高哲，李心樂，2，李杰 ，2，張平 ，2△

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見的全關節(jié)病，流行病學調查顯示世界范圍內有超過7億人口患有OA［1］。其是導致殘疾的主要原因，給家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔［2-3］。OA的主要特征為軟骨下骨的異常骨重建、內外側脛骨平臺不均勻沉降和軟骨的損傷。在OA疾病中，軟骨和軟骨下骨形成一個整體并相互影響，在OA發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用［4］。軟骨下骨的病變加重了關節(jié)軟骨的病理改變，加速了OA的病程進展［5］。本課題組前期研究表明，在OA動物模型中破骨細胞活性及功能明顯增高，破骨細胞活性升高與軟骨病變和軟骨下骨的骨吸收呈正相關［6］。有研究顯示，在OA動物和患者的軟骨下骨中，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色的陽性細胞數均顯著增多［7］。另外，張英澤院士在2014年提出不均勻沉降理論，即由于關節(jié)病變引起的承重骨受力不均導致不均勻沉降現象。膝關節(jié)脛骨平臺的軟骨下骨為松質骨區(qū)，也是負重面最大的部位，這樣的解剖生理特征導致膝關節(jié)炎多發(fā)生脛骨平臺內外側不均勻沉降現象［8］。因此，本課題組推測，抑制異常破骨細胞活性、糾正異常骨重建和脛骨平臺內外側不均勻沉降現象可能是治療OA的一種方法。

Salubrinal是一種化學合成劑，能抑制真核翻譯起始因子2α（eIF2α）的去磷酸化水平［9］。本課題組前期工作證實，Salubrinal可促進骨創(chuàng)傷的愈合［10］，抑制破骨細胞的發(fā)育［11］，可用于治療骨質疏松［12］和股骨頭壞死［13］。還有研究顯示，Salubrinal可通過下調核因子-κB（NF-κB）信號、抑制基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）的表達和活性，對OA軟骨的損傷有保護作用［14-15］。但其對OA軟骨下骨的治療作用以及是否能改變不均勻沉降現象尚不清楚。本研究采用手術切除小鼠膝關節(jié)內側半月板建立OA模型，造成膝關節(jié)穩(wěn)定性失衡，觀察脛骨平臺病理改變和Salubrinal對小鼠OA的治療效果，以期為OA的治療提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30只SPF級雌性C57BL/6小鼠，約14周齡，體質量18～20 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。每籠5只小鼠，自由攝取飼料和水。所有實驗根據天津醫(yī)科大學實驗動物管理規(guī)定進行，并經天津醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 Salubrinal購自英國Tocris Bioscience公司。細胞因子購自美國PeproTech公司。α-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司。番紅O染料、萘酚AS-MX磷酸鹽（Naphthol AS-MX phosphate）、快速紅TR鹽（Fast red TR salt）、結晶紫、TRAP染色試劑盒等其他化學品購自美國Sigma公司。

1.1.3 染液配制 1%番紅O：5 g番紅O染料+500 mL蒸餾水。TRAP染液：0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液50 mL+萘酚AS-MX磷酸鹽25 mg+快速紅TR鹽55 mg。0.5%結晶紫染液：500 mg結晶紫+25 mL甲醇+75 mL蒸餾水。

1.1.4 主要儀器 石蠟切片機（RM2255）購自德國Leica公司。倒置相差顯微鏡（CKX41SF）及普通雙目正置顯微鏡（BX41-12H02）購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 采用隨機數字表法將30只C57BL/6雌性小鼠分為假手術（Sham）組、OA組、OA+Salubrinal藥物治療（OA+Sal）組，每組10只。

1.2.2 動物模型制備 用1.5%異氟烷麻醉小鼠，于膝關節(jié)內側打開關節(jié)腔，使用手術顯微鏡和顯微外科技術切除內側半月板。對于Sham組，只切開關節(jié)內側皮膚。術后使用丁丙諾啡鹽酸鹽鎮(zhèn)痛抗感染。

1.2.3 給藥方法 手術造模后，給予OA+Sal組小鼠皮下注射Salubrinal（1 mg/kg），每日1次，連續(xù)2周。同時給予Sham組及OA組小鼠等量的生理鹽水。

1.2.4 組織學分析

1.2.4.1 組織處理 脫頸法處死小鼠后，剝離小鼠后腿，剔除皮膚、軟組織及韌帶，保留完整腿骨及膝關節(jié)囊。將膝關節(jié)標本在10%中性甲醛溶液中固定2d，并在14%乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣2周，梯度乙醇脫水、透明，石蠟包埋標本，冠狀位組織切片，厚度為5 μm。

