席奇亮，楊鐵釗，周方，劉超，葉紅朝，邢雪霞，趙科，孔德輝

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 鄭州 450002;2 河南省洛陽市煙草公司 洛陽 471000

施用氮肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要措施，施氮方式對植株干物質(zhì)積累和氮素吸收影響顯著。長期不合理施用氮肥導(dǎo)致土壤酸化、板結(jié)、環(huán)境惡劣[1]，造成植株氮素利用率較低。有研究表明，我國部分地區(qū)作物氮素利用率僅有20%～30%[2]，因此，氮肥的合理精準(zhǔn)施用，是促進(jìn)作物氮素吸收與干物質(zhì)積累，實現(xiàn)氮素營養(yǎng)高效利用的有效措施[3]。水肥一體化技術(shù)實現(xiàn)了水肥同步管理和水肥高效利用[4]，滴灌施肥作為一種最有效的水肥一體方式，具有節(jié)水、節(jié)肥、增效、省工的優(yōu)點，在作物生產(chǎn)上已得到了廣泛利用，并取得了很好的效果。侯振安等[5]研究了膜下滴灌水氮耦合對棉花干物質(zhì)積累和氮素吸收規(guī)律的影響，表明膜下滴灌能有效增加花鈴期根冠生物量、氮素吸收量、吐絮期地部上干物質(zhì)量和氮素積累量，使氮素的利用效率提高了30.51%。謝志良等[6]和祁通等[7]的研究也有類似的結(jié)果。杜少平等[8]研究表明采用滴灌施肥能提高甜瓜的干物質(zhì)積累量使甜瓜增產(chǎn)7.40%～14.35%，水、氮利用率分別提高28.81%～40.65%和22.78%～77.22%。

氮代謝是植物最基本的生理代謝過程之一，與碳代謝等協(xié)調(diào)統(tǒng)一共同成為植物生命活動的基本過程，硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）被認(rèn)為是高等植物氮代謝的關(guān)鍵酶類[9]，這些酶活性的強弱直接影響到植物對氮素的吸收，進(jìn)而影響肥料的利用率和干物質(zhì)積累量。岳紅賓[10]比較了不同氮素水平下烤煙碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著氮素水平的提高，煙葉硝酸還原酶活性呈上升趨勢。羅莎莎等[11]研究了氮肥基施與追施比例對烤煙光合特性及氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響，結(jié)果表明硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性基本隨著氮肥追施比例的增大而增加。

目前，水肥一體化技術(shù)在烤煙種植方面的應(yīng)用方興未艾，有關(guān)其對烤煙干物質(zhì)積累和氮素吸收以及氮代謝關(guān)鍵酶活性影響的研究尚不多見。本文以滴灌施肥對烤煙生長發(fā)育的影響為切入點，比較常規(guī)施肥和滴灌施肥對烤煙干物質(zhì)積累和氮素吸收的影響，測定了烤煙氮代謝2個關(guān)鍵酶活性及其相關(guān)基因的相對表達(dá)量，以期從生理和分子的角度闡釋水肥一體化條件下烤煙氮素營養(yǎng)高效利用的機理，為該項技術(shù)制定施肥方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)基本情況

試驗于2015—2016年進(jìn)行2年的田間試驗，于2017年進(jìn)行盆栽試驗，均安排在河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊科教園區(qū)進(jìn)行，當(dāng)?shù)睾０?4 m，北緯N34°51′56.34″，東經(jīng)E113°35′5.70″，位于華北平原南部，屬北溫帶大陸季風(fēng)性氣候。試驗地為偏砂質(zhì)潮土，前茬作物為烤煙，土壤有機質(zhì)含量 10.2 g·kg-1，全氮含量為 0.93 g·kg-1，速效磷含量為 11.2 mg·kg-1，速效鉀含量 157.6 mg·kg-1。

1.2 試驗材料與設(shè)計

田間試驗和盆栽實驗均設(shè)置3個處理， 即空白對照處理（用CK表示）、常規(guī)栽培處理（用FP表示）和水肥一體化處理（用DF表示）。供試烤煙品種為‘豫煙6號’，2015年于3月12日播種育苗，5月9日移栽；2016年于3月1日播種育苗，5月5日移栽；2017年于3月10日播種育苗，5月12日移栽。田間試驗各處理小區(qū)面積均為667 m2，行株距為1.1 m×0.55 m，另設(shè)保護(hù)行，每個小區(qū)種植1000株，每個處理重復(fù)3次；盆栽試驗用土取自田間試驗地土壤，風(fēng)干后過40目篩子，用盆高30 cm，直徑35 cm，每盆裝土20 kg，每個處理種10盆，周圍擺放保護(hù)盆，以消除邊行優(yōu)勢。田間試驗和盆栽試驗各處理除施肥方案不同外，其他栽培措施按優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。

