， ， ， ，

(1.濟(jì)南大學(xué)-山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250022； 2. 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心， 山東 濟(jì)南 250062)

人絕經(jīng)期促性腺激素(human memopausal gonadotropin，HMG)，又名尿促性素(menotropins)，是一種糖蛋白促性腺激素，包含比例約為1∶1的卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)2種組分，由腦垂體前葉分泌，可以從絕經(jīng)期或絕經(jīng)后婦女的新鮮尿液中提取得到[1]。

尿源HMG屬于FSH類第一代藥物，能夠控制卵泡的成熟與排卵[2]。經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐，已經(jīng)證明了HMG治療不孕不育安全有效，常作為輔助生殖領(lǐng)域的促排卵藥物；此外，還有治療女性閉經(jīng)[3]、月經(jīng)不調(diào)、男性生殖細(xì)胞質(zhì)量低下[4]等作用。

根據(jù)山東某生物制品公司的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，尿源HMG粗品的提取生產(chǎn)，受制于尿源質(zhì)量的限制，不同地區(qū)的尿源提取得到的HMG粗品生物活性不盡相同。同時(shí)，臨床應(yīng)用的尿促性素為高比活原料藥所制，因而相關(guān)制藥企業(yè)由生物制品廠收購的粗品還需經(jīng)過多步色譜純化，從而去除其中無效用雜質(zhì)和病毒。HMG粗品中含有的雜質(zhì)部分容易脹裂色譜柱，更會(huì)增加介質(zhì)的使用量，所以在進(jìn)入色譜純化步驟前，需要通過部分沉淀法去除大量此類雜質(zhì)[5-10]。

本文中初步研究丙酮對(duì)HMG粗品的進(jìn)一步提純，建立HMG中間體提純方法，并測(cè)定、比較采自不同地區(qū)的樣品的HMG中間體免疫效價(jià)及生物活性，以期為提高HMG中間體的活性及尿液資源的選擇性開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague Dawley大鼠，SPF級(jí)，雌性， 體質(zhì)量45～55 g， 出生21～23 d， 山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。

1.2 尿源

分別于臨沂、濟(jì)寧、濟(jì)南、泰安、德州5個(gè)尿源地，收集當(dāng)天絕經(jīng)期前后婦女的新鮮尿液；每個(gè)尿源地隨機(jī)選取3個(gè)居民區(qū)收集；每個(gè)居民區(qū)隨機(jī)選取30個(gè)提供者進(jìn)行收集，用于HMG提取實(shí)驗(yàn)。研究已經(jīng)征得當(dāng)?shù)鼐用裢猓瑢僮栽感袨?，同時(shí)要求提供者身體健康。

1.3 試劑與儀器

試劑：注射用絨促性素(human chorionic gonadotrophin，HCG)，1 000 U·Vial-1，151004，上海麗珠制藥有限公司；尿促性素標(biāo)準(zhǔn)品，247 FSH U·Vial-1，150524，中國食品藥品檢定研究所；FSH酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，RN55008，Biocheck；蘇木精-伊紅染色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白，Sigma；高嶺土，石家莊長(zhǎng)利礦產(chǎn)品有限公司；其他均由國藥試劑公司提供。

儀器：真空干燥器，四川蜀玻(集團(tuán))有限責(zé)任公司；UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Synergy HT型號(hào)酶標(biāo)儀，香港基因有限公司；GNP-9050BS-Ⅲ隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；R135型輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 HMG中間體的提純

2.1.1 HMG粗品的提取

取尿液50 L，以200目(孔徑約75 μm)濾網(wǎng)過濾，醋酸調(diào)節(jié)pH為4.0～4.5，以10 g/L的比例加入高嶺土，以300 r/min轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌2 h，抽濾收集高嶺土；加入3 L蒸餾水重懸后，氨水調(diào)節(jié)pH為11.0～11.4，以300 r/min轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌2 h后，抽濾收集洗脫液[11]；重復(fù)上述步驟，將高嶺土繼續(xù)進(jìn)行二次洗脫；合并2次洗脫液，以醋酸調(diào)節(jié)pH為8.5，以300 r/min轉(zhuǎn)速攪拌1 h，靜置3 h后， 抽濾去除雜蛋白。 各地區(qū)分別收集當(dāng)天尿液混勻后取一批尿液， 共3批尿液， 按照上述步驟同時(shí)進(jìn)行提??； 其中， 臨沂各居民區(qū)分出部分尿液，略過提純步驟，用醋酸調(diào)pH為4.3～4.8后，直接加入3倍預(yù)冷丙酮沉淀得粗品，HMG粗品沉淀收集方式與HMG中間體沉淀的收集方式相同。以此步驟獲取的HMG粗品作為提純實(shí)驗(yàn)組的對(duì)照。

