劉曉嵐， 田兆豐， 李永丹

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京100193； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097)

乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)，變構(gòu)乙酰膽堿酯酶是昆蟲對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要原因[1-8]。最早于希臘發(fā)現(xiàn)桃蚜的乙酰膽堿酯酶變構(gòu)，隨后在日本、美洲及歐洲部分地區(qū)也有類似報(bào)道[9-13]。

監(jiān)測(cè)桃蚜抗藥性主要從室內(nèi)毒力測(cè)定、生物化學(xué)測(cè)定及分子水平檢測(cè)等3個(gè)方面進(jìn)行，分子水平檢測(cè)是了解桃蚜田間種群抗藥性的重要手段[14-15]。昆蟲抗藥性的形成是藥劑長(zhǎng)期對(duì)昆蟲基因選擇的過程，昆蟲抗性基因的研究也是研究昆蟲抗藥性的重要部分[16-15]。大量使用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑導(dǎo)致各地桃蚜對(duì)這2種藥劑分別產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[18-21]，1994年Moores等克隆了野生型桃蚜乙酰膽堿酯酶基因，公布了敏感型乙酰膽堿酯酶基因[9-10]，比較敏感與抗性桃蚜種群ace1和ace2的cDNA編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)，二者乙酰膽堿酯酶基因在活性中心存在氨基酸變異(S431F)，并推測(cè)該突變與桃蚜對(duì)抗蚜威抗性相關(guān)[22]。本研究克隆與桃蚜抗藥性有關(guān)的乙酰膽堿酯酶基因ace2全長(zhǎng)并進(jìn)行注冊(cè)，豐富了基因GenBank。對(duì)2015、2016年采自我國(guó)多地區(qū)的桃蚜田間種群進(jìn)行乙酰膽堿酯酶基因的突變(S431F)檢測(cè)及突變頻率的統(tǒng)計(jì)，為了解我國(guó)各地桃蚜乙酰膽堿酯酶基因變異及抗藥性情況提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 供試?yán)ハx采集與飼養(yǎng)

于2014年在河北省定州市大岳鎮(zhèn)的溫室菜田采集用于乙酰膽堿酯酶基因cDNA克隆的桃蚜敏感種群，在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理毒理實(shí)驗(yàn)室針對(duì)抗蚜威反選育30代以上，致死中濃度(lethal concentration 50，簡(jiǎn)稱LC50)為98.17 mg/L。

乙酰膽堿酯酶基因突變頻率檢測(cè)供試桃蚜種群分別于2015年和2016年的5—11月采自我國(guó)河北、遼寧、江蘇、青海等多個(gè)地區(qū)的田間或溫室，在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理毒理實(shí)驗(yàn)室采用蛭石培育的蘿卜苗飼養(yǎng)，溫度為23～25 ℃，相對(duì)濕度為60%，光—暗周期為16 h―8 h，均一化飼養(yǎng)1代以上用于生物測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)試劑

LaTaq聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA回收試劑盒、dNTP Mixture、rTaq聚合酶、DNA Marker DL2000、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)、載體pGEM-T easy連接試劑盒等，購(gòu)自日本TaKaRa公司、美國(guó)Promega公司；Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DNA快速回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自博邁德生物技術(shù)公司。

1.3 主要試驗(yàn)儀器

5417C/R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、PCR儀均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；mini-sub cell GT型電泳槽、power/PAC 3000型電泳儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；紫外成像儀購(gòu)自Kodar公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 乙酰膽堿酯酶基因(ace1、ace2)克隆

2.1.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)桃蚜乙酰膽堿酯酶基因(ace1)序列(GenBank：AF287291.1)、桃蚜乙酰膽堿酯酶基因(ace2)不完全序列(GenBank：AY147797.1缺失3′端182 bp)，Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增我國(guó)桃蚜ace1全長(zhǎng)和ace2已知片段；采用cDNA末端快速克隆技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends，簡(jiǎn)稱RACE)擴(kuò)增得到ace2基因3′端，經(jīng)拼接得到ace2基因全長(zhǎng)序列，引物序列見表1，引物均由Invitrogen公司合成。

表1乙酰膽堿酯酶基因(ace1、ace2)cDNA編碼區(qū)克隆引物

2.1.2 總RNA的提取 總RNA的提取按Trizol提取試劑盒說明書操作。取約0.3 mL無翅成蚜，加入約1 mL Trizol，充分勻漿；加三氯甲烷振蕩、靜置后離心；上清液加異丙醇脫水離心，總RNA沉淀；RNA沉淀以75%乙醇清洗2次，干燥后加20 μL無酶水，溶解；置于-80 ℃條件下保存；用微量分光光度計(jì)測(cè)定所提取總RNA的濃度。