田間試驗3個處理具體施肥方案如下：CK處理不施用任何化肥，作為空白對照。FP處理在大田起壟時條施芝麻餅肥 225 kg/hm2、煙草專用復(fù)合肥（15-15-15）150 kg/hm2和有機無機一體肥（13-5-17）150 kg/hm2作基肥，硝酸鉀（14-0-46）用量75 kg/hm2作為追肥在團(tuán)棵期一次穴施，煙株全生育期總施氮量為52.5 kg/hm2。DF處理在大田起壟時條施芝麻餅肥225 kg/hm2做基肥，所有化肥作追肥通過水肥一體化滴灌系統(tǒng)根據(jù)煙株需肥需水規(guī)律施入，追肥采用本課題組研制的煙草專用液體套餐肥，其中包括煙草專用還苗生根肥（20-10-10）共75 kg/hm2，分別在煙株移栽時和移栽后20 d施入；旺長肥（25-15-10）共150 kg/hm2，分別在移栽后30 d和40 d施入；成熟落黃肥（0-0-40）共150 kg/hm2，分別在移栽后50 d和60 d施入，煙株全生育期施入氮磷鉀總量與常規(guī)栽培處理保持一致。盆栽試驗施肥方案與田間試驗基本相同，所施肥料用量和灌水量均按照田間試驗用量進(jìn)行換算，保持一致。全生育期灌水量CK和FP處理與DF處理保持一致，其中CK和FP處理灌溉方式為漫灌，全生育期共進(jìn)行3次灌溉，每次灌水定額為450 m3/hm2；DF處理灌溉方式為滴灌，全生育期共進(jìn)行9次灌溉（其中6次與施肥同時進(jìn)行），每次灌水定額為150 m3/hm2。

試驗水源由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)水井提供，施肥灌溉首部系統(tǒng)采用移動式施肥灌溉一體機（由汽油機水泵、過濾器、施肥桶、空氣閥等部件構(gòu)成），管網(wǎng)系統(tǒng)由主管道（PE材質(zhì)，直徑63 mm）連接貼片式滴管帶（PE材質(zhì)，直徑16 mm，滴頭間距30 cm，滴頭流量2.5～3 L/h）組成。

1.3 樣品采集和測定項目

1.3.1 煙株樣品采集

田間試驗選取煙株移栽后20 d、30 d、40 d、50 d、60 d、70 d、80 d、90 d、100 d、110 d、120 d 的煙株，每個處理分別挖取長勢一致的煙株3株，在105℃下殺青20 min，65℃烘干至恒重，稱重后粉碎，計算3株煙干重的平均值，用于分析氮素和干物質(zhì)的積累。

盆栽實驗選定各處理具有代表性的煙株，分別在移栽后20 d、40 d、60 d、80 d、100 d時取第13、14葉位葉片，樣品遮光并用干冰保存運送到實驗室進(jìn)行RNA 提取和氮素代謝相關(guān)酶活性的測定。另選取具有代表性煙株若干，分別在其還苗期、伸根期、旺長期和成熟期，完整挖取其根部，每個處理3株，用清水輕輕沖洗去根上的土壤，再裝入60目尼龍網(wǎng)袋中用清水洗凈，用吸水紙吸取根系表面水分，分別測定根體積，計算其平均值，并留取少量用于測定根系活力。

1.3.2 測定項目

1.3.2.1 煙株總氮的測定及氮素效益的計算

總氮測定采用半微量凱氏定氮法。氮肥表觀利用率用差值法[12]計算，氮肥表觀利用率=（施氮區(qū)吸氮量-空白對照吸氮量）/施氮量×100%；土壤氮素依存率=空白對照吸氮量/施氮區(qū)吸氮量×100%；氮肥偏生產(chǎn)力（kg·kg-1）=施氮區(qū)產(chǎn)量/施氮量。

1.3.2.2 煙株根系活力和根體積的測定

根體積的測定采用排水法；根系活力的測定采用TTC還原法[13]。

1.3.2.3 葉片總RNA的提取

使用RNAiso Reagent 試劑盒（TaKaRa公司）提取參試材料葉片的總RNA。將提取的RNA溶于適量的DEPC水中，采用紫外分光光度計分別測定OD260 nm和OD280 nm并計算二者比值，以判斷提取RNA的純度和濃度；然后進(jìn)行2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3.2.4 熒光定量PCR

以 煙 草Actin基 因（Genebank Accession No. AB158612）為內(nèi)參，引物序列為Actin-F:5’-GCTGTTTTTCCTAGTATTGTTGGTC-3’，Actin-R: 5’-AATACCTGTTGTACGGCCACTG-3’；編 碼 G S酶 的 G S基 因（G e n e b a n k Accession No. X95933.1） 引 物 為F:5`-C A G C A AT C T C C G C A AT C C-3`，R:5`-CGAGCCTATCCCGACAAA-3`； 編 碼NR酶的NITR基 因（GenBank Accession No.X14058.1）引 物 為 F: 5`-ATCCAGTTATCAGCGGTA-3`，R:5`-GGCAGTTCAGTCACATAGA-3`。

熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為 20 μL：10 μLSYBR Green qPCR Mix，0.4 μL Forward Primer（10 μmol/L），0.4 μL Reverse Primer（10 μmol/L），0.4 μLROX，1 μLcDNA，7.8 μL水；PCR擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸45 s，共循環(huán)40次，分離后4℃保存。

