李月穎 李菁 劉長寧

摘 要 從全基因組水平研究蒺藜苜蓿SBP-box轉(zhuǎn)錄因子基因家族，系統(tǒng)地鑒定出22個SBP-box家族基因，根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分析、結(jié)構(gòu)域的差異和系統(tǒng)發(fā)育分析將這些SBP-box基因分成5個亞家族.基因比較分析表明SBP-box基因家族擴(kuò)張主要是通過部分復(fù)制及串聯(lián)重復(fù)事件來實(shí)現(xiàn)的.基因表達(dá)模式分析表明蒺藜苜蓿SBP-box基因具有器官特異性并且參與干旱脅迫反應(yīng).這些結(jié)果為進(jìn)一步研究蒺藜苜蓿SBP-box 家族基因的功能與進(jìn)化提供理論參考.

關(guān)鍵詞 SBP-box轉(zhuǎn)錄因子；進(jìn)化分析；基因表達(dá)模式；蒺藜苜蓿

中圖分類號 Q349+.13文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1000-2537（2017）06-0024-10

Abstract This study conducted a genome-wide investigation of the SBP-box gene family in Medicago truncatula. A total of 22 SBP-box genes were systematically identified from Medicago truncatula and classified into 5 subfamilies according to the gene structure analysis， motif analysis and phylogeny relationship. Further genome comparison analysis revealed that segmental duplication and tandem duplication were two important ways for SBP-box genes to extend in the Medicago truncatula genome. Results from expression profile analysis revealed that SBP-box genes have the organ-specificity and were involved in drought stress responses. The data presented here should provide a theoretical foundation for verifying the function and evolution of SBP-box genes in Medicago truncatula.

Key words SBP-box transcription factors； phylogeny analysis； gene expression patterns； Medicago truncatula

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors）也稱反式作用因子，是指能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白.它們通過彼此之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用，參與決定基因在何種組織與何種發(fā)育階段開始轉(zhuǎn)錄，或者參與基因應(yīng)答外界環(huán)境因素所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄，在調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)病原微生物和響應(yīng)外界環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用[1].SBP-box基因家族編碼的SBP轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子.這些基因都有編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守核苷酸序列，又稱為SBP盒（SBP-box）基因.SBP-box基因首先是在金魚草（Antirrhinum majus）中識別并結(jié)合MADS-box基因SQUAMOSA啟動子的一個體外實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)而得到確認(rèn)的[2].自此之后，SBP-box基因在擬南芥、玉米、白樺等植物中相繼被分離出來[3-5]，并且對其功能進(jìn)行了很多研究.

Birkenbihl等[6]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了16個SBP-box基因，將它們命名為SPL1-SPL16.這些基因編碼的蛋白質(zhì)能夠特異結(jié)合在AP1基因（SQUAMOSA在擬南芥中的同源基因）的啟動子區(qū)段.SPL3和SPL8在擬南芥中能夠分別影響植株的成花轉(zhuǎn)變和花粉囊的發(fā)育[7]；SPL5和SPL15兩個基因能夠控制擬南芥的生殖生長；SPL14是該基因家族中序列最長的基因之一，近來被認(rèn)為參與受到真菌毒素FB1誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡的過程[8]；AtSPL2在擬南芥AtJMT超量表達(dá)植株中響應(yīng)茉莉酸甲酯介導(dǎo)的抗病途徑[9].玉米中LIGULELESS1（LG1）基因缺失突變體的葉耳和葉舌不能形成[4].Wang等[10]發(fā)現(xiàn)在TGA1基因的啟動子和編碼序列中幾個核苷酸的改變與玉米花序結(jié)構(gòu)有關(guān). 2015年Tan等和2016年Song等的研究也分別表明白菜和菊花中的SBP基因具有響應(yīng)激素處理及非生物脅迫的功能[11-12].

SBP蛋白雖然在一級結(jié)構(gòu)上很多樣化，但是它們都有一個高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（全稱DBD），該區(qū)域有約76個氨基酸殘基長，即SBP結(jié)構(gòu)域.這一結(jié)構(gòu)域包括兩個典型的C3H和C2HC型的鋅指結(jié)構(gòu)（Zn-finger structure）[13]和C末端的一段高度保守的雙向核定位信號（Nuclear Localization Signal，NLS）[6].Zn2+和核定位信號在蛋白與DNA結(jié)合過程中是必需的，C端的NLS與C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)序列部分重疊，具有引導(dǎo)SBP-box基因進(jìn)入細(xì)胞核從而對其下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的功能.另外，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的SBP基因中，有一部分還擁有高度保守的miR156/miR157識別位點(diǎn)[14].

