李沫 沈陸 漆正楠 唐子圣 秦勝營(yíng)

摘 要 為確定6名中國(guó)慢性牙周炎患者齦下菌斑的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，將擴(kuò)增的菌斑中的細(xì)菌16S rDNA序列克隆到大腸桿菌.測(cè)序后對(duì)323條可鑒定的克隆序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)齦下細(xì)菌群落主要由6種細(xì)菌門(mén)類(lèi)組成，而細(xì)菌屬類(lèi)的分布差異較大.這為提高慢性牙周炎發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)、提供更多的有效預(yù)防和治療措施提供參考.

關(guān)鍵詞 中國(guó)人群；牙周疾?。宦匝乐苎?；牙菌斑；16S rDNA

中圖分類(lèi)號(hào) Q939.93文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1000-2537（2017）06-0040-04

Abstract The purpose of this study was to determine the bacterial composition of human subgingival plaque in 6 Chinese chronic periodontitis patients and provide related bacterial distribution information. Amplified bacterial 16S rDNA sequences are cloned into Escherichia coli. After sequencing， 323 identified cloned sequences are analyzed， the subgingival microbial community mainly consisted of 6 bacterial phyla. However the proportions of bacterial genera in the subgingival plaque samples are different. This study provides the basis for raising awareness of the pathogenesis of chronic periodontitis and providing more effective prevention and treatment.

Key words Chinese； periodontal disease； chronic periodontitis； dental plaque； 16S Ribosomal DNA

牙周炎是牙周組織的一種慢性感染性疾病，是口腔兩大類(lèi)主要疾病之一，在國(guó)內(nèi)外均有較高的患病率.目前大量研究顯示宿主對(duì)微生物不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)是造成牙周組織破壞的主要原因.然而，由細(xì)菌感染引起的慢性牙周炎的詳細(xì)病理機(jī)制仍然不完全清楚[1].研究顯示一些革蘭氏陰性細(xì)菌類(lèi)群在牙周疾病中發(fā)揮著重要的作用[2]，微生物群落結(jié)構(gòu)可能與牙周疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[3].因此，準(zhǔn)確了解病原體微生物和宿主之間的相互作用關(guān)系首先需要了解牙周微生物群落信息[4].

盡管人類(lèi)頻繁接觸不同種類(lèi)細(xì)菌以及個(gè)體間潛在的傳播，但每個(gè)人往往保持自己的牙周菌群結(jié)構(gòu)，這表明牙周菌群個(gè)體差異可能受到遺傳或環(huán)境因素的影響[5].有研究證實(shí)有些牙周疾病的發(fā)生在不同種族成員之間存在顯著差異[6].然而，也許是由于這些研究中使用的樣品數(shù)量有限，菌群的組成在個(gè)體、種族、群體的差異仍然不是完全清楚，特別是很少有研究提供有關(guān)中國(guó)慢性牙周炎患者的口腔菌群結(jié)構(gòu)信息，而這對(duì)研究者認(rèn)識(shí)牙周病發(fā)病機(jī)制很重要[3].

1 材料和方法

1.1 慢性牙周炎患者的收集及選擇標(biāo)準(zhǔn)

選擇6例慢性牙周炎患者，均就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海第九人民醫(yī)院口腔內(nèi)科，都是中國(guó)人血統(tǒng)，其中3名29～67歲女性患者，3名32～60歲男性患者.所有患者都簽訂書(shū)面知情同意書(shū)，并通過(guò)了上海第九人民醫(yī)院的倫理委員會(huì)審核.

1.2 樣品的采集與DNA的提取

分別在每位患者4個(gè)象限口選擇4顆最深的牙周炎牙齒為樣品，用氣吹槍保持牙齒面干燥.清除掉牙齒表面的菌斑后，使用齦下刮治器獲得齦下菌斑，然后把6個(gè)患者的樣品分別放入裝有1 mL PBS的1.5 mL離心EP管.10 000 r/min離心，去除上清液，-20 ℃保存.

使用Zoetendal[7]建立的“洗滌，凍融，珠打漿機(jī)，苯酚-氯仿” 方法提取DNA.取1 μL DNA溶液用0.8%瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)DNA的純度和完整性，剩余DNA溶液在-20 ℃冷凍保存.