1.3.2.5 氮素代謝相關(guān)酶活性測定

按照O’Neal等[14]的方法測定粗酶提取液中GS的活性； 采用活體法[15]測定NR活性。

1.3.3 經(jīng)濟(jì)效益計算

按處理統(tǒng)計其產(chǎn)量，根據(jù)烤煙42級國標(biāo)（GB2635-92）[16]對烤后煙葉分級，確定烤煙的產(chǎn)值、均價和上等煙比例。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行整理，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和曲線擬合，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，顯著性分析水平為0.05，采用Sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行圖表繪制。采用Prizm 4統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行熒光定量PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用2T-△△C的方法對基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對煙株干物質(zhì)積累特性的影響

由圖1A可以看出，煙株干物質(zhì)積累規(guī)律呈“S”型曲線變化，處理間變化趨勢一致，DF處理的煙株干物質(zhì)積累總量要顯著高于FP和CK處理。在移栽30 d之前，處理間干物質(zhì)積累量差異不顯著，從移栽30～40 d，CK處理與其他處理表現(xiàn)出顯著差異，移栽40 d后，處理間表現(xiàn)顯著差異，且始終表現(xiàn)為DF＞FP＞CK。這說明水肥一體化處理可以顯著增加大田煙株干物質(zhì)積累量。

根據(jù)不同處理煙株干物質(zhì)積累變化規(guī)律曲線（圖1A），利用方程y=exp(a+b/x)對曲線進(jìn)行擬合，其中，y 為干物質(zhì)積累量（ g·株-1），x為移栽后天數(shù)（d），a、b為待定參數(shù)?；貧w方程經(jīng)F測驗得到的P值均小于0.0001，達(dá)極顯著水平，即擬合方程具有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步求時間的二階導(dǎo)數(shù)可計算出各處理最大積累速率及其對應(yīng)時間，如表1所示。

由各處理煙株干物質(zhì)積累速率變化規(guī)律（圖1B）可以看出，各處理間變化趨勢一致，不同時期的干物質(zhì)積累速率均表現(xiàn)為DF＞FP＞CK。從表1可以看出，DF處理最大積累速率最高，為9.19 g·株-1·d-1，分別是FP和CK處理的1.64倍和3.18倍，且DF處理最大積累速率出現(xiàn)最早，為42.43 d，分別較FP和CK處理提前了5.46 d和9.02 d。這說明水肥一體化處理不僅可以提高煙株最大干物質(zhì)積累速率，還可以促使煙株的最大干物質(zhì)積累時間提前。

圖1 不同處理煙株干物質(zhì)積累量和積累速率的變化規(guī)律（2年田間試驗均值）Fig.1 The change regulation of dry matter accumulation and

2.2 不同處理對煙株氮素吸收特性的影響

各處理煙株氮素積累量的變化規(guī)律（圖2A）與干物質(zhì)積累量的變化規(guī)律一致，均呈現(xiàn)出“S”型變化趨勢。從總體來看，處理間氮素積累總量表現(xiàn)為DF>FP>CK，差異顯著。從不同時期的氮素積累量（圖2B）來看，煙株移栽20～30 d氮素積累量較少，此期間內(nèi)各處理氮素積累量分別為總氮素積累量 的 3.24%、4.21%、12.77%； 移 栽 30～40 d，CK和FP處理氮素積累量發(fā)生明顯變化，分別占總氮素積累量的6.99%、15.86%，DF處理此期間內(nèi)積累量繼續(xù)增加，但增加幅度較小，積累量占總氮素積累量的14.53%；移栽40～70 d煙株進(jìn)入旺長期，各處理氮素開始大量積累，積累量分別占總氮素積累量的60.28%、46.56%、55.68%；移栽70 d后氮素積累速率逐漸下降，直到90 d后氮素積累趨近于停止，此期間內(nèi)各處理氮素積累量分別占總氮素積累量的14.86%、19.04%、4.79%。這說明水肥一體化處理通過精準(zhǔn)施肥和后期氮素調(diào)虧能促使煙株前期大量高效的吸收氮素，減少生育后期氮素攝入，促使煙葉成熟落黃。

圖2 不同處理煙株氮素積累變化規(guī)律和不同生育期積累量的比較（2年田間試驗均值）Fig.2 Comparison of the change regulation of N accumulation and variation of different growth stages in different treatments (Mean of two years for field experiment)

2.3 不同處理對煙株肥料氮素利用率的影響

從表2可以看出，CK處理由于氮素供應(yīng)不足，煙株生長發(fā)育不良，其產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價和上等煙比例均為各處理表現(xiàn)最差，DF處理表現(xiàn)最好，其產(chǎn)量為3287.25 kg·hm-2，較FP處理增產(chǎn)了13.23%；產(chǎn)值為76428.6元·hm-2，較FP處理增加了29.56%；均價和上等煙比例分別為23.09元和32.20%，較FP處理分別提高了11.65%和30.36%?？梢?，采用水肥一體化技術(shù)能明顯增加烤后煙葉的產(chǎn)值，而煙葉品質(zhì)提高對產(chǎn)值增加的貢獻(xiàn)要大于產(chǎn)量提高。

煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量受氮素供應(yīng)情況的影響較明顯。從表3可以看出，各處理煙株全生育期總吸氮量存在顯著差異，表現(xiàn)為DF>FP>CK。DF處理較FP處理的總吸氮量增加了14.98%，氮肥表觀利用率提高了93.21%，較高的氮素吸收量和表觀利用率也為煙株產(chǎn)量和質(zhì)量的提升打下了基礎(chǔ)。土壤氮素依存率和氮素偏生產(chǎn)力可以綜合反映煙株對施入氮素的利用情況，與煙株氮肥表觀利用率有直接的關(guān)系。由于DF處理煙株氮肥表觀利用率較高，其土壤氮素依存率較FP處理降低了15.01%，氮肥偏生產(chǎn)力提高了15.24%。

表2 不同處理經(jīng)濟(jì)效益的比較（2年田間試驗均值）Tab.2 Comparison of economic benefits in different treatments (Mean of two years for field experiment)

表3 不同處理氮素效益的比較（2年田間試驗均值）Tab.3 Comparison of nitrogen benefit in different treatments (Mean of two years for field experiment)

2.4 不同處理對煙株根系生長發(fā)育的影響

2017年對各處理不同生育期煙株根系活力的測定結(jié)果（圖3A）表明，各處理變化趨勢一致，均為隨著生育期的變化，根系活力先增高后降低，且在旺長期達(dá)到最大，DF處理的煙株在旺長期的根系活力達(dá)到 700.01 μg·g-1·h-1，分別是 FP 處理和 CK 處理的1.92倍和1.18倍。就3個處理在不同生育期根系活力的差異水平而言，還苗期差異不明顯，伸根期和旺長期差異達(dá)到顯著水平，成熟期DF處理和FP處理差異不顯著，但顯著高于CK處理；總體來說，3個處理煙株的根系活力表現(xiàn)為DF>FP>CK。

對比各處理煙株成熟期的根體積（圖3B）可以看出，各處理不同生育期煙株根體積存在著明顯的差異。還苗期3個處理差異不顯著，伸根期DF處理要顯著高于CK處理和FP處理，而CK處理和FP處理差異不顯著，旺長期3個處理煙株根體積明顯增加，分別是前一時期的4.76倍、6.32倍、5.22倍，DF處理和FP處理差異不顯著，但顯著高于CK處理，進(jìn)入成熟期各處理煙株根體積進(jìn)一步增加，DF處理和FP處理增加幅度較大，分別較前一時期提高了59.22%和62.13%，CK處理增加幅度較小，較前一時期提高了27.27%。這說明水肥一體化處理能促進(jìn)煙株根系生長發(fā)育，提高根系活力。

2.5 不同處理對烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性及其相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

由圖4A和圖4B可以看出，GS活性和GS基因相對表達(dá)量隨生育時期變化的規(guī)律不一致，但是2個處理之間差異不明顯。NR是一種誘導(dǎo)酶，同時作為NO3-同化過程中第一個關(guān)鍵酶，對作物氮素代謝有著重要的影響。NR同時也是氮代謝的第一個限速酶，受施肥等栽培措施和光照等環(huán)境條件的影響較大。由圖4C可以看出，2個處理NR活性變化規(guī)律相似，均表現(xiàn)為隨著生育期的推遲逐漸下降。DF處理的NR活性在移栽后20 d和40 d時均明顯高于FP處理，分別是其1.26倍和1.31倍。在移栽后60 d時，2個處理的NR活性均出現(xiàn)不同程度的下降，DF處理的NR活性較40 d時下降了28.68%，F(xiàn)P處理的NR活性則下降了21.17%，此時DF處理的NR活性依然高于FP處理。在移栽后80 d，DF處理的NR活性出現(xiàn)了較大幅度的下降，較60 d時下降了60.84%，而FP處理的NR活性僅下降了24.79%，此后FP處理的NR活性均要高于DF處理。比較2個處理編碼硝酸還原酶的NITR基因相對表達(dá)量（圖4D）可以看出，在移栽20 d和40 d時DF處理的NITR基因的相對表達(dá)量均要明顯高于FP處理，分別是其1.20倍和1.38倍。與NR活性變化規(guī)律不同的是，DF處理NITR基因相對表達(dá)量的大幅下降出現(xiàn)在移栽后60 d，較40 d時下降了54.76%，而同期FP處理NITR基因僅下降了24.43%，在移栽60 d后高于DF處理。

圖4 不同時期烤煙氮代謝關(guān)鍵酶的活性及其相關(guān)基因的相對表達(dá)量（盆栽實驗）Fig.4 The enzyme activity and relative expression of gene related to nitrogen metabolism at different stages（Pot experiment）