1.2.4.2 番紅O染色 組織切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，1%番紅O染液染色30 min，脫水、透明后樹膠封片，顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)學改變，評估關節(jié)軟骨及軟骨下骨板（SBP）的組織學改變。每張切片在脛骨平臺的軟骨區(qū)域分別從內外側的承重區(qū)選取3個400倍視野。通過國際骨關節(jié)炎研究協會（OARSI）評分對軟骨損傷進行評分，測量鈣化軟骨厚度（CC）和全層關節(jié)軟骨厚度（TAC），并計算鈣化軟骨與關節(jié)軟骨的比值（CC/TAC），評估軟骨病變。測量SBP厚度，評估軟骨下骨板的變化。

1.2.4.3 TRAP染色 組織切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，放入配置好的TRAP染液中染色60 min，脫水、透明后水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察軟骨下骨組織病理形態(tài)學改變，評估軟骨下骨的骨面積分數和破骨細胞數量的變化。每張切片在脛骨平臺的軟骨下骨部分分別從內外側的承重區(qū)選取3個200倍視野，計算單位面積內的骨面積分數（B.Ar/T.Ar）和TRAP染色陽性細胞長度占骨小梁長度的百分比（Oc.S/BS）。

1.2.4.4 內外側脛骨平臺倍數變化分析 為了比較內外側脛骨平臺的病變程度和療效，采用OA組每個標本OARSI評分和B.Ar/T.Ar的評估值除以Sham組對應指標的均值，計算OA小鼠相對于Sham小鼠內外側脛骨平臺的變化倍數。同樣，用OA+Sal組每個標本OARSI評分和B.Ar/T.Ar的評估值除以OA組對應指標的均值，計算Salubrinal對OA小鼠內外側脛骨平臺的恢復倍數。進而比較內外側脛骨平臺倍數變化。

1.2.5 細胞學分析

1.2.5.1 收集骨髓來源細胞 小鼠安樂死后，用含有胎牛血清（FBS）的Iscove’s MEM沖洗雙側髂骨，收集骨髓來源的細胞，低密度梯度離心法分離出骨髓單個核細胞，并在顯微鏡下用血球計數板進行計數，用于以下細胞實驗。

1.2.5.2 破骨細胞形成實驗 將分離出的骨髓單個核細胞均勻混懸于α-MEM培養(yǎng)液，種入96孔板中，密度為1×105/孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。培養(yǎng)液中含有10%FBS、30 μg/L小鼠巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和20 μg/L小鼠核因子kappa-B配體的受體激活因子（RANKL）。在第4 天，更換為含有 10%FBS，30 μg/L M-CSF 和 60 μg/L RANKL的α-MEM培養(yǎng)基，第6天按照TRAP染色試劑盒說明書進行TRAP染色。顯微鏡下觀察、拍片，每孔隨機選取5個200倍視野，測量胞核＞3個的融合破骨細胞的面積，計算單位面積內融合破骨細胞所覆蓋的區(qū)域Oc.Ar（%）。

1.2.5.3 破骨細胞遷移實驗 使用transwell實驗評估破骨細胞的遷移能力。誘導骨髓來源的單個核細胞形成前破骨細胞，培養(yǎng)液為含10%FBS和30 μg/L M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。遷移實驗采用transwell小室（小孔直徑8 μm）進行檢測。在transwell小室外加入含有1%胎牛血清白蛋白（BSA）和30 μg/L M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基，誘導小室壁內無營養(yǎng)條件的前破骨細胞遷移至小室壁外。將前破骨細胞種入transwell小室內，密度為1×105/孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。常溫下0.5%結晶紫染液染色30 min，顯微鏡下觀察、拍片，每孔隨機選取5個200倍視野，計數視野內遷移的前破骨細胞的數量（migrated cells/FV），代表破骨細胞的遷移能力。