豆科（Leguminosae）是種子植物第三大科，是人類及動物獲取食物和營養(yǎng)來源的重要科屬之一[15].蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬一年生植物，由于其具有生育期短、二倍體、自花授粉、基因組較小且遺傳轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)被作為豆科基因組學(xué)和生物學(xué)的模式植物進(jìn)行研究[16].蒺藜苜蓿全基因組測序已經(jīng)完成，使得利用生物信息學(xué)手段研究該物種基因家族系統(tǒng)演化及功能成為可能.截至目前，在全基因組水平對蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的研究尚未見報道.本研究利用生物信息學(xué)手段，從全基因組水平篩選和鑒定蒺藜苜蓿SBP-box基因，并利用生物信息及系統(tǒng)發(fā)育分析方法進(jìn)行比較基因組學(xué)研究，以探究蒺藜苜蓿SBP-box基因家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)及保守基序的差異和變化以及基因家族的復(fù)制特點(diǎn)；同時基于對基因家族的進(jìn)化分析，結(jié)合表達(dá)譜的數(shù)據(jù)對蒺藜苜蓿SBP-box家族基因功能進(jìn)行深入研究，以期闡明蒺藜苜蓿SBP-box家族基因在生長、發(fā)育及防御等方面的生物學(xué)功能，從而為豆科基因資源的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)豆科經(jīng)濟(jì)作物中重要基因的克隆及功能研究并為豆科育種的快速發(fā)展和其他遺傳研究提供現(xiàn)實(shí)可行的依據(jù).

1 材料方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究蒺藜苜蓿蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，編碼序列數(shù)據(jù)以及全基因組數(shù)據(jù)下載于JCVI數(shù)據(jù)庫（Mtruncatula_198；http：//ftp.jpi-psf.org/pub/compgen/phytozome/v9.0/Mtruncatula）[17]；擬南芥SBP-box家族蛋白序列和基因序列下載于擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫（TAIR 9.0，http：//www.arabidopsis.org/）[18]；蒺藜苜?；蛐酒磉_(dá)數(shù)據(jù)來自諾貝爾基金會蒺藜苜蓿基因表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫（http：//mtgea.noble.org/v3/）[19-20].

1.2 蒺藜苜蓿SBP-box家族成員鑒定

擬南芥的SBP-box家族成員共17個蛋白序列作為query sequence執(zhí)行本地BLASTP[21]（e-value設(shè)置為1×10-5）搜索蒺藜苜蓿的蛋白序列；同時在Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）中下載了SBP-box結(jié)構(gòu)域的HMM文件（PF03110），利用HMMER （v3.1b2，http：//hmmer. org）構(gòu)建隱馬爾科夫模型（Hidden Markov Model，HMM，）在蒺藜苜蓿蛋白數(shù)據(jù)庫搜索含有SBP-box結(jié)構(gòu)域的候選序列（E-value設(shè)為1）.將第一步和第二步的結(jié)果合并并且去冗余，去冗余后假定的蒺藜苜蓿的蛋白序列放到SMART[22]（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI Conserved Domains[23]（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）在線工具中進(jìn)一步檢查是否具有SBP結(jié)構(gòu)域，手工去除冗余和不完整讀碼框的序列，最終得到蒺藜苜蓿的SBP-box基因.利用 ExPASy Proteomics Server[24]（http：//prosite.expasy.org/）對所有蒺藜苜蓿SBP-box蛋白氨基酸序列進(jìn)行相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)預(yù)測.利用softberry （http：// linux1.softberry.com/berry.phtml）中的The ProtComp 9.0 進(jìn)行SBP-box蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測.

1.3 SBP家族系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用ClustalX （v2.1）[25]對擬南芥和蒺藜苜蓿SBP蛋白進(jìn)行多序列聯(lián)配比對分析，比對結(jié)果使用 MEGA[26]（v6.0）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.發(fā)育樹構(gòu)建采用鄰接法（The Neighbour Joining，NJ），檢驗(yàn)參數(shù)Boot-strapping重復(fù)1 000次.