2.1.3 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，操作步驟參照說明書。無酶PCR管加總RNA(<1 μg/μL)、Oligo(dT)12～18、RNase free H2O，在70 ℃條件下保溫10 min，迅速冰浴。加5×M-MLV buffer、 dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RNase M-MLV、RNase free H2O在 42 ℃ 條件下保溫1 h，70 ℃條件下終止反應(yīng)，冰上冷卻，-20 ℃ 條件下保存?zhèn)溆?。用微量分光光度?jì)測(cè)定cDNA濃度。

2.1.4 PCR擴(kuò)增 PCR管加入10×PCR buffer、dNTP Mixture、Sense primer、Anti-sense primer、cDNA、LaTaqDNA polymerase、ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳紫外凝膠成像儀檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.1.4 DNA回收、連接及轉(zhuǎn)化 回收DNA條帶，加入膠液溶解；吸附柱回收。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收效率，回收產(chǎn)物置于-20 ℃條件下備用。PCR純化產(chǎn)物與PGEM-T easy載體連接。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。LB(lysogeny broth；含氨芐青霉素、40 μL的X-gal和4 μL的IPTG)培養(yǎng)基平皿涂布菌液，倒置37 ℃條件下培養(yǎng)；藍(lán)白斑篩選，挑白斑單菌落到液體LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)，振蕩培養(yǎng)18 h。PCR檢測(cè)目的cDNA。

2.1.5ace2基因3′末端快速擴(kuò)增 采用Clontech公司RACE反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明書的步驟進(jìn)行操作。

PCR管I中生成的反應(yīng)體系：2 μL 5×First-Stand buffer、1 μL DTT(Dithiothreitol)、1 μL dNTP Mix、0.25 μL RNase抑制劑、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶、共5.25 μL，備用。PCR管Ⅱ中生成如下反應(yīng)體系：1 μL總RNA模板、1 μL 3′-RACE CDS Primer A、2.75 μL RNase free H2O、共4.75 μL，置于 72 ℃，3 min；42 ℃，2 min。將PCR管Ⅰ反應(yīng)體系加入PCR管Ⅱ中，總體系10 μL置于42℃，90 min；70 ℃，10 min。產(chǎn)物為3′-RACE-Ready cDNA。

Outer-PCR擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×Advantage 2 PCR buffer、1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L each)、1 μL 3′RACE UPM (Universal Primer A Mix)、1 μL 3′RACE Anti-ense primer(ace2)、1 μL 3′-RACE-Ready cDNA、0.5 μL 50×Advantage 2 Plymerase Mix、18 μL PCR-Grade Water，共 25 μL，PCR(94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃繼續(xù)延伸10 min)擴(kuò)增。

1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。若無目的擴(kuò)增產(chǎn)物可以O(shè)uter-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，引物3′RACE NUP、3′RACE Nested primer(ace2)進(jìn)行Inner-PCR反應(yīng)PCR。產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化及菌液檢測(cè)同“2.1.4”節(jié)。

2.2 乙酰膽堿酯酶基因突變頻率檢測(cè)

采用DNAVzol試劑盒提取單頭無翅成蚜DNA。將2015、 2016年采自我國(guó)河北、遼寧、江蘇、青海等多個(gè)地區(qū)的桃蚜田間種群，各提取30個(gè)有效DNA。

選取健康單頭無翅成蚜加入20 μL DNAVzol，充分研磨；離心，取上清液，加無水乙醇脫水沉淀，75%乙醇漂洗2次，DNA干燥后加適量雙蒸水溶解，瓊脂糖電泳檢測(cè)濃度。

根據(jù)桃蚜乙酰膽堿酯酶基因(ace2)序列(GenBank：AY147797.1)，Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)S431F附近上下游引物(sense Primer TTTCTGGGTCATTTGGGCTG；Anti-sense Primer AGGCGAATAGTTCAACAATG)見圖1，引物由Invitrogen公司合成。

以提取的各田間種群DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增條帶(圖2)。將清晰的單一條帶樣品送于Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析及作圖采用SigmaPlot 10.0軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 序列分析

克隆得到的ace1序列與NCBI中序列(GenBank：AF287291.1)進(jìn)行比對(duì)后可完全匹配，ace1開放閱讀框架(open reading frame，簡(jiǎn)稱ORF)全長(zhǎng)為1 995 bp，編碼665個(gè)氨基酸。

采用cDNA末端快速克隆技術(shù)(RACE)根據(jù)NCBI中ace2片段序列(GenBank：AY147797.1ace2基因序列缺失3′端182 bp)得ace2基因3′端(圖3)，拼接后得到ace2基因ORF全長(zhǎng)序列，ORF全長(zhǎng)為2 022 bp，編碼674個(gè)氨基酸，ace2全長(zhǎng)序列已提交NCBI(GeneBank：KJ561353)。