1.2.5.4 破骨細胞黏附實驗 為了測定破骨細胞的黏附性，將骨髓來源的單個核細胞誘導形成前破骨細胞，方法同上。將前破骨細胞種入1%明膠包被好的96孔板中，密度為1×105/孔，培養(yǎng)液為含10%FBS和30 μg/L M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內孵育1h。用無水甲醇在室溫下固定15 min，0.5%結晶紫染液染色，顯微鏡下觀察、拍片，每孔隨機選取5個200倍視野，計數視野內黏附的前破骨細胞的數量（Adherent cells/FV），代表破骨細胞的黏附能力。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Salubrinal對OA小鼠內側脛骨平臺軟骨損傷的改善作用 番紅O組織學染色結果顯示，與Sham組相比，OA組小鼠內側脛骨平臺軟骨表面不連續(xù)，軟骨層著色變淺，大量基質丟失，軟骨細胞數目減少，并有大量軟骨細胞出現肥大和凋亡，軟骨病變范圍＞50%，OARSI評分顯著升高（P＜0.05）；透明軟骨（HC）明顯變薄，鈣化軟骨增厚，CC/TAC顯著增高（P＜0.05）。經Salubrinal治療后，OA+Sal組小鼠內側脛骨平臺軟骨表面連續(xù)，抑制了基質丟失，軟骨層著色得到改善，軟骨細胞肥大和凋亡明顯減少，軟骨病變范圍＜25%，OARSI評分顯著降低（P＜0.05）、CC/TAC得到恢復（P＜0.05）。見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of injury condition of medial tibial plateau cartilage between three groups表1 各組小鼠內側脛骨平臺軟骨損傷情況比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of injury condition of medial tibial plateau cartilage between three groups表1 各組小鼠內側脛骨平臺軟骨損傷情況比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F OARSI評分（分）0.80±0.13 11.35±1.46a 4.70±0.30ab 37.900＊CC/TAC（%）49.11±1.14 61.62±1.16a 48.19±1.17b 42.310＊

2.2 Salubrinal對OA小鼠外側脛骨平臺軟骨的保護作用 番紅O組織學染色結果顯示，與Sham組相比，OA組小鼠外側脛骨平臺軟骨有輕微纖維化表現，染色變淺，軟骨病變范圍為10%～25%，OARSI評分顯著升高（P＜0.05）；鈣化軟骨增厚，CC/TAC明顯增高（P＜0.05）。經Salubrinal治療后，OA+Sal組小鼠外側脛骨平臺軟骨細胞恢復正常，表面完整、無纖維化表現，OARSI評分顯著降低（P＜0.05），CC/TAC也得到糾正（P＜0.05）。見圖2、表2。

Fig.1 Morphological examination of the medial tibial plateau cartilage with Safranine O staining（× 400）圖1 脛骨平臺內側軟骨組織形態(tài)學結果（番紅O染色，×400）

Fig.2 Morphological examination of the lateral tibial plateau cartilage with Safranine O staining（× 400）圖2 脛骨平臺外側軟骨組織形態(tài)學結果（番紅O染色，×400）

Tab.2 Comparison of injury condition of lateral tibial plateau cartilage between three groups表2 各組小鼠外側脛骨平臺軟骨損傷情況比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of injury condition of lateral tibial plateau cartilage between three groups表2 各組小鼠外側脛骨平臺軟骨損傷情況比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F OARSI評分（分）0.60±0.16 3.50±0.58a 1.20±0.11ab 18.610＊CC/TAC（%）41.44±2.29 49.75±2.12a 41.68±1.86b 5.086＊

2.3 Salubrinal對OA小鼠內側脛骨平臺軟骨下骨異常骨重建的糾正作用 TRAP組織學染色結果顯示，與Sham組相比，OA組小鼠內側脛骨平臺向遠側端塌陷，軟骨下骨B.Ar/T.Ar明顯增加，TRAP陽性細胞比例（Oc.S/BS）顯著增高（P＜0.05）。經Salubrinal治療后，OA+Sal組小鼠內側脛骨平臺無塌陷，軟骨下骨B.Ar/T.Ar明顯恢復（P＜0.05），TRAP陽性細胞減少，Oc.S/BS顯著降低（P＜0.05）。SBP厚度各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

Tab.3 Comparison of the pathological changes in medial tibial plateau subchondral bone between three groups表3 各組小鼠內側脛骨平臺軟骨下骨病理改變情況比較（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of the pathological changes in medial tibial plateau subchondral bone between three groups表3 各組小鼠內側脛骨平臺軟骨下骨病理改變情況比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F B.Ar/T.Ar（%）58.08±1.24 66.95±1.59a 60.16±1.89b 8.023＊SBP厚度（μm）50.80±3.64 57.26±5.14 45.09±2.56 2.277 Oc.S/BS（%）5.12±0.55 9.66±1.10a 3.63±0.89b 11.310＊