1.4 蒺藜苜蓿SBP-box基因結(jié)構(gòu)分析以及SBP-box蛋白保守功能基序預(yù)測

利用在線工具 Gene Structure Display Server（GSDS； v2.0； http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）[27]分析SBP-box家族基因結(jié)構(gòu).在線工具M(jìn)otif Elicitation tool（MEME； v4.11.2； http：//meme-suite.org/tools/meme）[28]可以很好地分析基因的基序.本研究將蒺藜苜蓿SBP-box蛋白序列提交到MEME網(wǎng)站預(yù)測SBP-box基因的基序.預(yù)測基序的數(shù)量為10；基序的長度為20～200；基序重復(fù)的數(shù)量為“any”.

1.5 蒺藜苜蓿SBP-box家族染色體定位及復(fù)制分析

利用Phytozome植物全基因組數(shù)據(jù)庫（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）[29]確定SBP-box基因在染色體上的位置，并使用MapInspect工具（http：//www.plantbreeding.wur.nl/uk/software_mapinspect.html）標(biāo)出每個蒺藜苜蓿SBP-box基因在染色體組上的位置，從而得到每個SBP-box基因在基因組中的分布情況.利用MCScanx[30]進(jìn)行基因家族的復(fù)制分析.判定基因復(fù)制事件的條件基于植物基因組復(fù)制數(shù)據(jù)庫（the Plant Genome Duplication Database）[31]的鑒定方法即基因重復(fù)事件必須同時滿足以下條件[32]：（1）兩個基因序列相互匹配部分的長度大于較長序列長度的80%；（2）兩個基因序列相互匹配部分的相似性大于80%；（3）緊密相連的基因中，只參與一次復(fù)制事件.同時結(jié)合基因在染色體上的位置，判斷發(fā)生了串聯(lián)復(fù)制還是片段復(fù)制.

1.6 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族表達(dá)模式分析

根據(jù)蒺藜苜蓿SBP-box基因?qū)?yīng)的CDS序列，在蒺藜苜?；蛐酒脚_BLAST搜索其對應(yīng)的探針，探針的表達(dá)量數(shù)據(jù)包括蒺藜苜蓿的根部（root）、葉柄（petiole）、芽（bud）、莖（stem）、花（flower）、果莢（pod）、種子（seed）的不同發(fā)育階段，以及根和莖中SBP-box基因在干旱脅迫下的表達(dá)量.通過R軟件對SBP-box基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行正則化并運(yùn)用Pheatmap程序包對正則化的蒺藜苜蓿SBP-box基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿SBP-box 基因家族的鑒定以及蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

為了鑒定蒺藜苜蓿SBP-box基因家族，同時使用BLASTP以及HMM搜索蒺藜苜蓿中的蛋白序列來找出包含SBP-box結(jié)構(gòu)域的蛋白.為了進(jìn)一步確定結(jié)果的可靠性，使用SMART和NCBI Conserved Domains檢驗(yàn)SBP-box結(jié)構(gòu)域的存在，刪除不具有SBP-box保守結(jié)構(gòu)域的序列.最后在蒺藜苜蓿中共鑒定出23個SBP-box蛋白，這些蛋白隸屬22個基因，使用物種名的縮寫作為前綴，給每一個SBP-box蛋白命名.系統(tǒng)性地評估了這些SBP-box蛋白的基本性質(zhì)，包括預(yù)測蛋白質(zhì)的長度、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)以及亞細(xì)胞定位.這些SBP-box蛋白序列的長度為144到1 026個氨基酸殘基；利用在線工具ExPASy對蒺藜苜蓿SBP-box蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)系數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，23個SBP-box中07D（MtSBP3）相對分子質(zhì)量最大，為112 971；最小的61D（MtSBP5）為16 950；這些基因的理論等電點(diǎn)變異相對較小，從5.4（MtSBP2B）到9.2（MtSBP6）不等；利用在線工具softberry進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測與它的轉(zhuǎn)錄因子家族的角色相對應(yīng)，有13個SBP-box定位到細(xì)胞核上（表 1）.