設(shè)計(jì)ace2全長(zhǎng)引物，擴(kuò)增桃蚜敏感品系ace2基因(圖2)。

敏感種群乙酰膽堿酯酶基因(ace2)序列與NCBI中序列(GenBank：AY147797.1)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，4個(gè)核苷酸序列發(fā)生突變，其中2個(gè)為無義突變(GCA-GCG、GTG-GTA)，另外2個(gè)為有義突變(TTA-TCA、TCA-TTT)，氨基酸55位的亮氨酸變?yōu)榻z氨酸(L55S)及431位的絲氨酸變?yōu)楸奖彼?S431F)(圖4)，其中S431F已報(bào)道與桃蚜不敏感AChE抗性有關(guān)[22]。

3.2 2015、2016年桃蚜田間種群乙酰膽堿酯酶基因突變頻率

2015年我國(guó)桃蚜S431F突變均已達(dá)到較高水平，在檢測(cè)的15個(gè)種群中，有10個(gè)種群被檢測(cè)個(gè)體達(dá)到100%突變，另外5個(gè)種群突變頻率也在90%左右(圖5)。其中，河北寬城種群突變頻率最低，為86.67%，其次為遼寧大連種群，突變頻率為90.00%，這與各種群抗蚜威抗性生物測(cè)定及乙酰膽堿酯酶對(duì)抗蚜威敏感度測(cè)定結(jié)果(待發(fā)表)相一致，其他各地種群間突變頻率不存在顯著差異。

在2016年檢測(cè)的16個(gè)種群中，有11個(gè)種群S431F突變頻率達(dá)到100%，另外5個(gè)種群突變頻率也在90%左右(圖6)。其中，河北康保、上海金山和四川井研種群突變頻率較低，依次為86.67%、86.67%、93.55%，與生物測(cè)定、敏感度測(cè)定結(jié)果(待發(fā)表)基本一致。其他各種群間突變頻率也不存在明顯差異，說明與對(duì)抗蚜威生物測(cè)定及乙酰膽堿酯酶敏感度測(cè)定結(jié)果相關(guān)性較低。

3.3 乙酰膽堿酯酶突變頻率與抗藥性關(guān)系的驗(yàn)證

為驗(yàn)證乙酰膽堿酯酶基因突變與抗蚜威抗性的關(guān)系，以抗蚜威LC10、LC50、LC80處理篩選的敏感品系桃蚜種群，ace2基因S431F突變個(gè)體數(shù)及總檢測(cè)數(shù)見圖7，隨著處理藥劑濃度的升高，發(fā)生突變的個(gè)體頻率也隨之升高(圖8)。

4 討論

乙酰膽堿酯酶(AChE)基因包括ace1、ace2，在AChE活性中心影響AChE催化活性及對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類藥劑抗性發(fā)展中，ace2比ace1作用更顯著[22]。本試驗(yàn)克隆的敏感品系桃蚜(筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選)AChE基因ace1、ace2經(jīng)比對(duì)，ace1序列與NCBI中序列(GenBank：AF287291.1)可完全匹配。ace2序列與NCBI中序列(GenBank：AY147797.1)對(duì)比發(fā)現(xiàn)有2個(gè)氨基酸有義突變(L55S、S431F)，可見篩選的敏感品系桃蚜(LC50為98.17 mg/L)也存在AChE基因突變，這與2015年河北寬城種群(LC50為76.37 mg/L)對(duì)抗蚜威抗性比敏感種群低這一生測(cè)結(jié)果(待發(fā)表) 一致。同時(shí)進(jìn)一步確定ace2與對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類藥劑抗性相關(guān)。

2015、2016年分別檢測(cè)出15、16個(gè)桃蚜田間種群乙酰膽堿酯酶基因突變(S431F)頻率，分別有超過66%和超過68%的種群被檢個(gè)體100%發(fā)生突變，說明我國(guó)大部分地區(qū)桃蚜基因突變頻率已達(dá)到較高水平，這與2015、2016年種群對(duì)抗蚜威產(chǎn)生高水抗性結(jié)果一致。但乙酰膽堿酯酶對(duì)抗蚜威抗性除S431F突變外，可能還有其他原因如檢測(cè)到的ace2 L55S突變等，還有待于進(jìn)一步研究。

抗蚜威敏感品系3個(gè)不同生測(cè)劑量(LC10、LC50、LC80)處理桃蚜混合種群，隨著處理劑量的增高，存活桃蚜個(gè)體乙酰膽堿酯酶基因S431F突變頻率也隨之增高，結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了對(duì)抗蚜威產(chǎn)生抗性與乙酰膽堿酯酶基因S431F突變相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fournier D，Mutero A. Modification of acetylcholinesterase as a mechanism of resistance to insecticides[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Pharmacology，Toxicology and Endocrinology，1994，108(1)：19-31.