3 討論

3.1 對烤煙干物質(zhì)積累、氮素吸收以及肥料利用率的影響

關(guān)于煙草干物質(zhì)積累和氮素吸收規(guī)律的研究已有大量報道，主要集中在施氮量[17]、氮素形態(tài)[18]、肥料類型[19]等方面，對于水肥一體化對煙株干物質(zhì)積累和氮素吸收規(guī)律的影響卻鮮有報道。本研究結(jié)果表明，水肥一體化處理煙株的干物質(zhì)積累和氮素吸收規(guī)律與常規(guī)栽培處理相同，變化規(guī)律的曲線擬合結(jié)果均呈“S”型，這與李青軍等[20]的研究結(jié)果相一致。但在積累總量和積累速率方面卻表現(xiàn)出顯著差異，水肥一體化處理干物質(zhì)積累總量和氮素吸收總量顯著高于常規(guī)栽培處理，是其1.42倍和1.41倍，段錦波等[21]的研究也有相類似的結(jié)果，這與氮素利用率的提高有關(guān)。本試驗結(jié)果表明水肥一體化處理較常規(guī)栽培處理的氮肥表觀利用率提高了93.21%，氮肥偏生產(chǎn)力提高了15.24%，土壤氮素依存率下降了15.01%。已有研究表明，氮肥隨水滴施可有效地促進(jìn)植物對氮肥的吸收，因此氮素利用率的提高不僅在于肥料本身，更重要的還在于與水分的互作[22]，水肥一體化條件下實現(xiàn)了水肥的同步管理，通過滴灌管道按照煙株不同生育期的需水需肥規(guī)律精準(zhǔn)施肥，一方面適宜的水分供應(yīng)可以促進(jìn)肥料轉(zhuǎn)化及吸收，提高肥料利用率，而適宜的施肥也可以調(diào)節(jié)水分利用過程，提高水分利用率。同時，水肥一體化條件下施肥和灌水均遵循“少量多次”的原則，既能滿足煙株生長發(fā)育的需要，又避免了因肥料施用過量或者灌水過量而造成的揮發(fā)或淋溶等損失[23]，進(jìn)一步提高了氮素的利用率。

3.2 對烤煙根系生長發(fā)育的影響

根系是煙株重要的營養(yǎng)器官，與地上部分的生長關(guān)系密切，其活力的高低和體積的大小直接影響著地上部分的成長發(fā)育及形態(tài)建成，在一定程度上反映了作物吸收水分和礦質(zhì)養(yǎng)分的能力，直接影響著根系的生長發(fā)育狀況，對植物的生長起著決定性作用[24]。關(guān)于土壤水肥供應(yīng)狀況對根系生長發(fā)育的影響，前人在水稻[25]、大豆[26]、玉米[27]、棉花[28]等作物上已做了大量的研究，水肥一體化滴灌施肥較傳統(tǒng)漫灌或溝灌施肥能顯著改善根際土壤的水肥供應(yīng)狀況，促進(jìn)植物根系發(fā)育和養(yǎng)分吸收，對作物增產(chǎn)有著極其重要的作用，這與本研究的結(jié)果相一致。本研究表明，DF處理煙株的根系活力在旺長期達(dá)到 700.01μg·g-1·h-1，分別是FP處理和CK處理的1.18倍和1.92倍，DF處理煙株的根體積在成熟期達(dá)到330.2 cm3，分別是FP處理和CK處理的1.31倍和2.66倍。這可能是因為采用滴灌施肥使根際土壤的水分和養(yǎng)分狀況始終適于煙株生長的條件，有利于煙株根系活力增強，尤其是在生育中后期依然保持較高水平，同時，滴灌施肥可以使土壤通氣條件改善[29]，良好的水肥供應(yīng)條件可以刺激側(cè)根的發(fā)育和根毛的形成，使煙株根體積增加，對煙株根系形態(tài)的形成有著積極的作用，而常規(guī)栽培處理由于水分供應(yīng)不夠及時，煙株經(jīng)常處于水分供應(yīng)不充足的狀態(tài)下，影響根系的生長發(fā)育[30]，且在水分供應(yīng)不足的情況下，土壤中養(yǎng)分濃度增加，土壤水勢降低，進(jìn)一步加劇了水分脅迫，從而使根系從土壤中吸收水分和養(yǎng)分更加困難。

3.3 對烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性及其相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

大量研究表明， GS和NR是烤煙氮素代謝的關(guān)鍵酶，其活性的強弱直接影響到烤煙對氮素的吸收和利用，進(jìn)而影響煙株的干物質(zhì)積累[31]。GS催化產(chǎn)生谷氨酰胺，常與谷氨酸合酶協(xié)同作用，組成GS/GOGAT循環(huán)，這是高等植物NH4+同化的主要途徑[32]。植物中所需要的氮素主要來自土壤中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，但是植物吸收硝態(tài)氮后，必須經(jīng)過一系列還原變成NH4+后才能用于形成氨基酸和蛋白質(zhì)，而第一步還原反應(yīng)（NO3--NO2-）就需要NR催化，因此，NR是植物氮同化代謝中的第一個限速酶和調(diào)節(jié)酶，常被用來表示植物氮代謝的強度[33]。已有研究表明，NR酶活性受水肥供應(yīng)條件影響較大，韓錦峰等[34]指出干旱條件下NR活性顯著下降，適宜的水分供應(yīng)可以顯著提高其活性。耿素祥等[35]比較了烤煙在不同施氮量條件下的NR活性，認(rèn)為NR活性與施氮量呈正相關(guān)，在一定范圍內(nèi)隨著施氮量的增加而增加。本研究結(jié)果也表明，在水肥一體化條件下合理供應(yīng)煙株生長發(fā)育所需的水分和養(yǎng)分，能顯著提升NR活性和NITR基因的相對表達(dá)量，但對GS活性和GS基因相對表達(dá)量影響不大。隨著NR活性的提高，土壤中原有的以及施入肥料中所含的硝酸鹽被還原變成NH4+，進(jìn)而參與到氨基酸和蛋白質(zhì)合成中，提升

