丁芳兵， 孫偉博， 原雅玲， 尋路路， 張 蕾

(1.陜西省西安植物園/陜西省植物研究所，陜西西安 710061； 2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210037)

秦嶺山區(qū)及周邊地區(qū)百合資源豐富。近年來(lái)，有許多關(guān)于秦嶺地區(qū)川百合、卷丹、野百合等百合群體形態(tài)學(xué)水平上遺傳多樣性的研究報(bào)道，這些種在群體內(nèi)或群體間具有豐富的多態(tài)性，主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)、形態(tài)存在顯著差異[1-5]。遺傳多樣性是指種內(nèi)不同種群之間或同一種群不同個(gè)體間的遺傳變異總和，除去個(gè)體水平上的形態(tài)發(fā)育差異，還包括細(xì)胞水平上的染色體差異及分子水平上的核酸、蛋白差異等。育種需要足夠性狀遺傳多樣性的種質(zhì)資源，而分子生物學(xué)的發(fā)展為學(xué)者研究種質(zhì)資源遺傳多樣性提供了更便捷、更精確的方法，目前，分析百合群體遺傳多樣性與親緣關(guān)系的主要技術(shù)有即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱(chēng)RAPD)、內(nèi)部簡(jiǎn)單序列重復(fù)(inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱(chēng)ISSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱(chēng)AFLP)等[6-8]，其中ISSR標(biāo)記重復(fù)性比RAPD好，操作簡(jiǎn)單、快速高效，且無(wú)需測(cè)序，是較適合百合研究的一項(xiàng)分子標(biāo)記技術(shù)。

山丹(Liliumpumilum)作為藥食兩用百合，具有抗寒、抗旱、抗鹽堿等多種優(yōu)良性狀，在秦嶺地區(qū)廣有分布，是百合雜交育種的優(yōu)良親本。目前，對(duì)秦嶺地區(qū)山丹遺傳多樣性的研究非常有限，而利用表型性狀和ISSR技術(shù)研究山丹不同居群的遺傳多樣性，不僅可以為分析山丹進(jìn)化演變提供重要參考，而且可篩選出山丹不同居群的優(yōu)良變異性狀，為秦嶺地區(qū)山丹資源的保護(hù)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來(lái)自秦嶺山周邊的營(yíng)盤(pán)鎮(zhèn)、佛坪縣、小峪、大峪口、太白縣等地，共計(jì)9個(gè)居群，分別于2013、2014年5—9月在秦嶺山區(qū)及周邊地區(qū)采集共計(jì)30余次，每個(gè)居群采樣個(gè)體數(shù)30個(gè)，個(gè)體間避免為同一無(wú)性系。各采樣點(diǎn)詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1不同居群山丹采樣點(diǎn)信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表型性狀調(diào)查 采用游標(biāo)卡尺測(cè)量山丹的花柱長(zhǎng)度、花絲長(zhǎng)度、莖粗、鱗莖最寬處直徑，使用米尺測(cè)量株高。

1.2.2 基因組DNA的提取 采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒，提取植株鱗莖最外部鱗片的DNA；提取的DNA通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，DNA樣品于-20 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和電泳 初篩選出25條引物，由上海Invitrogen(英駿)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成；每個(gè)居群隨機(jī)選擇2個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增，最終選擇P1：5′-CTCTCTCTCTCTCT TGA-3′、P2：5′-CTCTCTCTCTCTCTTAG-3′、P3：5′-CTCTC TCTCTCTCTTGT-3′這3條特征帶清晰的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL：20～25 ng模板DNA 1 μL，Taq酶 0.5 μL，10 μmol/L ISSR引物 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10×buffer 4 μL，加ddH2O至20 μL。 PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，染色后進(jìn)行條帶分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

表型性狀數(shù)據(jù)采用SPSS 19軟件進(jìn)行分析比對(duì)。ISSR結(jié)果在100～2 000 bp范圍內(nèi)選取重復(fù)性良好且清晰的條帶進(jìn)行記錄統(tǒng)計(jì)，相同分子量片段對(duì)應(yīng)1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，有特異性條帶的記為1，沒(méi)有的記為0。

