2.5 mmol/L)，MgCl2(25 mmol/L) 2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上下游引物各1 μL (10 pmol/L)，最后用ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR 產(chǎn)物電泳后，切膠純化回收?；厥掌闻cpGEM-T easy載體連接，連接產(chǎn)物進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)鑒定后的陽(yáng)性克隆送Invitrogen公司測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用在線軟件Compute pI/Mwtool、ExPASy (http：//expasy.org/tools/pi_tool.html)預(yù)測(cè)蛋白的分子量和等電點(diǎn)；通過(guò)SignalP (http：//cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析GmWRKY58蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；由DNAMAN軟件完成多序列比對(duì)；以MEGA 6 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹；選取GmWRKY58 基因ATG上游1.5 kb的堿基序列，在 PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)順式作用元件。http：//www.genscript.com/wolf-psort.html進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用http：//www.biogem.org/tool/chou-fasman/完成。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)分析

以單鏈cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物：F：5′-CATGCATGGAGAAAGTACGG-3′；5′-GTTG

CACTTGTTTGGTTGCT-3′。以大豆組成型表達(dá)β-Tubuin基因(GenBank 登錄號(hào)為AK286413)為內(nèi)參基因(F：5′-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3′；R：5′-C

ACTTACGCATCACATAGCA-3′)。采用ABI PRISM7500實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)分析。反應(yīng)體系為：模板cDNA 1.0 μL(10 ng/μL)，2×SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)10.0 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 1.0 μL，Primer F 0.8 μL、Primer R 0.8 μL，補(bǔ)ddH2O至20.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT[33]法分析數(shù)據(jù)，計(jì)算GmWRKY58基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，qRT-PCR為3次技術(shù)重復(fù)。

1.6 亞細(xì)胞定位

以GmWRKY58基因的ORF正確的克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)NcoⅠ和SpeⅠ雙酶切，同時(shí)pCambia1302質(zhì)粒用NcoⅠ和SpeⅠ雙酶切，分別回收小片段和大片段，將二者用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接，從而得到35S∷GmWRKY58∷GFP融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌。用菌落PCR、酶切方法篩選陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。

獲得的重組質(zhì)粒35S∷GmWRKY58∷GFP轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株。參照文獻(xiàn)[34]，在3.0 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 mg/LKam，17 mg/LRif )中培養(yǎng)含雙元載體的農(nóng)桿菌，28 ℃，200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)，室溫下3 000 r/min離心10 min后收集菌體，加1.0 mL注射培養(yǎng)基懸浮菌體，室溫3 000 r/min離心10 min后棄上清，重復(fù)一次，最后用注射培養(yǎng)基懸浮。測(cè)600 nm吸光值(OD)，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600)為0.1～0.2時(shí)，用無(wú)針頭的注射器將農(nóng)桿菌菌液注射到3～4周齡的本氏煙葉片。然后在溫室中培養(yǎng)(27 ℃光照16 h，22 ℃黑暗8 h) 24～72 h，在激光掃描電鏡下觀察熒光蛋白的發(fā)光情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmWRKY58 克隆及序列分析

從Phytozome(http：//www.phytozome.net/)網(wǎng)站下載大豆GmWRKY58 核酸序列，根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)引物，以科豐1號(hào)大豆葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出單一的條帶。將測(cè)序得到的結(jié)果與大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.phytozome.net/)進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示與大豆Williams 82.a2.v1的Glyma.04G223300(NP_001237638)基因序列完全一致 (圖1)。目的片段大小為954個(gè)核苷酸，具有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框。序列分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列N端具有WRKYGQK的保守結(jié)構(gòu)域，C端具有C-X7-C-X22-23-H-X-C保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，系WRKY家族基因GroupⅢ成員。

方框?yàn)閃RKY結(jié)構(gòu)域和鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。Boxes stands for the WRKY domain and zinc finger protein domain，respectively.