2.1.2 HMG中間體的提純

向合并收集的洗脫液內(nèi)補(bǔ)加乙酸銨至洗脫液含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的乙酸銨后，再加入1.5～2.5倍體積的預(yù)冷10%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸銨-丙酮溶液， 攪拌后4 ℃靜置8 h， 抽濾除去低溶解度的雜蛋白，得到抽提液，以醋酸調(diào)節(jié)pH為4.3～4.8，加入1.5～2.5倍體積的預(yù)冷丙酮，300 r/min充分?jǐn)嚢?0 min后，4 ℃靜置8 h。 取硅藻土作為助濾劑鋪設(shè)在抽濾漏斗上，無水丙酮潤(rùn)濕后，壓實(shí)并抹平表面，抽濾收集沉淀，在抽濾完成后立刻向抽濾漏斗內(nèi)加入300 mL無水丙酮，以抽濾的方式，借助無水丙酮完成脫水操作，脫水重復(fù)進(jìn)行3次。用藥匙小心刮取硅藻土表面的HMG中間體沉淀，在五氧化二磷真空干燥箱中進(jìn)行干燥后即得含硅藻土的HMG中間體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HMG中間體及粗品蛋白含量測(cè)定

分析天平準(zhǔn)確稱取上述HMG中間體或HMG粗品100.0 mg，以50 mL磷酸鹽緩沖溶液溶解，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離后去除內(nèi)含的硅藻土，取上清備用， 采用考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法， 按表1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定， 如樣品的吸光值超過0.66，須進(jìn)行稀釋后測(cè)定。

表1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品蛋白濃度測(cè)定

2.3 HMG中間體及粗品的免疫效價(jià)測(cè)定

按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定反應(yīng)體系吸光值，并計(jì)算結(jié)果。實(shí)際測(cè)定中設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

2.4 HMG中間體及粗品生物活性測(cè)定

2.4.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)(待測(cè))HMG溶液配制：以含32 IU/mL HCG的生理鹽水-牛血清白蛋白溶液作為溶媒，溶解HMG標(biāo)準(zhǔn)品、粗品或中間體，配制估計(jì)效價(jià)分別為1.25、2.5、5 IU/mL的低、中、高劑量HMG溶液；實(shí)驗(yàn)中以不含HMG的溶媒作為空白劑量組注射液，含標(biāo)準(zhǔn)HMG溶液作為對(duì)照組注射液，HMG粗品或中間體溶液作為實(shí)驗(yàn)組注射液。

全部的溶液均采用孔徑0.22 μm的濾膜進(jìn)行除菌過濾，存儲(chǔ)待用，其中的HMG中間體及粗品待測(cè)液，各地分別由3個(gè)居民區(qū)提取的HMG中間體或粗品粉末等量均勻地溶解于溶媒得到，即5個(gè)地區(qū)共準(zhǔn)備5份待測(cè)液，并采用孔徑0.22 μm濾膜除菌過濾。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將198只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照1個(gè)空白劑量組、3個(gè)對(duì)照組、18個(gè)實(shí)驗(yàn)組，共22組，每組9只，進(jìn)行隨機(jī)分組。

2.4.3 數(shù)據(jù)收集處理

按照每只大鼠每天0.4 mL的量，每天固定同一時(shí)間，連續(xù)3 d，進(jìn)行頸部皮下注射。最后一次注射24 h后，處死大鼠，稱取整只體質(zhì)量(精確到0.001 g)，摘取雙側(cè)卵巢，剝除附著的組織，吸干附著的水分，稱取雙側(cè)卵巢質(zhì)量(精確到0.001 g)。計(jì)算每10 g大鼠體質(zhì)量的雙側(cè)卵巢質(zhì)量[12-14]。

采用《中國藥典(2015)》的方法，以每10 g大鼠體質(zhì)量的雙側(cè)卵巢質(zhì)量為反應(yīng)值Y，按照生物檢定法中的量反應(yīng)平行線測(cè)定法計(jì)算效價(jià)。具體計(jì)算分析使用BS 2000軟件。