2 結(jié)果與分析

2.1 居群間表型性狀變異分析

由表2可見(jiàn)，5個(gè)表型性狀中，山丹居群SD3的植株相對(duì)最高、花柱相對(duì)最短、鱗莖最寬直徑相對(duì)最大，居群SD1的植株相對(duì)最矮、鱗莖最寬直徑相對(duì)最小，居群SD8的花絲相對(duì)最短，與其他居群差異顯著(P<0.05)；在莖粗指標(biāo)上，9個(gè)居群差異不顯著，表明其遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較高；居群SD3、SD8的花柱長(zhǎng)度、株高、鱗莖最寬直徑與其他居群相比差異顯著(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，5個(gè)表型性狀僅在某些居群中存在相關(guān)性，如居群SD1、SD2、SD3、SD5、SD7的株高與莖粗呈正相關(guān)，居群SD1、SD3、SD8的花柱、花絲長(zhǎng)度與鱗莖最寬直徑呈負(fù)相關(guān)，居群SD4、SD5的花柱、花絲長(zhǎng)度與鱗莖最寬直徑呈正相關(guān)，表明5個(gè)表型性狀在9個(gè)居群間的相關(guān)性不高，居群特異性明顯。方差分析結(jié)果表明，居群內(nèi)各指標(biāo)的差異不顯著。

表2山丹9個(gè)居群的表型性狀cm

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 表型性狀與地理環(huán)境因子的相關(guān)性

由表3可見(jiàn)，僅花絲長(zhǎng)度與生長(zhǎng)環(huán)境呈負(fù)相關(guān)，其他4個(gè)表型性狀與生長(zhǎng)環(huán)境呈正相關(guān)；花柱、花絲長(zhǎng)度與緯度及海拔呈負(fù)相關(guān)，而株高、莖粗、鱗莖最寬直徑與海拔呈正相關(guān)，莖粗、鱗莖最寬直徑與緯度呈負(fù)相關(guān)，株高與緯度呈微弱的正相關(guān)，大部分相關(guān)性未達(dá)顯著性，僅花絲長(zhǎng)度與經(jīng)度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，表明地理因素對(duì)大部分表型性狀無(wú)決定性影響。

表3表型性狀與地理環(huán)境相關(guān)性分析

注：“*”表示顯著相關(guān)。

2.3 表型聚類(lèi)分析

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)遺傳進(jìn)化距離L=2時(shí)，野生山丹9個(gè)居群中除SD1、SD3、SD8為3個(gè)獨(dú)立居群外，可以將其他居群分為1個(gè)大類(lèi)，其中居群SD3、SD8生長(zhǎng)環(huán)境不同，但海拔差異相對(duì)較??；在分為1大類(lèi)的6個(gè)居群中，居群SD5與其他5個(gè)居群生長(zhǎng)環(huán)境有明顯差別，這可能是由于山丹在秦嶺地區(qū)的遷徙經(jīng)歷海拔的變化，而遷徙線路環(huán)境的變化又造成山丹分布的生態(tài)多樣性，同時(shí)，在遷徙過(guò)程中，也造成相對(duì)獨(dú)立生態(tài)居群的產(chǎn)生。

2.4 ISSR多態(tài)性分析

由圖2可見(jiàn)，從25條引物中篩選出的3條引物用于PCR擴(kuò)增，條帶數(shù)多且清晰。由表4可見(jiàn)，3條引物擴(kuò)增片段的多態(tài)性比例平均值分別為44.1%、40.3%、49.0%，引物擴(kuò)增多態(tài)性相對(duì)較低；不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性存在差異，說(shuō)明山丹材料遺傳背景具有一定的復(fù)雜性；所有樣品共檢測(cè)到522個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)235個(gè)，多態(tài)性比例為45.0%；3條引物居群內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)比例在36.5%～55.2%之間，9個(gè)居群中SD1遺傳多樣性水平相對(duì)最高，SD4遺傳多樣性水平相對(duì)最低。

