李小杰，李淑君，李成軍，胡亞靜，康業(yè)斌，邱睿，陳奇園，白靜科，陳玉國

1 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)永昌大道與青梅路交叉口 461000；2 河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南省洛陽市天津路70號(hào) 471000

煙草苗期根莖類病害有猝倒病、立枯病、炭疽病、黑脛病、根黑腐病、鐮刀菌根腐病等[1-5]，其中以猝倒病、立枯病、炭疽病發(fā)生較為普遍，給煙草苗床管理帶來較大危害。1994年，陳瑞泰[1]報(bào)道由鐮刀菌引起的煙草苗床根腐病在云南省苗床有發(fā)生，是一種具有潛在危害性的病害。

煙草漂浮育苗技術(shù)是全國煙區(qū)推廣普及的一項(xiàng)新型實(shí)用育苗技術(shù)，對(duì)提高煙葉整體生產(chǎn)水平，提高煙葉質(zhì)量起重要作用。隨著漂浮育苗技術(shù)推廣面積的擴(kuò)大及其應(yīng)用年限的增長，加之苗床管理不規(guī)范，近年來煙草漂浮苗根腐病的發(fā)生有逐年加重的趨勢(shì)[6-8]，且病原種類也在不斷增加。據(jù)報(bào)道，腐霉屬中瓜果腐霉［Pythium aphanidermatum( Eds. ) Fitzp.］、終極腐霉(Pythium ultimumTrow) 和畸雌腐霉(Pythium irregulareBuismand ) 等可引起多種植物的根腐病，其中瓜果腐霉可引起煙草猝倒病[9-10]。2012年，勞超等[11]首次報(bào)道了由異絲腐霉引起煙草漂浮苗根腐病。李宏光等[12]從漂浮育苗中分離鑒定出5屬6種導(dǎo)致煙苗根腐的細(xì)菌。2017年在河南省寶豐、泌陽、許昌、漯河等煙區(qū)煙草漂浮育苗過程中，煙苗出現(xiàn)生長緩慢、植株矮小、生長勢(shì)差、葉色發(fā)黃等問題，浮盤下煙苗的根呈灰褐色，后腐爛死亡，發(fā)病嚴(yán)重的煙苗莖基部及底部葉片的葉脈出現(xiàn)褐色壞死，給煙苗生產(chǎn)帶來了很大的威脅。為明確病原，同時(shí)為苗床病害的防治及苗床管理提供依據(jù)，本研究采集了具有代表性的病害樣本，并對(duì)樣本進(jìn)行了病原菌分離、鑒定以及致病性測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年5月自平頂山寶豐、駐馬店泌陽、許昌縣、漯河臨潁煙區(qū)苗床采集有代表性的疑似根腐病的病害樣本共12個(gè)，進(jìn)行病原物分離及鑒定。

1.2 病原菌分離及形態(tài)觀察

采用PDA（馬鈴薯萄萄糖培養(yǎng)基）常規(guī)分離法進(jìn)行病原菌分離，將洗凈的新鮮病根或病莖剪成5 cm長的節(jié)段，無菌水浸洗4～5次，置PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫光/暗（12 h/12 h）培養(yǎng)4～6 d，待菌落形成。切取菌落邊緣部分置于新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，獲得純菌株后，轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫光/暗（12 h/12 h）培養(yǎng)7～15 d，顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3 病原的分子生物學(xué)鑒定

使用真菌基因組提取試劑盒提取分離菌的基因組DNA，用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1/ITS4和18S rDNA引物NS1/NS6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其序列分別為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL：Taq 酶0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物各 0.5 μL（10 μM），模板 1 μL（50 ng/μL），加dd H2O 至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min，94℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，選擇同源性較高的序列用MEGA軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 病原菌回接試驗(yàn)

（1）漂浮苗水培接種法：從病組織上獲得病菌的純培養(yǎng)后，置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫光/暗（12 h/12 h）培養(yǎng)12 d，制備孢子懸浮液，調(diào)整濃度約為1×106個(gè)/mL。將中煙100漂浮苗置于孢子懸浮液中，置25 ℃、黑暗/光照為12 h/12 h的人工氣候箱中培養(yǎng)，以無菌水做對(duì)照。5～7 d后，觀察發(fā)病情況。