2.2 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的進(jìn)化分析

為了解蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用蒺藜苜蓿SBP-box蛋白保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，包括22個蒺藜苜蓿SBP-box蛋白以及17個擬南芥SBP-box蛋白，系統(tǒng)進(jìn)化分析將這些SBP-box蛋白分為5個亞家族，命名為A，B，C，D以及E（圖 1）.5個亞家族又可以分為兩類，相較于亞家族A，B，C和E，亞家族D的蛋白包含了相對較長的氨基酸序列，這說明這兩類之間可能存在一些功能差異性.亞家族 D包含4個蒺藜苜蓿SBP-box蛋白以及4個擬南芥的SBP-box蛋白，其中AtSPL14以及AtSPL16分別為SPL1-Related2 protein （SPL1R2）以及SPL1-Related3 protein（SPL1R3），所以與AtSPL1具有更近的親緣關(guān)系.亞家族A，B，C和E包含19個蒺藜苜蓿SBP-box蛋白以及13個擬南芥SBP-box蛋白，亞家族A，B及C均同時含有蒺藜苜蓿和擬南芥的SBP-box蛋白，亞家族E只含有3個擬南芥的SBP-box蛋白.

2.3 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族基因結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)保守基序分析

內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子類型與數(shù)量是一個基因家族典型的進(jìn)化印跡.進(jìn)一步探究蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的22條序列以及擬南芥中SBP-box基因家族17條序列的基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)進(jìn)化樹同一分枝的基因結(jié)構(gòu)比較相似而不同分枝之間的基因結(jié)構(gòu)有所差異.蒺藜苜蓿SBP-box轉(zhuǎn)錄因子基因家族的內(nèi)含子數(shù)目為1～10不等（圖 2）.通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在蒺藜苜蓿中，有4個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有1個內(nèi)含子（比例18.1%）；5個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有2個內(nèi)含子（比例22.7%）；7個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有3個內(nèi)含子（比例31.8%）；2個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有4個內(nèi)含子（比例9.09%）；還有4個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有8個以上的內(nèi)含子（比例18.1%）.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，亞家族D的蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員內(nèi)含子數(shù)目大于亞家族A，B，C及E分支，且外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相似，基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，MtSBP4含有8個內(nèi)含子，其余基因含有9個內(nèi)含子.相反的，A，B，C及E亞家族含有較少的內(nèi)含子，除了AtSPL7含有9個內(nèi)含子外，其余的基因僅有1～4個內(nèi)含子.使用MEME分析工具對所有的蒺藜苜蓿SBP-box蛋白序列進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示10個保守功能基序都具有統(tǒng)計顯著性，每個保守基序的e-value都小于1e-300（圖3）.蒺藜苜蓿SBP-box基因保守基序的預(yù)測大部分支持SBP-box轉(zhuǎn)錄因子基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析的分類.這些保守基序的序列特征以及氨基酸長度如圖3所示.其中motif2，motif1以及motif4是存在于所有蒺藜苜蓿SBP-box蛋白N端的保守SBP結(jié)構(gòu)域，蒺藜苜蓿的每個亞家族中都有一些基序具有亞家族特異性.motif3，motif7，motif8，motif10，motif5，motif9以及motif6是亞家族D中特有的基序，亞家族D中的蒺藜苜蓿SBP-box蛋白與AtSPL14（SPL1-Related2 protein （SPL1R2）），AtSPL1及AtSPL12比較相似，AtSPL16缺少motif7.與基因結(jié)構(gòu)相對應(yīng)，A，B，C和E亞家族含有比較統(tǒng)一且簡單的蛋白保守基序.亞家族特有的基序可能在亞家族的功能特異性中具有重要作用.

2.4 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族在染色體上的分布與重復(fù)

為了探究蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的擴(kuò)增和進(jìn)化可能的機(jī)制，本研究對蒺藜苜蓿SBP-box基因進(jìn)行染色體定位分析，通過提取蒺藜苜蓿SBP-box基因的染色體定位信息，得到23個SBP-box基因在蒺藜苜蓿染色體上的定位圖（圖4）.23個SBP-box基因不均勻地分布在7條染色體上，每條染色體分布有1～6個SBP-box基因，其中：8號染色體最多，為6個基因；其次是2號和7號染色體，均為4個基因；5號染色體最少，只有1個基因.使用MapInspect軟件繪制蒺藜苜蓿SBP-box基因在染色體上的分布，同時檢驗(yàn)SBP-box基因家族的復(fù)制事件，蒺藜苜蓿SBP-box基因轉(zhuǎn)錄因子家族的片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)的基因?qū)Ψ謩e使用細(xì)線以及黃棕色方框進(jìn)行標(biāo)示.利用染色體片段、基因組重復(fù)區(qū)信息，共發(fā)現(xiàn)21對發(fā)生片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)的同源基因（圖4），它們的序列同源性較高，其中19對重復(fù)基因?qū)Πl(fā)生片段重復(fù)（占所有復(fù)制基因?qū)Φ?0.5%），發(fā)生片段復(fù)制的基因?qū)Ψ植加诔齺喖易錏之外的系統(tǒng)發(fā)育分枝的各個亞家族（包括A—D），它們的分布有一定的分支偏好性.大約63.2%（19對片段復(fù)制基因中的12對）分布在相同的系統(tǒng)發(fā)育亞家族中，這可能是由蒺藜苜蓿基因組的多倍化過程導(dǎo)致；另外兩對基因MtSBP20/MtSBP21和MtSBP21/MtSBP22發(fā)生了串聯(lián)復(fù)制，且這兩對基因均位于亞家族B，串聯(lián)重復(fù)的基因?qū)哂泻芨叩男蛄邢嗨菩?，往往高?0%.