2.5 ISSR分子標(biāo)記聚類(lèi)分析

由圖3可見(jiàn)，9個(gè)山丹居群根據(jù)ISSR標(biāo)記結(jié)果可聚分為2個(gè)大類(lèi)，居群SD1、SD3、SD6、SD8表現(xiàn)為相對(duì)獨(dú)立的居群，居群SD6與SD4、SD5的親緣關(guān)系相對(duì)更近，SD8與SD2、SD7、SD9的親緣關(guān)系相對(duì)更近。結(jié)合地理因子分析發(fā)現(xiàn)，山丹多樣性變化的主要原因是海拔的改變，其次是隨經(jīng)緯度的改變而不同，但表型性狀與地理因子的相關(guān)性不顯著。

表43條引物的ISSR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

秦嶺地區(qū)山丹居群大多數(shù)材料能夠依據(jù)地理來(lái)源相對(duì)集中地聚在一類(lèi)，如分別來(lái)自佛坪縣(SD2)、戶縣東澇峪(SD6)的山丹居群海拔相近，分別來(lái)自長(zhǎng)安區(qū)大峪(SD4)、太白縣(SD5)、秦嶺祥峪(SD7)、商洛縣西柿溝(SD9)的4個(gè)居群緯度相近，且均分布在高海拔地區(qū)。同一類(lèi)中居群有地理因子相差較大的，如SD4、SD9這2個(gè)居群的經(jīng)度與SD5居群相差相對(duì)較遠(yuǎn)，這可能是起源相同的群體生長(zhǎng)環(huán)境不同造成的。ISSR聚類(lèi)分析結(jié)果表明，山丹居群聚類(lèi)與地理分布的關(guān)系不很明顯，這與葛新新等的研究結(jié)果[9]較為一致，這種相關(guān)性的不顯著可能是由于采集地基本在秦嶺附近，采樣區(qū)域經(jīng)緯度變化幅度有限，生態(tài)環(huán)境差異對(duì)遺傳變異影響相對(duì)較小，有限的范圍可能造成較多的基因交流，另外，對(duì)小生境的記錄欠缺及利用鱗莖最寬直徑進(jìn)行ISSR標(biāo)記可能技術(shù)不完善，都會(huì)造成這種結(jié)果。不過(guò)，山丹表型性狀與地理因子有一定的相關(guān)性，特別是花絲長(zhǎng)度與經(jīng)度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明按經(jīng)度分布可能是山丹的一條遷徙路線。ISSR聚類(lèi)結(jié)果表明，居群SD7與SD9親緣關(guān)系相對(duì)較近，這兩者在地理環(huán)境因素上比較相似，結(jié)合地理因子可以推斷，秦嶺地區(qū)山丹變異的首要因素可能是海拔的變化。

秦嶺地區(qū)山丹資源豐富，能為我國(guó)山丹的育種栽培、種質(zhì)改良創(chuàng)新提供大量原始材料，對(duì)這些野生山丹資源進(jìn)行調(diào)查、收集和保存，能為將來(lái)秦巴山區(qū)山丹百合資源的分類(lèi)提供依據(jù)，對(duì)山丹的引種保護(hù)及馴化栽培起到指導(dǎo)作用。當(dāng)前，有不少百合研究工作者對(duì)秦嶺地區(qū)山丹資源進(jìn)行了相關(guān)調(diào)查與收集，但對(duì)遺傳等問(wèn)題未做深入研究，有的僅單獨(dú)運(yùn)用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)歸類(lèi)法或ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，缺少對(duì)2種方法的綜合運(yùn)用。本研究綜合利用形態(tài)學(xué)歸類(lèi)法和ISSR分子標(biāo)記這2種方法，能更完善地解釋秦嶺地區(qū)山丹資源的遺傳特性，可為將來(lái)秦巴山區(qū)的百合資源調(diào)查研究及開(kāi)發(fā)利用提供重要依據(jù)。

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