（2）盆栽灌根接種法：選苗齡為4～5真葉健康的中煙100煙苗，用滅菌的手術(shù)刀對(duì)根系造成傷口，移栽至直徑為10 cm的花盆中，每株灌20 mL孢子懸浮液（濃度同上），以無菌水接種做對(duì)照。5～7 d后，觀察發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及形態(tài)學(xué)觀察

從采集到的12個(gè)疑似根腐病的病害樣本中分離純化獲得具有代表性的真菌菌株10個(gè)（圖1），編號(hào)分別為 BF-2、BF-3、BF-4、BF-5、BF-6、BY-1、BY-2、LH-3、LH-5、XC-1。

圖1 樣品采集照片F(xiàn)ig.1 Photos of sample collection

10個(gè)菌株的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，菌落生長茂盛，氣生菌絲白色棉絮狀（圖2A），光學(xué)顯微鏡下（400倍），菌絲無色，無隔膜，直徑2.5～12.5 μm，平均約8.2 μm；孢子囊頂生，由球形膨大菌絲形成，無乳突，直徑17.5～32.5 μm，平均約24.1 μm；藏卵器頂生，短柄，球形。卵孢子球形、透明，具有雙層厚壁，直徑22.5～32.5 μm，平均約26.4 μm（圖2B、C）。

圖2 分離菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及病原形態(tài)特征Fig.2 Characteristics and pathogenic morphology of isolated Fungus on PDA medium

2.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

通過Blast，10個(gè)菌株ITS區(qū)段的比對(duì)結(jié)果表明（圖3），所分離純化得到的10個(gè)菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中鳶尾絲囊霉（Aphanomyces iridis）序列同源性均為99%，且位于同一分支。

圖3 分離菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of the isolated Fungus

2.3 病原菌的回接試驗(yàn)

選取代表性菌株進(jìn)行漂浮苗及盆栽接種試驗(yàn)，結(jié)果表明（圖4），與對(duì)照相比，煙苗在分別接種菌株BF-2和BF-5后7 d，根部出現(xiàn)褐色變軟壞死，根系少，下部葉片發(fā)黃，莖基部和底部葉片的葉脈處形成褐色壞死斑，甚至全株萎焉。將發(fā)病組織在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，也同樣得到絲囊霉菌，說明所分離到的絲囊霉菌具有致病性，表明鳶尾絲囊霉可引起煙草漂浮苗根腐病。

圖4 分離菌的致病性測(cè)定Fig.4 Pathogenicity test of the isolated Fungus

3 結(jié)論與討論

絲囊霉屬(Aphanomyces)屬于鞭毛菌亞門真菌，是卵菌綱、水霉目、水霉科中的一屬，常見的水霉科真菌還包括綿霉屬、水霉屬等，其中有些種類是引起稻苗綿腐病和魚類水霉病的病原菌[13-14]。由絲囊霉屬真菌引起的植物病害在國內(nèi)外均有報(bào)道。1940年，Weime發(fā)現(xiàn)根腐絲囊霉菌（Aphanomyces euteiches）和一種鐮刀屬真菌（Fusariumsp.）侵染箭筈豌豆，引起根腐病[15]。1974年，日本首次發(fā)現(xiàn)絲囊霉屬真菌引起的荷蘭鳶尾基腐病，又稱黃化腐敗病，其病原為鳶尾絲囊霉（Aphanomyces iridisIchitani &Kodama）[16]。在我國甘肅河西灌區(qū)，由黑腐絲囊霉（Aphanomyces cochlioides）引起的甜菜黑腐病是一種重要病害[17]。另外，在我國福建、青海和甘肅地區(qū)，根腐絲囊霉（Aphanomyces euteichesDrechs）可引起豌豆的根腐病[18-20]。但是目前尚未有關(guān)于絲囊霉屬真菌引起的煙草根部病害的報(bào)道，本文是絲囊霉屬真菌引起煙草根腐病的首次報(bào)道。