2.5 給藥后大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

大鼠卵巢摘取后， 以體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林固定液固定24 h， 再流水沖洗24 h， 經(jīng)常規(guī)脫水、 浸蠟、 包埋后， 4 μm厚度精度切片， 60 ℃烤片4 h。 常規(guī)脫蠟水化后(顯微鏡掌控)， 蘇木素染色20～30 min， 體積分?jǐn)?shù)為1%的濃鹽酸-無水乙醇溶液分化2 s， 蒸餾水反藍(lán)，伊紅染液染色10 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，稍晾干后中性樹膠封片觀察[15-16]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS 22.0版本的統(tǒng)計(jì)分析軟件處理采用單因素方差分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 HMG中間體及粗品溶液的蛋白含量

蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.006 4X+0.018 8，r2=0.994 4，吸光值A(chǔ)595代入方程計(jì)算，結(jié)果見表2。

圖1 蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線表2 各地尿促性素中間體及粗品的平均蛋白含量

樣品來源項(xiàng)目蛋白濃度/(mg·L-1)蛋白含量/mg臨沂 1456.12±67.7272.81濟(jì)寧 1429.74±68.5171.49濟(jì)南 1096.41±97.0654.82泰安 1204.10±88.3560.21德州 1465.64±93.2773.28粗品對(duì)照1105.41±94.3355.27

3.2 HMG中間體及粗品的免疫效價(jià)和生物活性

作免疫效價(jià)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，曲線方程Y=0.016 16X+0.029 63，r2=0.996 8，吸光值A(chǔ)450代入計(jì)算可得免疫效價(jià)。HMG中間體及粗品的免疫效價(jià)與生物活性測(cè)定結(jié)果見表3。

圖2 免疫效價(jià)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示， 提取的HMG中間體， 來自濟(jì)南的樣品的免疫效價(jià)最高， 其他4地的含量在0.9～1.1 IU/mg之間； 同樣， 來自濟(jì)南的樣品的HMG中間體生物活性也最高，臨沂、 濟(jì)寧兩地的次之； 同時(shí)， 除臨沂外，其他4地樣品的HMG中間體生物活性均低于免疫效價(jià)。與HMG粗品相比，經(jīng)過提純的HMG中間體，免疫效價(jià)與生物活性均有明顯提高。本文中的生物活性測(cè)定結(jié)果的可信限率均低于45%，實(shí)驗(yàn)誤差也符合《中國藥典(2015)》的相關(guān)規(guī)定。

3.3 經(jīng)HMG中間體注射卵巢形態(tài)學(xué)變化

肉眼觀察，空白組大鼠卵巢色澤紅潤(rùn)，表面無囊狀擴(kuò)張的卵泡；相對(duì)于空白組，隨著HMG劑量的增加，實(shí)驗(yàn)組突出于卵巢表面的囊狀卵泡逐漸增加，同時(shí)卵巢的整體大小、質(zhì)量也都在逐漸增加，以高劑量組尤為明顯。蘇木精-伊紅染色法(HE)染色顯微鏡下觀察，如圖3—4所示?？瞻捉M可見卵巢組織內(nèi)處于各個(gè)發(fā)育時(shí)期的卵泡以及一定數(shù)量的黃體；顆粒細(xì)胞排列有序，卵泡膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞未見增生。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，隨著HMG劑量的增加，同一放大倍數(shù)下可見，卵泡的大小顯著增加，呈現(xiàn)多囊性擴(kuò)張；各發(fā)育階段卵泡、黃體數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少到1～3層，同時(shí)，部分較大卵泡中卵母細(xì)胞或放射冠消失；卵泡膜細(xì)胞增生，卵泡膜增厚。

表3 各地尿促性素中間體及粗品的免疫效價(jià)及生物活性

注：A為空白組； B—D分別對(duì)應(yīng)低、中、高劑量對(duì)照組。圖3 卵巢形態(tài)學(xué)變化(HE-染色，X40)

注：A1—A3，臨沂(低中高劑量組)；B1—B3，濟(jì)寧(低中高劑量組)；C1—C3，濟(jì)南(低中高劑量組)；D1—D3，泰安(低中高劑量組)；E1—E3，德州(低中高劑量組)。圖4 卵巢形態(tài)學(xué)變化(HE-染色，X40)