2.4 Salubrinal對OA小鼠外側脛骨平臺軟骨下骨異常骨吸收的抑制作用 TRAP組織學染色結果顯示，與Sham組相比，OA組小鼠外側脛骨平臺軟骨下骨未出現塌陷，但骨小梁變細且出現橫向走行，B.Ar/T.Ar和SBP厚度明顯降低（P＜0.05），Oc.S/BS顯著增加（P＜0.05）。經Salubrinal治療后，OA+Sal組小鼠外側脛骨平臺軟骨下骨小梁恢復正常，B.Ar/T.Ar和SBP明顯恢復（P＜0.05），TRAP陽性細胞減少，Oc.S/BS顯著降低（P＜0.05）。見表4、圖4。

Fig.3 Morphological observation of the medial tibial plateau subchondral bone with TRAP staining（× 200）圖3 脛骨平臺內側軟骨下骨組織形態(tài)學結果（TRAP染色，×200）

Tab.4 Comparion of the pathological changes in lateral tibial plateau subchondral bone between three groups表4 各組小鼠外側脛骨平臺軟骨下骨病理改變情況比較（n=10，±s）

Tab.4 Comparion of the pathological changes in lateral tibial plateau subchondral bone between three groups表4 各組小鼠外側脛骨平臺軟骨下骨病理改變情況比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F B.Ar/T.Ar（%）49.02±1.64 43.55±2.33a 50.01±1.91b 5.930＊SBP厚度（μm）54.85±3.40 21.47±1.25a 44.69±3.12ab 38.360＊Oc.S/BS（%）4.73±0.77 10.95±1.02a 6.44±1.31b 7.834＊

2.5 OA小鼠內側脛骨平臺的病理改變較外側嚴重 在OA小鼠的內外側脛骨平臺中均發(fā)生了軟骨下骨重建和軟骨損傷。與Sham組相比，OA小鼠OARSI評分和B.Ar/T.Ar在內側脛骨平臺的倍數變化明顯高于外側脛骨平臺（P＜0.05）。與OA組相比，OA+Sal組小鼠內外側脛骨平臺OARSI評分的倍數變化差異無統計學意義（P＞0.05），而B.Ar/T.Ar在內側脛骨平臺的倍數變化明顯低于外側脛骨平臺（P＜0.05）。見表5。

Tab.5 Comparison of the cartilage and subchondral bone fold changes between medial and lateral tibial plateau表5 內外側脛骨平臺軟骨、軟骨下骨的倍數變化比較（n=10，±s）

Tab.5 Comparison of the cartilage and subchondral bone fold changes between medial and lateral tibial plateau表5 內外側脛骨平臺軟骨、軟骨下骨的倍數變化比較（n=10，±s）

＊P＜0.05

組別內側脛骨平臺外側脛骨平臺t OA組/Sham組倍數變化OARSI評分14.19±1.83 5.83±0.97 4.033＊B.Ar/T.Ar 1.15±0.03 0.89±0.02 7.938＊OA+Sal組/OA組倍數變化OARSI評分0.41±0.03 0.34±0.03 1.631 B.Ar/T.Ar 0.89±0.03 1.14±0.04 5.142＊

2.6 Salubrinal對OA破骨細胞過度分化的抑制作用 骨髓來源細胞實驗結果顯示，與Sham組比較，OA組破骨細胞發(fā)育迅速，大的融合細胞顯著增多，定量分析融合破骨細胞所覆蓋的區(qū)域顯示Oc.Ar明顯增大（P＜0.05）；破骨細胞的遷移和黏附細胞數量也顯著增加（P＜0.05）。經Salubrinal治療后，OA+Sal組有效抑制了破骨細胞的發(fā)育，減緩了破骨細胞的融合，Oc.Ar明顯減?。≒＜0.05），破骨細胞的遷移和黏附細胞數量也顯著降低（P＜0.05），見表6、圖5。

Tab.6 Comparion of formation,migration and adhesion of osteoclasts between three groups表6 各組小鼠破骨細胞形成、遷移、黏附能力的比較（n=10，±s）

Tab.6 Comparion of formation,migration and adhesion of osteoclasts between three groups表6 各組小鼠破骨細胞形成、遷移、黏附能力的比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Sham組OA組OA+Sal組F Oc.Ar（%）28.58±1.38 62.43±2.52a 45.60±1.24ab 94.84＊遷移細胞數（個）266.10±7.30 335.40±9.48a 245.60±7.61b 32.51＊黏附細胞數（個）114.10±10.11 435.90±24.08a 63.60±4.62ab 76.15＊