根據(jù)生產(chǎn)中采集到的苗床病株癥狀和本文接種癥狀，本研究基本明確了由鳶尾絲囊霉引起的煙草漂浮苗根腐病的典型癥狀為：感病煙苗生長緩慢、植株矮小、葉色發(fā)黃、根部呈現(xiàn)褐色變軟壞死、根系少，病癥可向上擴(kuò)展至莖基部和底部葉片，形成褐色壞死斑，嚴(yán)重的致全株萎焉。該病癥狀與瓜果腐霉引起的煙草苗期猝倒病的主要區(qū)別表現(xiàn)在前者除有根腐的病狀外，一般不會(huì)出現(xiàn)植株倒伏的現(xiàn)象。同時(shí)也有報(bào)道異絲腐霉引起煙草漂浮育苗根腐病[11]，但該病與鳶尾絲囊霉引起的根腐病的主要區(qū)別在于，前者只有根腐的癥狀并不危及莖部，而后者往往會(huì)向上擴(kuò)展至莖部和底部葉片，出現(xiàn)褐色壞死。

絲囊霉屬真菌可在土壤中營腐生生活，以卵孢子和菌絲體在土壤中越冬。該病害的發(fā)生與土壤水分關(guān)系密切，低溫高濕有利于該病害的發(fā)生[16,21]，這與煙草猝倒病的發(fā)生條件基本一致，而與煙草立枯病的發(fā)病條件有一定差異[3,22]。因此，在漂浮育苗過程中應(yīng)注意做好基質(zhì)和水源的殺菌、消毒工作，同時(shí)加強(qiáng)和規(guī)范苗床管理，注意適當(dāng)對(duì)煙苗進(jìn)行控水處理。

[1]陳瑞泰. 我國煙草苗期病害及綜合治理[J]. 中國煙草, 1994(4): 27-30.CHEN Ruitai. Disease and comprehensive control of tobacco seedling in China[J]. CHINA TOBACCO, 1994(4): 27-30.

[2]談文. 煙草病理學(xué)教程[M]. 北京: 中國科學(xué)技術(shù)出版社, 1995.TAN Wen. Course of tobacco pathology[M]. Bei jing: China Science and Technology Press, 1995.

[3]孔凡玉. 煙草苗期病蟲害的綜合防治[J]. 煙草科技, 2002(02): 46-48.KONG Fanyu. Comprehensive Control of Diseases and Pests in Tobacco Seedling Stage[J]. Tobacco Science &Technology.2002(02): 46-48.

[4]徐新利. 煙草苗期病害類型及防治[J]. 河南農(nóng)業(yè), 2004(4): 29.XU Xinli. Disease types and control of tobacco seedlings[J].HENANNONGYE, 2004(4): 29.

[5]常遠(yuǎn)程, 李彤. 煙草苗期病害的綜合防治[J]. 新農(nóng)業(yè), 2004(2): 29.CHANG Yuancheng, LI Tong. Comprehensive control of tobacco seedling disease[J]. New Agriculture, 2004(2): 29.

[6]李宏光, 李勇軍, 劉春明,等. 煙草漂浮育苗中漂池營養(yǎng)液pH值對(duì)根系腐變的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 24(6): 2225-2229.LI Hongguang, LI Yongjun, LIU Chunming, et al. Effects of nutrient solution pH value in floating-bed production pool on root rot of tobacco seedlings[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2011, 24(6): 2225-2229.

[7]李勇軍, 李宏光, 劉春明,等. 煙草漂浮育苗施肥量與電導(dǎo)率關(guān)系及對(duì)培育健壯苗的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 25(6): 2167-2172.LI Yongjun, LI Hongguang, LIU Chunming, et al. Correlation between fertilized amount and solution conductivity in floating pool and effects on culturing robust seedlings of tobacco[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2012, 25(6): 2167-2172.

[8]段志贊. 大棚烤煙漂浮育苗存在的問題及解決措施[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2015(8): 64-65.DUAN Zhizan. Problems and solutions for floating tobacco seedlings in Greenhouse[J]. Modern Agricultural Sciences and Technology, 2015(8): 64-65.

[9]VAN DER PLAATS-NITERINK A J. Monograph of the genusPythium.[J]. Studies in Mycology, 1981(21): 1-242.