2.5 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的表達(dá)分析

本研究收集了蒺藜苜蓿不同組織器官（結(jié)節(jié)、根、莖、葉、花和豆莢以及種子的不同發(fā)育階段）的表達(dá)數(shù)據(jù).然后使用層次聚類來表現(xiàn)豆科4個物種中的SBP-box基因在不同組織器官的表達(dá)模式.如圖5（彩圖見封三）所示，對于蒺藜苜蓿SBP-box基因，它們被聚類為低表達(dá)量（MtSBP17，MtSBP13，MtSBP12以及MtSBP21）、表達(dá)量有變化（MtSBP8，MtSBP9，MtSBP14，MtSBP2B和MtSBP16）以及高表達(dá)量（MtSBP19，MtSBP1，MtSBP2A，MtSBP3和MtSBP4）3種模式，不同組織器官表達(dá)量的分析表明大部分蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員的表達(dá)不具有組織特異性，在包括組織器官的生長發(fā)育以及種子的生長發(fā)育中都發(fā)揮重要的作用；但部分基因具有組織特異性如MtSBP19在種子發(fā)育的不同階段表達(dá)量差異很大，MtSBP2B/MtSBP14在豆莢中表達(dá)量較高，而MtSBP16在根中表達(dá)量較高.結(jié)合基因復(fù)制的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生片段復(fù)制的基因?qū)?，它們傾向于表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式.在蒺藜苜蓿中總共有19個發(fā)生片段復(fù)制的基因?qū)?，本研究收集?對的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中6對表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式聚類，例如MtSBP9/MtSBP13與MtSBP17/MtSBP19，所有這些結(jié)果表明片段復(fù)制的基因參與了植物生長發(fā)育的不同過程.同時本研究分析了在干旱脅迫2，3，4，7，10以及14 d豆科SBP-box基因在根和莖中的的表達(dá)量變化，通過繪制熱圖發(fā)現(xiàn)，莖中MtSBP9對干旱有顯著響應(yīng).根中MtSBP2B以及MtSBP16對干旱也有顯著響應(yīng)，表明多個SBP-box基因參與了逆境脅迫應(yīng)答.

3 討論

SBP-box基因是在研究花形成路徑的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)的，因此被認(rèn)為和花的發(fā)育密切相關(guān)，在近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)SBP-box基因有著廣泛的生物學(xué)功能[33-34].隨著基因組測序的發(fā)展，SBP-box基因的功能在各種植物中被研究.然而，SBP-box基因在蒺藜苜蓿中的功能至今仍不清楚.本研究運(yùn)用生物信息學(xué)手段，采用結(jié)構(gòu)域搜索的方法，利用已知基因所編碼蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域?yàn)闄z索序列，對蒺藜苜蓿SBP-box基因家族全基因組進(jìn)行分析，共鑒定出22個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族基因，這些基因編碼的蛋白質(zhì)序列中均包含高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域.蒺藜苜蓿SBP-box家族成員多于在擬南芥和水稻基因組中鑒定出的17和19個基因[35-36].