了煙株對土壤氮素的吸收利用能力，進(jìn)而提高了肥料的利用率。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，采用水肥一體化技術(shù)的煙株NR活性在移栽后40 d前后顯著高于常規(guī)栽培處理，而在移栽60 d前后出現(xiàn)了大幅下降，這說明水肥一體化處理煙株在前期大量同化硝酸鹽，增強了煙株的氮代謝過程，田間長勢較旺，這也解釋了水肥一體化處理最大干物質(zhì)積累速率和氮素吸收速率較常規(guī)栽培處理明顯提前的現(xiàn)象，而在移栽60 d后，煙株進(jìn)入成熟期，水肥一體化處理不再施入氮素，土壤中殘留氮素有限，NR活性開始急劇下降，煙株對硝酸鹽的同化能力減弱，從而促使煙株開始成熟，并且逐漸落黃。關(guān)于水肥一體化技術(shù)調(diào)控NR活性及NITR基因表達(dá)的機理，相關(guān)研究尚未涉及，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

水肥一體化實現(xiàn)了“以水促肥、以肥調(diào)水、水肥同步”，能夠顯著增強煙株前期的NR活性，促進(jìn)煙株對氮素的吸收，提高了肥料的利用率。連續(xù)2年的田間試驗和1年盆栽試驗結(jié)果表明，在氮磷鉀養(yǎng)分投入相同的情況下，水肥一體化處理煙株根系生長發(fā)育較好，根體積較大，根系活力明顯增強，煙株大田生長發(fā)育優(yōu)于常規(guī)栽培處理，煙葉產(chǎn)質(zhì)量明顯提升，氮肥表觀利用率提高了93.21%，干物質(zhì)和氮素積累量分別是常規(guī)栽培處理的1.42倍和1.41倍，且水肥一體化處理最大干物質(zhì)積累速率和最大氮素積累速率均較常規(guī)栽培處理顯著提高且提前出現(xiàn)，而在煙株進(jìn)入成熟期后氮素調(diào)虧，煙株NR活性迅速下降，氮素攝入量減少，從而促進(jìn)煙株成熟落黃，有利于烤后煙葉品質(zhì)的提升。總之，通過滴灌根據(jù)煙株的需水需肥規(guī)律進(jìn)行精準(zhǔn)施肥，調(diào)控?zé)熤甑母晌镔|(zhì)積累和氮素吸收，對氮素利用率和產(chǎn)質(zhì)量的提高能產(chǎn)生積極的影響。

[1]張本強, 馬興華, 王術(shù)科, 等. 施氮方式對烤煙氮素吸收積累及品質(zhì)的影響[J]. 中國煙草科學(xué), 2011, 32(5):56-62.ZHANG Benqiang, MA Xinghua, WANG Shuke, et al. Effects of nitrogen application regimes on nitrogen uptake, accumulation and quality of flue-cured Tobacco[J]. Chinese Tobacco Science, 2011,32(5): 56-62.

[2]張福鎖. 測土配方施肥技術(shù)要攬[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2006.ZHANG Fusuo. Technology of soil test for fertilizer application[M]. Beijing:China Agricultural University Press, 2006.

[3]李邵, 薛緒掌, 郭文善, 等. 水肥耦合對溫室盆栽黃瓜產(chǎn)量與水分利用效率的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2010, 16(2):376-381.LI Shao, XUE Xuzhang, GUO Wenshan, et al. Effects of water and fertilizer coupling on yield and water use efficiency in greenhouse potted cucumber[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2010,16(2): 376-381.

[4]趙吉紅. 水肥一體化技術(shù)應(yīng)用中存在的問題及解決對策[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2015.ZHAO Jihong. The problems and solutions in the adapation of fertigation technology[D]. Yangling:North West Agriculture and Forestry University, 2015.

[5]侯振安, 李品芳, 龔江, 等. 不同水肥一體化策略對棉花氮素吸收和氮肥利用率的影響[J].土壤學(xué)報, 2007, 44(4):702-708.HOU Zhenan, LI Pinfang, GONG Jiang, et al. Effects of fertigation strategy on nitrogen uptake by cotton and use efficiency of N fertilizer[J]. Acta Pedologica Sinica, 2007, 44(4): 702-708.

[6]謝志良, 田長彥. 膜下滴灌水氮耦合對棉花干物質(zhì)積累和氮素吸收及水氮利用效率的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2011,17(1):160-165.XIE Zhiliang, TIAN Changyan. Coupling effects of water and nitrogen on dry matter accumulation,nitrogen uptake and waternitrogen use efficiency of cotton under mulched drip irrigation[J].Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2011, 17(1): 160-165.

[7]祁通, 侯振安, 冶軍, 等. 施氮量和水肥一體化頻率對雜交棉氮素吸收和產(chǎn)量的影響[J].棉花學(xué)報, 2009, 21(5):378-382.QI Tong, HOU Zhenan, YE Jun, et al. Effects of nitrogen rate and fertigation frequency on nitrogen uptake and yield of hybrid cotton[J]. Cotton Science, 2009, 21(5): 378-382.