3 討論

3.1 破骨細胞活性升高導致的骨重建在OA發(fā)生發(fā)展中有重要作用 很多研究認為，軟骨下骨和間充質干細胞中破骨細胞活性增加導致的骨重建在骨關節(jié)炎軟骨退變的起始和進展中有關鍵作用［16-18］。本研究結果顯示，在手術切除膝關節(jié)內側半月板誘發(fā)的OA小鼠模型中，軟骨下骨中破骨細胞活性明顯增高，骨髓來源的破骨細胞的發(fā)育顯著加快，內側脛骨平臺軟骨下骨B.Ar/T.Ar增高，與此相對應的外側脛骨平臺出現了SBP變薄，B.Ar/T.Ar降低，內外側脛骨平臺軟骨下骨出現異常骨重建，OARSI評分、CC/TAC增高，關節(jié)軟骨受到了明顯的損傷。Salubrinal明顯降低了軟骨下骨中Oc.S/BS和骨髓來源的破骨細胞的形成、遷移、黏附能力，降低了內側脛骨平臺B.Ar/T.Ar，增加了外側脛骨平臺SBP厚度和B.Ar/T.Ar，明顯抑制了脛骨平臺軟骨下骨的骨重建，OARSI評分和CC/TAC也明顯恢復。結果表明，OA中破骨細胞異?；钴S，導致了異常骨重建的發(fā)生，并加速了關節(jié)軟骨的病變。Salubrinal可明顯抑制破骨細胞的異?；钴S，通過抑制破骨細胞發(fā)育來調節(jié)軟骨下骨異常骨重建，保持軟骨下骨的骨形態(tài)，從而延緩了OA關節(jié)軟骨的病變。

Fig.4 Morphological observation of the lateral tibial plateau subchondral bone with TRAP staining（× 200）圖4 脛骨平臺外側軟骨下骨組織形態(tài)學結果（TRAP染色，×200）

Fig.5 Pictures showing formation,migration and adhesion of osteoclasts（× 200）圖5 破骨細胞的形成、遷移、黏附功能（×200）

3.2 OA脛骨平臺內外側軟骨下骨出現了不均勻沉降 張英澤院士提出膝關節(jié)的脛骨平臺是負重面最大的關節(jié)，由于內側無骨性阻擋，且外側有腓骨支撐，負重點向內側偏移，因此內外側平臺發(fā)生不均勻沉降［8］。本研究選取冠狀位切片，分別觀測OA模型小鼠內外側脛骨平臺的病理改變及治療效果。相比矢狀位切片觀測結果更加完善，可以在同一截面對脛骨平臺內外側進行比較分析，更好地觀察分析脛骨平臺內外側不均勻沉降現象，避免了只能觀測一側的局限性。研究中發(fā)現，OA小鼠的內外側脛骨平臺軟骨下骨發(fā)生了不同變化。與Sham組相比，OA小鼠的內側脛骨平臺B.Ar/T.Ar明顯增加，而外側B.Ar/T.Ar和SBP均明顯降低。內外側脛骨平臺軟骨、軟骨下骨的倍數變化分析顯示，OA組內側OARSI評分和B.Ar/T.Ar的倍數變化明顯大于外側。筆者分析是由于關節(jié)內側半月板切除，穩(wěn)定性失衡，負重點向內側偏移，內側負荷異常增加而外側脛骨平臺出現了失重，導致的不均勻沉降現象。

3.3 Salubrinal改善OA不均勻沉降 張院士通過腓骨近端截骨手術降低脛骨平臺外側高度，減輕膝關節(jié)內側關節(jié)面的生物應力，防止脛骨平臺繼續(xù)發(fā)生不均勻沉降［8］。本研究采用Salubrinal對OA小鼠進行治療。Salubrinal降低了內側脛骨平臺B.Ar/T.Ar，抑制了平臺向遠側端的塌陷，增加了外側脛骨平臺SBP厚度和B.Ar/T.Ar，顯著糾正了OA小鼠內外側脛骨平臺的不均勻病變，明顯抑制了軟骨下骨的異常骨重建，改善了OA小鼠膝關節(jié)的不均勻沉降。使用Salubrinal治療OA避免了手術風險，為其他原因導致的不能手術治療的患者提供了治療的可能。本實驗采用OA小鼠模型進行了研究，接下來還需進一步的臨床實驗進行驗證。

綜上所述，在OA動物模型中Salubrinal抑制了OA中破骨細胞的異常發(fā)育，調節(jié)了內外側脛骨平臺軟骨下骨的不均衡改變，抑制了異常骨重建和不均勻沉降。本研究為治療OA提供了新思路，通過調控破骨細胞發(fā)育、改善異常骨重建和不均勻沉降有望成為治療OA的新方法。

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