通過序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化方法，確定了蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的分類和進(jìn)化關(guān)系.根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹將SBP-box基因家族分成了5個亞家族.通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得出， SBP-box基因在進(jìn)化上表現(xiàn)出差異性，暗示其基因功能的多樣性；同時每一亞家族的基因間保守性基序的結(jié)構(gòu)和順序相似，表明同一亞家族中的基因可能具有類似的功能.外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明，處在相同亞家族內(nèi)的蒺藜苜蓿SBP-box基因大部分具有相同的外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu).SBP-box結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化可能與基因結(jié)構(gòu)的多樣化有關(guān).蒺藜苜蓿中所有的SBP蛋白都具有完整且高度保守的SBP區(qū)（即兩個鋅指結(jié)構(gòu)和一個雙向核定位信號）；在擬南芥及蒺藜苜蓿中序列較長的SBP蛋白，尤其是超過1 000個氨基酸殘基的SBP蛋白，除了保守的SBP結(jié)構(gòu)域還含有一些其他的區(qū)域，如亞家族D中的家族成員，這些區(qū)域可以促進(jìn)SBP蛋白進(jìn)入核內(nèi)，進(jìn)一步通過翻譯后修飾而被調(diào)控，從而影響它進(jìn)入核的水平和與DNA結(jié)合的水平[6]，進(jìn)一步影響基因在不同生物過程的表達(dá)水平.同源性分析是一種相對快速有效了解基因結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化的方法[37].因此，蒺藜苜蓿SBP基因的功能可以通過與研究相對通透的模式植物擬南芥進(jìn)行同源性分析而推測得到.分布在同一亞家族的蒺藜苜蓿以及擬南芥SBP-box基因家族成員可能具有相同的功能.但這些基因的功能需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證.

基因復(fù)制對基因家族的進(jìn)化具有重要的意義，主要是因?yàn)榛驈?fù)制可為新基因的產(chǎn)生提供最原始的材料，而新基因的產(chǎn)生則促使其產(chǎn)生新的功能[38].植物基因的復(fù)制主要有3種方式：片段復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制、轉(zhuǎn)座事件如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座和重復(fù)轉(zhuǎn)錄等.片段復(fù)制是最主要的方式，因?yàn)榇蟛糠种参锝?jīng)歷了染色體加倍過程，并在基因組中保留了大量重復(fù)的染色體片段[39].本研究分析發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿的SBP-box基因家族主要是通過片段復(fù)制進(jìn)行擴(kuò)張.之前的研究表明SPL4/SPL5，SPL9/SPL15以及SPL1/SPL12很可能是通過基因組水平重復(fù)而產(chǎn)生[40]，在本研究中，它們分別分布于亞家族E，C以及D；同時SPL4/SPL5，SPL9/SPL15很可能于蕓薹屬（Brassica）植物分化之前就已經(jīng)存在，所以本研究推測亞家族E和C中的蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員存在較早；擬南芥中SPL10/SPL11具有相同的基因結(jié)構(gòu)，且序列高度相似（82.1%），在染色體上彼此相鄰，它們可能是通過串聯(lián)重復(fù)機(jī)制產(chǎn)生，對應(yīng)的蒺藜苜蓿中發(fā)生串聯(lián)復(fù)制的SBP-box家族成員MtSBP20/MtSBP21以及MtSBP21/MtSBP22也分布在亞家族B中，且具有較高的同源性.擬南芥中SPL01/SPL12，AtSPL14（SPL1-Related2 protein （SPL1R2）），AtSPL16（SPL1-Related3 protein （SPL1R3））和蒺藜苜蓿中的4個家族成員MtSBP1，MtSBP2A，MtSBP3以及MtSBP4構(gòu)成了亞家族D，這個家族的基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜并且含有除了SBP保守結(jié)構(gòu)域之外的其他的保守基序，這可能為這一家族適應(yīng)新的功能和進(jìn)化提供了條件.

本研究利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行組織特異性表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿基因組中重復(fù)的基因發(fā)生了功能分歧.本研究收集到7對發(fā)生片段復(fù)制的蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中6對表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式聚類，所有這些結(jié)果表明片段復(fù)制的基因參與了植物生長發(fā)育的不同過程.亞家族D中發(fā)生復(fù)制的基因?qū)tSBP1/MtSBP2A具有共同的表達(dá)模式，這種表達(dá)模式可能意味著其中一個基因的表達(dá)已經(jīng)不占主導(dǎo)地位，或者是生物界常見的冗余現(xiàn)象.也有復(fù)制基因?qū)哂胁煌谋磉_(dá)模式，如位于亞家族A中的MtSBP13以及亞家族B中的MtSBP14，可能意味著基因家族成員正在不斷分化.

本研究揭示了蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的起源、擴(kuò)增與進(jìn)化及可能的功能分化，為后續(xù)深入探究蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的生物學(xué)功能提供了理論參考，并為豆科育種和其他遺傳研究提供相關(guān)依據(jù).相信隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的積累，對于蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的了解將會越來越全面和深入.

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