2.2 氨基酸序列及理化性質(zhì)分析

GmWRKY58基因編碼一個(gè)含有317個(gè)氨基酸，分子量為35.855 6 ku蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為5.46。GmWRKY58為穩(wěn)定在組織中的表達(dá)特性蛋白，無(wú)信號(hào)肽。GmWRKY58編碼蛋白的整條肽鏈都位于細(xì)胞核。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在GmWRKY58蛋白中，螺旋結(jié)構(gòu)占60.60%，肽鏈占59.0%，無(wú)規(guī)則卷曲占17.7%。

為了研究GmWRKY58的進(jìn)化情況，筆者構(gòu)建了GmWRKY58的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示：GmWRKY58與大豆WRKY70(XP_003526799)序列一致性最高，為91%；其次為綠豆WRKY70(XP_014500012)、鷹嘴豆WRKY70(XP_004502820)、巨桉WRKY70 (XP_010067621)、毛果楊WRKY70 (XP_002319879)、胡楊WRKY70 (XP_011014496)、蘋果WRKY70 (XP_008369379)、麻風(fēng)樹WRKY70 (XP_012091128)和可可WRKY70 (XP_007011367)，序列一致性為43%～74%；而與野草莓亞種WRKY70(XP_004305079)、桑樹WRKY70(XP_010093537)、甜瓜WRKY70(XP_008442314)、煙草WRKY70(XP_009586653)和芝麻WRKY70(XP_011085118)的一致性較低。

Pe.胡楊；Pt.毛果楊；Jc.麻瘋樹；Tc.可可；Gr.雷蒙德氏棉；Vv.葡萄；Eg.巨桉；Ca.鷹嘴豆；Vr.綠豆；Gm.大豆；Md.蘋果；Nn.蓮；Fv.野草莓亞種；Mn.桑樹；Cm.甜瓜；Nt.煙草；Si.芝麻。

PeWRKY70.Populuseuphratica，XP_011014496；PtWRKY70.Populustrichocarpa，XP_002319879；JcWRKY70.Jatrophacurcas，XP_012091128；TcWRKY70.Theobromacacao，XP_007011367；GrWRKY70.Gossypiumraimondii，XP_012460911；VvWRKY70.Vitisvinifera，XP_002275401；EgWRKY70.Eucalyptusgrandis，XP_010067621；CaWRKY70.Cicerarietinum，XP_004502820；VrWRKY70.Vignaradiatavar.，XP_014500012；GmWRKY70.Glycinemax，XP_003526799；MdWRKY70.Malusdomestica，XP_008369379；NnWRKY70.Nelumbonucifera，XP_010252044；FvWRKY70.Fragariavescasubsp.，XP_004305079；MnWRKY70.Morusnotabilis，XP_010093537；CmWRKY70.Cucumismelo，XP_008442314；NtWRKY70.Nicotianatomentosiformis，XP_009586653；SiWRKY70.Sesamumindicum，XP_011085118.

圖2大豆GmWRKY58與其他植物WRKY蛋白的系統(tǒng)演化分析
Fig.2PhylogeneticanalysisofthededucedaminoacidsequencebetweenGmWRKY58andotherWRKYproteins

2.3 組織表達(dá)特性

GmWRKY58基因在根、莖、葉和花等器官中均有表達(dá)，在不同器官基因表達(dá)水平從高到低的順序依次為：葉、根、莖、花、莢，在營(yíng)養(yǎng)器官根、莖、葉中的表達(dá)量顯著高于花和莢生殖器官中的表達(dá)量(圖3)。其中，葉片中的表達(dá)量為根的2.16倍；在根和莖中的表達(dá)量相差不大，花和莢中的表達(dá)量較低。這可能是由于植物根莖葉在感知逆境信號(hào)和激素信號(hào)中起重要作用。

2.4 GmWRKY58 在非生物脅迫下的表達(dá)特性

用高鹽、干旱、低溫、SA、低N、低P、低K和缺Fe處理大豆幼苗，以qRT-PCR分析其表達(dá)動(dòng)態(tài)(圖4-6)。

結(jié)果表明，高鹽脅迫能強(qiáng)烈誘導(dǎo)GmWRKY58表達(dá)，200 mmol/L的NaCl處理下(圖4-A)，GmWRKY58基因在根和莖中的表達(dá)呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，根和莖中上調(diào)表達(dá)至最高值分別出現(xiàn)在12，24 h，為相對(duì)表達(dá)量為0 h時(shí)的187.4，13.1倍；

不同小寫字母表示在新復(fù)極差法分析中0.05水平上存在顯著性差異。圖4-6同。Bars superscripted by different lowercase letters are significantlydifferent at the 0.05 probability level.The same as Fig.4-6.