1.3 PCR 擴(kuò)增16S rDNA片段，并克隆

使用一對(duì)通用引物[8]在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增.PCR反應(yīng)在ABI 9700熱循環(huán)儀中進(jìn)行.使用1U 的LA Taq聚合酶（Takara）（50 μL終體積）在熱啟動(dòng)說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)下，將樣品在95 ℃下預(yù)熱8 min，隨后在以下條件下擴(kuò)增：變性95 ℃ 45 s，退火60 ℃ 45 s，延伸1.5 min.共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，隨后在72 ℃延伸10 min.PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，DNA用溴化乙錠染色并在短波紫外線燈下觀察.

使用TOPOTA克隆試劑盒（英杰公司）參照說(shuō)明完成PCR擴(kuò)增后DNA序列的克隆.將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板到含有卡那霉素的Luria-瓊脂培養(yǎng)基平板上并在37 ℃保溫過(guò)夜.單菌落轉(zhuǎn)到含40 μL 10 mmol/L Tris的1.5 mL離心管中.取1 μL作為模板，鑒定在PCR中是否插入正確的M13正向引物和反向引物.隨后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠的電泳檢測(cè)插入片段的大小.

1.4 16S rDNA測(cè)序與序列分析

使用ABI 3730 DNA測(cè)序儀、ABI循環(huán)測(cè)序試劑盒（Perkin-Elmer公司的測(cè)序試劑盒和羅氏診斷公司的Taq DNA聚合酶）對(duì)16S rDNA進(jìn)行測(cè)序.正向測(cè)序引物序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物序列為GGTTACCTTGTTACGACTT.使用ABI 9700熱循環(huán)儀94 ℃變性10 s，58 ℃退火并延伸4 min，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)反應(yīng).

為鑒定種屬關(guān)系，將插入物的序列與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（RDP）[9]和GenBank中的公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較.登錄設(shè)置數(shù)據(jù)錄入、編輯、序列比對(duì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)比較，相似矩陣生成使用DNAMAN軟件進(jìn)行（版本7.0）.使用Jukes和Cantor[10]的方法，對(duì)單一位置的多個(gè)堿基變化的相似矩陣進(jìn)行了修正.

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性牙周炎患者牙菌斑細(xì)菌中門(mén)類(lèi)的多樣性分析

6名慢性牙周炎患者牙菌斑細(xì)菌中分別克隆出50，39，76，56，71和44條序列，其中可鑒定序列323條.筆者發(fā)現(xiàn)患者牙菌斑細(xì)菌群落中最普遍的門(mén)類(lèi)是：厚壁菌門(mén)（51.42%）、擬桿菌門(mén)（34.07%）、放線菌門(mén)（10.41%）、螺旋體門(mén)（2.21%）、變形菌（1.26%）和互養(yǎng)菌門(mén)（0.63%），如圖1（彩圖見(jiàn)封三）所示.雖然筆者在6名患者中總共鑒定出6種門(mén)類(lèi)的細(xì)菌，但并不是所有患者都含有這6種門(mén)類(lèi)細(xì)菌.有的門(mén)類(lèi)只在個(gè)別患者中出現(xiàn)，比如：變形菌門(mén)只存在于A患者，互養(yǎng)菌門(mén)只在B和E患者中被發(fā)現(xiàn).

每名慢性牙周炎患者齦下菌斑樣中擬桿菌和厚壁菌門(mén)高比例分布，如表1所示.雖然每名患者牙菌斑細(xì)菌中都有較高比例的厚壁菌門(mén)，但也存在顯著差異，其中E患者所占比率最高（73.2%）， A患者所占比率 （72%），B患者所占比率最低（28.2%）.有意思的是C患者在76個(gè)克隆鑒定出3種門(mén)類(lèi)細(xì)菌，而B(niǎo)患者在39個(gè)克隆鑒定出5種門(mén)類(lèi)細(xì)菌.這可能是取樣偏差造成的，也可能說(shuō)明菌群數(shù)量并不代表菌群的多樣性.