[8]杜少平, 馬忠明, 薛亮, 等. 適宜施氮量提高溫室砂田滴灌甜瓜產(chǎn)量品質(zhì)及水氮利用率[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2016, 32(5):112-119.DU Shaoping, MA Zhongming, XUE Liang, et al. Optimal drip fertigation amount improving muskmelon yield, quality and use efficiency of water and nitrogen in plastic greenhouse of gravel-mulched field[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(5):112－119.

[9]張麗瑩, 王榮蓮, 張俊生, 等. 水肥耦合對溫室無土栽培黃瓜氮代謝的影響[J].園藝學(xué)報, 2011, 38(5):893-902.ZHANG Liying, WANG Ronglian, ZHANG Junsheng, et al.Effects of Water and Fertilizer Coupling on Nitrogen Metabolism of Cucumber Under Soilless Culture in Greenhouse[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2011, 38(5): 893-902.

[10]岳紅賓. 不同氮素水平對煙草碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響[J].中國煙草科學(xué), 2007, 28(1):18-20, 24.YUE Hongbin. Effects of Various Nitrogen Levels on Key Enzymes Activeness of Flue-cured Tobacco Leaves in Carbon and Nitrogen Metabolism[J]. Chinese Tobacco Science, 2007, 28(1): 18-20, 24.

[11]羅莎莎, 符云鵬, 牛志強, 等. 氮肥基施與追施比例對烤煙光合特性及氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）, 2013, 41(8):42-48.LUO Shasha, FU Yunpeng, NIU Zhiqiang, et al. Effects of ratio between basal nitrogen and top-dressing on photosynthetic characteristics and activities of key enzymes involved in nitrogen metabolism[J]. Journal of Northwest A&F University(Natural Science Edition), 2013, 41(8): 42-48.

[12]趙軍, 竇玉青, 宋付朋, 等. 有機和無機煙草專用肥配合施用對煙草生產(chǎn)效益和肥料氮素利用率的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2014, 20(3):613-619.ZHAO Jun, DOU Yuqing, SONG Fupeng, et al. Effects of combined application of biological organic fertilizer and inorganic compound fertilizer on the tobacco profit and nitrogen use efficiency[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2014, 20(3):613-619.

[13]王群, 李潮海, 李全忠, 等. 緊實脅迫對不同類型土壤玉米根系時空分布及活力的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(10):2039-2050.WANG Qun, LI Chaohai, LI Quanzhong, et al. Effect of soil compaction on spatio-temporal distribution and activities in maize under different soil types[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2011,44(10): 2039-2050.

[14]O’Neal D, Joyk W. Glutamine synthetase of pea leaves.I. Purification, stabilization, and pH optima[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1973, 159: 113-122.

[15]鄒琦. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:56-129.ZOU Qi. The Guidance of Plant Physiology Experiment[M].Beijing: China Agriculture Press, 2000: 56-129.

[16]GB2635-92.烤煙[S].GB2635-92. Flue-cured tobacco[S].

[17]苑舉民, 張忠鋒, 石屹, 等. 低肥力土壤施氮對烤煙干物質(zhì)積累、氮素吸收及產(chǎn)質(zhì)量的影響[J].中國煙草科學(xué), 2009, 30(4):47-51,58.YUAN Jumin, ZHANG Zhongfeng, SHI Yi, et al. Effects of nitrogen application on dry matter accumulation, nitrogen uptake,yield, and quality of flue-cured tobacco in low fertilility soil[J].Chinese Tobacco Science, 2009, 30(4): 47-51, 58.

[18]化黨領(lǐng), 黃向東, 劉世亮, 等. 氮素形態(tài)和數(shù)量對烤煙干物質(zhì)積累及鉀含量與積累量的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005(5):49-52.HUA Dangling, HUANG Xiangdong, LIU Shiliang, et al. Effects of nitrogen form and concentration on flue-cured tobacco dry matter accumulation and potassium content and accumulation[J].Journal of Henan Agricultural Sciences, 2005(5): 49-52.

[19]劉國順, 朱凱, 武雪萍, 等. 施用有機酸和氨基酸對烤煙生長及氮素吸收的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報, 2004, 19(4):51-54.LIU Guoshun, ZHU Kai, WU Xueping, et al. Effects of using organic acids and amino acids on flue-cured tobacco growth and nitrogen absorption[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2004,19(4): 51-54.

[20]李青軍, 張炎, 胡偉, 等. 氮素運籌對玉米干物質(zhì)積累、氮素吸收分配及產(chǎn)量的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2011,17(3):755-760.LI Qingjun, ZHANG Yan, HU Wei, et al. Effects of nitrogen management on maize dry matter accumulation, nitrogen uptake and distribution and maize yield[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2011, 17(3): 755-760.

[21]段錦波, 翟勇, 柴穎, 等. 不同水肥一體化模式對棉花產(chǎn)量及養(yǎng)分吸收的影響[J].中國土壤與肥料, 2014(6):52-58.DUAN Jinbo, ZHAI Yong, CHAI Ying, et al. Effects of different fertigation methods on cotton yield and nutrient uptake[J]. Soils and Fertilizers Sciences in China, 2014, (6): 52-58.

[22]Mohammad M J. Squssh yield,nutrient content and soil fertility parameters in response to method of fertilizer application and rates of niungen fertigatien[J]. Nutrient Cycling in Agroecoeystems,2004, 68: 99～106.