[10]談文, 吳元華. 煙草病理學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003.TAN Wen, WU Yuanhua. Tobacco pathology[M]. Bei Jing: China Agriculture Press, 2003.

[11]勞超, 劉云龍, 謝勇, 等. 首次報(bào)道由異絲腐霉(Pythium diclinum)引起的煙草根腐病[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)),2012, 27(6): 905-909.LAO Chao, LIU Yunlong, XIE Yong, et al. First report on root rot of tobacco caused byPythium diclinum[J]. Journal of Yunnan Agricultural University, 2012, 27(6): 905-909.

[12]李宏光, 李勇軍, 劉春明,等. 煙草育苗漂池液中細(xì)菌數(shù)量變化與防控根腐藥劑研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 30(5): 1097-1103.LI Hongguang, LI Yongjun, LIU Chunming, et al. Study on Bacterium Amount Changes and Controlling Tobacco Seedlings Root Rot Pesticides and Reagents in Floating-bed Pool Solution[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2017, 30(5): 1097-1103.

[13]余永年, 梁枝榮. 北京地區(qū)水霉科真菌季節(jié)性分布[J]. 真菌學(xué)報(bào), 1983, 2(3): 179-186.YU Yongnian, LIANG Zhirong. Seasonal distribution of Saprolegniaceous Fungi in Beijing[J]. Acta Mycologica Sinica,1983, 2(3): 179-186.

[14]宋鎮(zhèn)慶, 梁景頤, 劉偉成. 遼寧省水霉的分類研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1994, 25(3): 250-253.SONG Zhenqing, LIANG Jingyi, LIU Weicheng. The taxonomy of Saprolegniaceous Fungi in Liaoning province[J]. Journal of Shenyang Agricultural University, 1994, 25(3): 250-253.

[15]Weimer J L. Root rot of Austrian Winter Peas and Vetches.[J].Phytopathology, 1940, 30(8): 708-711.

[16]徐志新. 荷蘭鳶尾黃化腐敗病[J]. 植物檢疫, 1992, 6(1): 47-48.XU Zhixin. Yellowing rot of iris in Holland[J]. ZHIWU JIANYI,1992, 6(1): 47-48.

[17]李敏權(quán), 林淑潔, 徐秉良, 等. 影響甜菜黑腐絲囊霉的幾種生態(tài)學(xué)和生物學(xué)因子[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2003, 9(2): 183-185.LI Minquan, LIN Shujie, XU Bingliang, et al. Ecological and biological factors affectingAphanomyces cochlioides[J]. Chin J Appl Environ Biol. 2003, 9(2): 183-185.

[18]陳慶河, 翁啟勇, 何玉仙, 等. 福建省豌豆根腐病病原及致病性研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2004, 19(1): 28-31.CHEN Qinghe, WENG Qiyong, HE Yuxian, et al. Pathogeny and pathogenicity of root disease of peas in Fujian province[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2004, 19(1): 28-31.

[19]刁治民. 青海豌豆根腐病病原菌種類及致病性的研究[J]. 微生物學(xué)雜志, 1996(1): 31-34.DIAO Zhimin. Study on the pathogen and pathogenicity of root disease of peas in Qinghai[J]. Journal of Microbiology, 1996(1): 31-34.

[20]唐德志, 何蘇琴, 李玉奇, 等. 甘肅豌豆根病的病原菌種類及致病力研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1993, 2(2): 37-39.TANG Dezhi, HE Suqin, LI Yuqi, et al. Study on the pathogen and pathogenicity of root disease of peas in Gansu[J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 1993, 2(2): 37-39.

[21]李敏權(quán), 張自和, 林淑潔, 等. 甜菜黑腐病研究進(jìn)展[J]. 中國甜菜糖業(yè), 2002(2):10-11.LI Minquan, ZHANG Zihe, LIN Shujie, et al. Advances in Sugar beet black rot[J]. CHINA BEET &SUGAR, 2002(2): 10-11.

[22]朱賢朝, 王彥亭, 王智發(fā). 中國煙草病蟲害防治手冊(cè)[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001.ZHU Xianchao, WANG Yanting, WANG Zhifa. The manual of tobacco disease and pest control in China[M]. Bei jing: China Agriculture Press, 2001.