4 結(jié)論

對(duì)比傳統(tǒng)的尿促性素粗品提取工藝，經(jīng)過丙酮二級(jí)提純處理的尿促性素中間體質(zhì)量有明顯提高。

對(duì)比原尿免疫效價(jià)、尿促性素中間體免疫效價(jià)和生物活性能夠發(fā)現(xiàn)，原尿的免疫效價(jià)較高的尿源，提取所得的尿促性素中間體免疫效價(jià)和生物活性相對(duì)也較高；另外，尿促性素中間體免疫效價(jià)普遍高于生物活性，相對(duì)的差值在0.10～0.36之間，鑒于免疫效價(jià)檢測(cè)的高效率和低成本，生產(chǎn)上完全可用尿促性素免疫效價(jià)對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行估計(jì)、監(jiān)控，也可為上游尿促性素粗品的供應(yīng)鏈廠家減少生產(chǎn)成本。

不同地區(qū)提取的尿促性素中間體，均以嚴(yán)格統(tǒng)一的工序進(jìn)行提取，所以彼此間免疫效價(jià)、生物活性差異應(yīng)是源于各地人群尿液中FSH含量的差異，通俗來講，即尿源質(zhì)量良莠不齊，這就要求生產(chǎn)上嚴(yán)格把控尿液的來源，以期控制最終成品的質(zhì)量。而人群尿液中FSH含量的差異，可能是生活環(huán)境、飲食習(xí)慣的不同所致。

大鼠的卵巢組織HE染色觀察，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尿促性素中間體溶液注射的大鼠卵巢形態(tài)明顯改變，與尿促性素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組的形態(tài)改變一致，卵巢整體變大、質(zhì)量增加，也驗(yàn)證了生物測(cè)定法的測(cè)定指標(biāo)的有效性。同時(shí)，卵巢內(nèi)卵泡的改變也與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[15-16]，并隨中間體含量的增加而愈發(fā)明顯。

參考文獻(xiàn):

[1] KANG S, ZHAO X W, WANG N, et al. Gonadotropin preparations: past, present, and future perspectives [J]. Fertility & Sterility, 2008, 90(5):13-20.

[2] 劉金釧, 彭貴子, 盧智俊, 等.重組人促卵泡激素研究進(jìn)展[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 44(3):283-288.

[3] CHECK J H. Minimal and natural stimulations for IVF[M]//WU B. Advances in Embryo Transfer. Rijeka: InTech, 2012: 37436-37442.

[4] 徐璐, 熊國保, 胥杜娟, 等.少弱精癥的中西醫(yī)治療現(xiàn)狀與進(jìn)展 [J]. 現(xiàn)代診斷與治療, 2009, 20(2):82-85.

[5] 王麗, 施曉春, 劉翠珍, 等. 乙酸銨提純尿促性素的方法: 10598002.6[P]. 2012-12-30.

[6] 張富源, 殷小崴, 趙夢(mèng)喆, 等. 一種尿促性素的提純方法: 10778613.2[P]. 2015-11-13.

[7] 張樣柏.一種從人尿中提取促性腺激素的方法: 10362136.7[P]. 2014-07-28.

[8] 劉乃山, 劉君, 劉翠珍.一種高效價(jià)尿促性素的提取及純化方法:10832517.1[P].2015-11-26.

[9] 劉乃山, 劉君, 葛翠鳳, 等. DEAE柱層析提純尿促性素的技術(shù)方法: 10648024.3[P].2013-11-27.

[10] BALANIAN L, CANCELA M, WOLFENSON C, et al. A process for obtaining hmg-up (human menopausal gonadotropin with ultra-purity grade) and a composition free of contaminants: WO, 177751[P]. 2015-5-21.

[11] DONINI P, PUZZUOLI D, MONTEZEMOLO R. Purification of gonadotrophin from human menopausal urine [J]. Acta Endocrinologica, 1964, 45(3):321-328.

[12] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典: 4部[S]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 171-172.

[13] 李湛軍, 李心欣, 梁成罡. 促卵泡激素體內(nèi)生物活性測(cè)定及其各國藥典方法比較[J]. 藥物分析雜志, 2014, 101(4):727-732.

[14] 吳彥霖, 張媛, 唐黎明, 等. 第4批人絕經(jīng)尿促性腺素(HMG)國家標(biāo)準(zhǔn)品的協(xié)作標(biāo)定[J]. 藥物分析雜志, 2016, 36(8): 1487-1494.

[15] 孔凡靜. MicroRNA在PCOS大鼠模型卵巢中的表達(dá)[D]. 武漢: 華中科技大學(xué), 2011.

[16] 郭洪勝. PCOS動(dòng)物模型及PCOS患者CYP19、GATA-4、FSHR基因表達(dá)的初步研究[D].廣州: 南方醫(yī)科大學(xué), 2010.