[2]Fournier D. Mutations of acetylcholinesterase which confer insecticide resistance in insect populations[J]. Chemico-Biological Interactions，2005，157/158：257-261.

[3]李顯春，王蔭長(zhǎng). 昆蟲抗藥性靶標(biāo)不敏感機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，1998，41(4)：417-422.

[4]林建國(guó)，張傳溪，唐振華. 與昆蟲抗藥性相關(guān)的乙酰膽堿酯酶基因突變研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，7(1)：1 - 6.

[5]Li F，Han Z J. Mutations in acetylcholinesterase associated with insecticide resistance in the cotton aphid，AphisgossypiiGlover[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2004，34(4)：397-405.

[6]Chen Z，Newcomb R，F(xiàn)orbes E，et al. The acetylcholinesterase gene and organophosphorus resistance in the Australian sheep blowfly，Luciliacuprina[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2001，31(8)：805-816.

[7]Anazawa Y，Tomita T，Aiki Y，et al. Sequence of a cDNA encoding acetylcholinesterase from susceptible and resistant two-spotted spider mite，Tetranychusurticae[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2003，33(5)：509 - 514.

[8]Russell R J，Claudianos C，Campbell P M，et al. Two major classes of target site insensitivity mutations confer resistance to organophosphate and carbamate insecticides[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2004，79(3)：84 - 93.

[9]Moores G D，Devine G J，Devonshire A L. Insecticide-insensitive acetylcholinesterase can enhance esterase-based resistance inMyzuspersicaeandMyzusnicotianae[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，1994，49(2)：114-120.

[10]Moores G D，Devine G J，Devonshire A L. Insecticide resistance due to insensitive acetylcholinesterase inMyzuspersicaeandMyzusnicotianae[C]// Brighton Crop Protection Conference：pests and diseases. England：British Crop Protection Council，1994，3(3)：413-418.

[11]Foster S P，Denholm I，Harling Z K，et al. Intensification of insecticide resistance in UK field populations of the peach-potato aphid，Myzuspersicae(Hemiptera：Aphididae) in 1996[J]. Bulletin of Entomological Research，1998，88(2)：127-130.

[12]Foster S P，Devonshire A L. Field-simulator study of insecticide resistance conferred by esterase-，MACE- and kdr-based mechanisms in the peach-potato aphid，Myzuspersicae(Sulzer)[J]. Pesticide Management Science，1999，55(8)：810-814.

[13]Srigiriraju L，Semtner P J，Anderson T D，et al. Monitoring for MACE resistance in the tobacco-adapted form of the green peach aphid，Myzuspersicae(Sulzer)(Hemiptera：Aphididae) in the eastern United States[J]. Crop protection，2010，29(2)：197-202.

[14]Mutero A，Pralavorio M，Bride J M，et al. Resistance-associated point mutations in insecticide-insensitive acetylcholinesterase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1994，91(13)：5922-5926.

[15]Devonshire A L，Byrne F J，Moores G D，et al. Biochemical and molecular characterisation of insecticide insensitive acetylcholinesterase in resistant insects[M]// Doctor B P，Taylor P，Quinn D M，et al. Structure and function of cholinesterases and related proteins. Boston：Springer，1998：491-496.

[16]Field L M，Anderson A P，Denholm L，et al. Use of biochemical and DNA diagnostics for characterising multiple mechanisms of insecticide resistance in the peach-potato aphid，Myzuspersicae(Sulzer)[J]. PesticideManagementScience，1997，51(3)：283-289.

[17]柏 建，周小毛，方 勇. 桃蚜抗藥性監(jiān)測(cè)[J]. 農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2009(6)：27-29.

[18]Foster S P，Denholm I，Devonshire A L. Field-simulator studies of insecticide resistance to dimethylcarbamates and pyrethroids conferred by metabolic- and target site-based mechanisms in peach-potato aphids，Myzuspersicae(Hemiptera：Aphididae)[J]. Pest Management Science，2002，58(8)：811-816.

[19]Sawicki R M，Rice A D. Response of susceptible and resistant peach-potato aphidsMyzuspersicae(Sulzer) to insecticides in leaf-dip bioassays[J]. Pesticide Management Science，1978，9(6)：513-516.

[20]宮亞軍，王澤華，石寶才，等，北京地區(qū)不同桃蚜種群的抗藥性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(21)：4385-4394.

[21]顧春波，王開運(yùn)，辛海軍，等. ，我國(guó)中部煙區(qū)(桃)蚜[Myzuspersicae(Sulzer)]的抗藥性研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，38(1)：11-14.

[22]Nabeshima T，Kozaki T，Tomita T，et al.，An amino acid substitution on the second acetylcholinesterase in the pirimicarb-resistant strains of the peach potato aphid，Myzuspersicae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，307(1)：15-22.