葉中表達(dá)呈下降趨勢(shì)，在葉中的表達(dá)量則始終低于對(duì)照。2% PEG8000干旱處理后，在根、莖和葉中的誘導(dǎo)表達(dá)模式不盡相同，根中GmWRKY58表達(dá)量高于莖和葉。根和莖中最高表達(dá)量均出現(xiàn)在處理后48 h，分別是0 h時(shí)的15.1，18.4倍，表現(xiàn)為先升后降再升的趨勢(shì)和上升趨勢(shì)；葉中總體表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，最高表達(dá)量出現(xiàn)在處理后12 h，是0 h時(shí)的10.0倍(圖4-B)。低溫(4 ℃)和水楊酸(SA)處理(圖5)沒(méi)有明顯的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，上調(diào)表達(dá)至最高值分別出現(xiàn)在處理后12 h 和24 h，相對(duì)表達(dá)量為0 h時(shí)的2.7，1.7倍。

低N、低P、低K和缺Fe處理后，GmWRKY58誘導(dǎo)表達(dá)模式存在差異。低N和缺Fe處理后，GmWRKY58基因在根中相對(duì)表達(dá)量高于葉片，最高表達(dá)量分別出現(xiàn)在處理后24，6 h，是0 h時(shí)的4.9，3.4倍(圖6-A、D)。低P和低K處理后，GmWRKY58在葉中的相對(duì)表達(dá)量高于根，最高表達(dá)量均出現(xiàn)在葉中0 h，表現(xiàn)為先降后升的趨勢(shì)(圖6-B、C)。

圖4 鹽脅迫(A)和干旱(B)處理?xiàng)l件下GmWRKY58基因的表達(dá)Fig.4 Expression of GmWRKY58 under salt stress (A) and drought (B) treatments

圖5 低溫4 ℃(A)和SA(B)誘導(dǎo)大豆葉片GmWRKY58表達(dá) Fig.5 Expression of GmWRKY58 in leaf of soybean induced by cold (4 ℃，A) and SA (B) treatments

2.5 GmWRKY58 蛋白的亞細(xì)胞定位

通過(guò)PSORTII(http://www.genscript.com/wolf-psort.html) 網(wǎng)站對(duì)GmWRKY58蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果定位于細(xì)胞核中。為了從試驗(yàn)上進(jìn)一步證明其亞細(xì)胞定位，將瞬時(shí)表達(dá)載體35S∷GmWRKY58∷GFP轉(zhuǎn)化到本氏煙葉片，溫室培養(yǎng)24～72 h后，通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的信號(hào)。結(jié)果顯示(圖7)，轉(zhuǎn)pCambia1302-GFP 載體的綠色熒光分布在整個(gè)細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，轉(zhuǎn)35S∷GmWRKY58∷GFP載體的綠色熒光分布在細(xì)胞核中，說(shuō)明GmWRKY58定位在細(xì)胞核中，這與GmWRKY58基因序列上含有一個(gè)核定位信號(hào)(NLS)區(qū)域的特征相符，也與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相同，說(shuō)明GmWRKY58是轉(zhuǎn)錄因子，定位在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)。

圖6 低N(A)、低P(B)、低K(C)和缺Fe(D)誘導(dǎo)GmWRKY58表達(dá) Fig.6 Expression of GmWRKY58 in soybean induce by low nitrogen (A)，low phosphorus (B)，low potassium (C) and iron deficiency (D) treatments

A、D.紫外激發(fā)的熒光信號(hào)；B、E.可見(jiàn)光的信號(hào)；C、 F. A和B疊加，D和E疊加。 A，D.UV-excited fluorescence signals；B，E.Signals under bright field；C，F(xiàn).Merged image of A and B,D and E.

2.6 GmWRKY58的啟動(dòng)子分析

上述表達(dá)分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY58在非生物脅迫下存在一定功能，猜測(cè)其啟動(dòng)子序列上可能含有響應(yīng)非生物脅迫的應(yīng)答元件。在PlantCARE網(wǎng)站上預(yù)測(cè)GmWRKY58啟動(dòng)子的順式作用元件，結(jié)果表明(表1)，GmWRKY58基因的啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)響應(yīng)逆境和植物激素的順式作用元件，例如：ACE類似序列、MBS核心序列、HSE核心序列、富含TC的重復(fù)序列、TGA盒和TATA盒等。這些調(diào)控元件暗示GmWRKY58在植物響應(yīng)抗逆方面可能具有重要作用。