[23]Zhou J B, Xi J G, Chen Z J, et al. Leaching and transformation of nitrogen fertilizers in soil after application of N with irrigation: A soft column method[J]. Pedosphere, 2006, 16(2): 245-252.

[24]孫譽育, 尹春英, 賀合亮, 等．紅樺幼苗根系對水、氮耦合效應(yīng)的生理響應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)報,2016, 36(21):6758-6765．SUN Yuyu, YIN Chunying, HE Heliang, et al. The physiological responses of betula albosinensis seedling roots to soilwater-nitrogen coupling[J]. Acta Ecologica Sinica, 2016, 36(21): 6758-6765．

[25]孫永健, 孫園園, 徐徽, 等. 水氮管理模式對不同氮效率水稻氮素利用特性及產(chǎn)量的影響[J].作物學(xué)報, 2014, 40(09):1639-1649.SUN Yongjian, SUN Yuanyuan, XU Hui, et al. Effects of waternitrogen management patterns on nitrogen utilization characteristics and yield in rice cultivars with different nitrogen use efficiencies[J].Acta Agronomica Sinica, 2014, 40(9): 1639-1649.

[26]張含彬, 任萬軍, 楊文鈺, 等. 不同施氮量對套作大豆根系形態(tài)與生理特性的影響[J].作物學(xué)報, 2007, 33(01):107-112.ZHANG Hanbin, REN Wanjun, YANG Wenyu, et al. Effects of different nitrogen levels on morphological and physiological characteristics of relay-planting soybean root[J]. Acta Agronomica Sinica, 2007, 33(01): 107-112.

[27]宋海星, 李生秀.水、氮供應(yīng)和土壤空間所引起的根系生理特性變化[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2004, 10(01):6-11.SONG Haixing, LI Shengxiu. Changes of root physiological characteristics resulting from supply of water,nitrogen and rootgrowing space in soil[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science,2004, 10(01): 6-11.

[28]劉瑞顯, 陳兵林, 王友華, 等. 氮素對花鈴期干旱再復(fù)水后棉花根系生長的影響[J].植物生態(tài)學(xué)報, 2009, 33(02):405-413.LIU Ruixian, CHEN Binglin, WANG Youhua, et al. Effects of nitrogen on cotton root growth under drought stress and after watering during flowering and boll-form-ing stages[J]. Journal of Plant Ecology(Chinese Version), 2009, 33(02): 405-413.

[29]徐芬芬, 曾曉春, 石慶華, 等. 不同灌溉方式對水稻根系生長的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究, 2007, 25(01):102-104.XU Fenfen, ZENG Xiaochun, SHI Qinghua, et al. Effects of different irrigation patterns on the growth of rice root[J].Agricultural Research in the Arid Areas, 2007, 25(01): 102-104.

[30]戢林, 楊歡, 李廷軒, 等. 氮高效利用基因型水稻干物質(zhì)生產(chǎn)和氮素積累特性[J].草業(yè)學(xué)報, 2014, 23(6):327-335.JI Lin, YANG Huan, LI Tingxuan, et al. Dry matter production and nitrogen accumulation of rice genotypes with different nitrogen use efficiencies[J].Acta Prataculturae Sinica, 2017, 23(6): 327-335.

[31]許東亞. 烤煙氮代謝動態(tài)調(diào)控及其對煙葉質(zhì)量的影響[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.XU Dongya. Dynamic regulation of nitrogen metabolism in Fluecured Tobacco and its effect on leaf quality[D]. Zhengzhou: Henan Agricultural University, 2016.

[32]武云杰, 李飛, 楊鐵釗, 等. 氮素營養(yǎng)水平對衰老期煙葉氮代謝的影響及品種間差異[J].中國煙草學(xué)報, 2014, 20(4):41-47.WU Yunjie, LI Fei, YANG Tiezhao, et al. Effect of nitrogen nutrition on nitrogen metabolism in ageing tobacco leaf and variation between varieties[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2014, 20(4):41-47.

[33]連培康, 許自成, 孟黎明, 等. 貴州烏蒙煙區(qū)不同海拔烤煙碳氮代謝的差異[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2016, 22(1):143-150.LIAN Peikang, XU Zicheng, MENG Liming, et al. Comparison of carbon and nitrogen metabolism of flue-cured tobacco in different altitudes in Wumeng tobacco-growing area of Guizhou[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2016, 22(1): 143-150.

[34]韓錦峰, 汪耀富, 岳翠凌, 等. 干旱脅迫下烤煙光合特性和氮代謝研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報, 1994(02):39-45.HAN Jinfeng, WANG Yaofu, YUE Cuiling, et al. Study on photosynthetic characteristics and nitrogen metabolism of flue cured tobacco under drought stress[J]. Acta agriculturae borealisinica, 1994 (02): 39-45.

[35]耿素祥, 王樹會, 劉衛(wèi)群. 不同施氮條件對烤煙打頂前后代謝及物質(zhì)積累的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2011, 19(06):1250-1254.GENG Suxiang, WANG Shuhui, LIU Weiqun. Effects of nitrogen on metabolism and dry matter accumulation of flue-cured tobacco before and after topping[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture,2011, 19(06): 1250-1254.