2.2 慢性牙周炎患者牙菌斑細(xì)菌中屬類(lèi)的多樣性分析

如圖2（彩圖見(jiàn)封三）所示，在屬的水平上，6名慢性牙周炎患者中觀察到高比例的放線菌門(mén)的放線菌屬，擬桿菌門(mén)的卟啉單胞菌屬、普氏菌屬，厚壁菌門(mén)的鏈球菌和月形單胞菌屬，為細(xì)菌總數(shù)量的80%以上，但不同患者之間細(xì)菌屬類(lèi)的分布比例存在較大的差異.另外，有些細(xì)菌屬類(lèi)在某個(gè)患者的牙菌斑中是獨(dú)有的.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)323條可鑒定的克隆序列進(jìn)行分析，比較16S rDNA的數(shù)據(jù)庫(kù)和雙端測(cè)序結(jié)果，以超過(guò)98%的相似性作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明了慢性牙周炎患者的齦下菌斑中藏著一個(gè)高度多樣化的細(xì)菌群落.在此之前，許多研究已經(jīng)揭示牙周病的細(xì)菌微生物群落在不同地域人群中存在差異[11].然而，在中國(guó)人群中，很少有類(lèi)似對(duì)中國(guó)牙周炎患者的研究報(bào)道.以往在中國(guó)牙周炎人群中的研究只關(guān)注一些特定的細(xì)菌菌株[12-13]，而本文則提供目前能確定的所有細(xì)菌門(mén)、屬信息，并分析中國(guó)慢性牙周炎患者齦下菌斑的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu).

Abusleme 等人對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行454-焦磷酸測(cè)序，報(bào)道了牙周炎群體分布較高比例的螺旋體門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和綠彎菌門(mén)細(xì)菌；而健康人攜帶較高比例的放線菌門(mén)特別是放線菌屬，且均高于22名慢性牙周炎患者[14].而Adriana等用焦磷酸測(cè)序檢查8名慢性牙周炎患者的16S rDNA基因文庫(kù)[15]，在慢性牙周炎患者中找到的細(xì)菌主要門(mén)類(lèi)為厚壁菌門(mén)（59%）、擬桿菌門(mén)（14%）和放線菌門(mén)（10%）.此外，通過(guò)Ion Torrent 16S rDNA基因擴(kuò)增子測(cè)序，Junemann等人發(fā)現(xiàn)，在4份慢性牙周炎樣品中最普遍的細(xì)菌門(mén)類(lèi)為：擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭菌屬門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、螺旋體門(mén)和互養(yǎng)菌門(mén)[16].通過(guò)與上述研究相比較，筆者發(fā)現(xiàn)不同的人群慢性牙周炎患者的齦下菌斑所帶細(xì)菌在門(mén)類(lèi)水平高度一致，然而門(mén)類(lèi)水平的分布比例則差異較大.

Silva-Boghossian等人發(fā)現(xiàn)156 名慢性牙周炎患者所帶韋永氏球菌屬、侵肺類(lèi)小桿菌屬、福賽斯坦納菌屬和普氏菌屬細(xì)菌的數(shù)量顯著高于急性牙周炎患者，且在慢性牙周炎患者中還觀察到高水平的放線菌、鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌[17].另一項(xiàng)研究使用二代測(cè)序平臺(tái)Miseq進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析表明，健康者與牙周炎組相比所帶細(xì)菌有39個(gè)菌屬顯著不同，而且患者組所帶菌屬和本研究結(jié)果幾乎完全吻合[18].近期有項(xiàng)研究將慢性牙周炎患者按照探針出血指數(shù)分成兩組，發(fā)現(xiàn)在分值較低組（均值≤50%）患者牙齦檢出更多的韋永氏球菌、噬碳酸菌和TM7等，而分值較高組（均值>50%）患者牙齦下含有更多的真細(xì)菌、產(chǎn)線菌 、鏈球菌、福賽斯坦納菌和密螺旋體屬，幾乎所有的菌類(lèi)在本研究的樣品中也可觀察到[19].這些結(jié)果揭示了在慢性牙周炎患者中存在一些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬類(lèi)，而且某些細(xì)菌屬類(lèi)的高比例分布可能與患者的嚴(yán)重程度相關(guān).

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，每個(gè)患者所帶細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)可能在門(mén)類(lèi)水平保持一致，但在屬類(lèi)的水平上存在較大差異.本研究報(bào)道了中國(guó)6個(gè)慢性牙周炎患者齦下細(xì)菌群落的詳細(xì)信息，對(duì)鑒定出的門(mén)類(lèi)和屬的比例進(jìn)行了分析.有研究表明齦下微生物的動(dòng)態(tài)變化可導(dǎo)致牙周炎，并建議臨床監(jiān)測(cè)齦下微生物作為疾病診斷和預(yù)后指標(biāo)[20].但本研究樣本量小，如果能招募更多的中國(guó)慢性牙周炎患者和健康對(duì)照受試者，將使我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)慢性牙周炎和細(xì)菌群落之間的關(guān)系，推進(jìn)對(duì)中國(guó)慢性牙周炎患者的臨床治療.

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