表1 GmWRKY58啟動(dòng)子上的順式作用元件預(yù)測(cè) Tab.1 The cis-acting elements in the promoter sequence of GmWRKY58

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類基因可以較快響應(yīng)逆境脅迫[35]。本研究結(jié)果顯示，大豆GmWRKY58基因受高鹽、干旱、低N和缺Fe等多種逆境脅迫后在其根部強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)模式不同，說(shuō)明GmWRKY58基因在不同脅迫環(huán)境下可能具有不同的響應(yīng)機(jī)制。根部組織對(duì)這幾種脅迫更敏感，這可能與其最早受水分脅迫或滲透脅迫導(dǎo)致較快脫水有關(guān)。大豆GmWRKY75和GmWRKY6基因在低P、低N、低K和缺Fe脅迫下表達(dá)趨勢(shì)基本一致，都呈先微弱下調(diào)再明顯上調(diào)，但不同處理達(dá)到最高表達(dá)量的時(shí)間點(diǎn)不同[36]，與本研究中GmWRKY58基因的表達(dá)模式存在著很大差異，這可能是由于它們基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的差異導(dǎo)致WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有多種基因功能。

本研究中，GmWRKY58基因在大豆的根、莖、葉、花和莢中均有表達(dá)，根、莖、葉中的表達(dá)量顯著高于花和莢，這與前人的研究結(jié)果一致[30]，說(shuō)明GmWRKY58對(duì)于大豆的營(yíng)養(yǎng)與生殖器官發(fā)育都有一定的作用，但其發(fā)揮作用的大小、調(diào)控方式可能存在不同。

通過(guò)不同物種WRKY氨基酸序列同源性分析和 Blast 比對(duì)，結(jié)果表明GmWRKY58與大豆WRKY70之間序列一致性最高，其次為綠豆、鷹嘴豆、巨桉、毛果楊、胡楊、蘋果、麻風(fēng)樹、可可，說(shuō)明GmWRKY58在相同物種中保守性比在不同物種間保守性高；GmWRKY58基因在物種間進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)受不同選擇壓力的選擇。

蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位決定了其行使功能的部位。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)GmWRKY58定位在細(xì)胞核中，本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一預(yù)測(cè)，該結(jié)果與已報(bào)道的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[30]，同時(shí)也與GmWRKY58作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控基因的表達(dá)相吻合。

WRKY通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子上保守的W box 順式元件來(lái)調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)[37]。通過(guò)分析GmWRKY58基因上游1 500 bp的啟動(dòng)子片段，發(fā)現(xiàn)其含有多個(gè)與干旱、光響應(yīng)、熱激等逆境脅迫和生長(zhǎng)素、赤霉素、茉莉酸等激素相關(guān)的誘導(dǎo)元件。GmWRKY58的啟動(dòng)子區(qū)域含有2個(gè)干旱應(yīng)答的順式元件MBS，推測(cè)該基因在大豆響應(yīng)抗旱脅迫，調(diào)節(jié)干旱的抗性方面具有一定的功能，本試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，如PEG處理下，大豆根中的GmWRKY58在短時(shí)間內(nèi)即受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)，表達(dá)量提高近20倍。同時(shí)，在啟動(dòng)子區(qū)域還含有1個(gè)參與防御和逆境響應(yīng)的順式元件TC-rich repeats，當(dāng)外界環(huán)境存在如高鹽、低N和缺Fe時(shí)，通過(guò)這個(gè)誘導(dǎo)元件，與逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可以激活GmWRKY58基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，GmWRKY58轉(zhuǎn)錄因子又可以調(diào)控下游與逆境脅迫相關(guān)的功能基因表達(dá)，從而降低不良環(huán)境對(duì)植物造成的傷害。

大豆GmWRKY58基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為954 bp，編碼317個(gè)氨基酸。GmWRKY58轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中。GmWRKY58基因在根、莖、葉、花和莢等組織均有表達(dá)，種子中不表達(dá)，根莖葉中的表達(dá)量顯著高于花和莢。該基因明顯受高鹽、干旱、低N和缺Fe脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明GmWRKY58在大豆的抗鹽、抗旱、低N和缺Fe等非生物脅迫響應(yīng)中起到重要的作用。

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