吳 靜,陳 瑛,賈桂珍

(塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(Listeria mohocytogehes,L.mohocytogehes)是一種重要的人獸共患病病原菌,自1926年Murray等[1]從家兔體內(nèi)首次分離到本病原以來,它已呈世界性分布,在包括人類在內(nèi)的40多種哺乳動物、20多種飛禽類和部分水生動物均可分離到該菌。國內(nèi)有關(guān)動物李氏桿菌病例的報道很多,波及全國10個省市,涉及動物有綿羊、山羊、牛、豬、雞、兔、鴨、鵝、鹿、鸚鵡、北極狐等,平均死亡率達(dá)32%以上,對畜牧業(yè)造成了較大的危害。在動物中綿羊?qū)Ξa(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的易感性最高,其感染多與青貯飼料相關(guān)[2]。目前,WHO已將產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌定為20世紀(jì)90年代四大食源性疾病致病菌[3]。中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物研究所徐建國博士也將其列為21世紀(jì)對中國人衛(wèi)生健康具有重大影響的12種病原微生物之一[4],對人類健康造成極大威脅。

本試驗以阿拉爾周邊綿羊為研究對象,無菌采集綿羊的鼻液,通過傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定技術(shù),進(jìn)行產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的分離鑒定,收集產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的資源;并對鑒定菌株通過小鼠實(shí)驗測得單核細(xì)胞李氏桿菌的致病性。調(diào)查結(jié)果為該地區(qū)動物性食品安全評估及李氏桿菌的監(jiān)測提供參考和科學(xué)數(shù)據(jù)。對于李氏桿菌病的預(yù)防、診斷和治療新疆地區(qū)李氏桿菌病提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗對象 阿拉爾周邊綿羊。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)、PALCAM 瓊脂、LB肉湯,均購自杭州天和微生物試劑有限公司;血瓊脂平板、糖發(fā)酵試驗培養(yǎng)基;木糖、七葉苷由塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院微生物生物實(shí)驗室提供;1%鹽酸吖啶黃、1%萘啶酮酸鈉鹽、PALCAM選擇性添加劑,購自杭州天和微生物試劑有限公司;甲基紅、V-P試驗培養(yǎng)基自制;甲基紅指示劑、V-P試驗指示劑、革蘭染液由塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院微生物生物實(shí)驗室提供。

1.1.3 試驗動物 體重18～20 g小鼠10只由塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗站提供。

1.1.4 主要儀器 立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠,型號:LDZX-50KB);數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn),型號:HPX-9272MBE);潔凈工作臺(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn),型號:SW-CJ-ZF);電子顯微鏡(萊卡制造)、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司,型號:DK-S26);冰箱、電子天平、搖床、三角瓶、無菌平皿、試管、1 mL無菌注射器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集及預(yù)處理 以無菌操作用滅菌棉簽在綿羊鼻腔中刮取分泌物,共采集樣品120份,其中9團(tuán)采集60份,10團(tuán)采集60份。

1.2.2 增菌 參照國標(biāo)GB/T4789.30-2010法將采集的120份樣品,分別放入5 mL LB 1增菌液中,恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(30℃ ±1℃,24 h),然后用移液槍移取0.1 mL,轉(zhuǎn)種于10 mL LB 2增菌液內(nèi),放入搖床30℃ ±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

1.2.3 劃線分離培養(yǎng) 采用三區(qū)劃線法將LB 2增菌液劃線接種于PALCAM瓊脂平板,放入恒溫培養(yǎng)箱36℃ ±1℃培養(yǎng)24 h～48 h,觀察各個平板上生長的菌落。

1.2.4 革蘭染色 挑取典型菌落涂片,革蘭染色鏡檢。根據(jù)菌體形態(tài)及染色特性初步判定,并將其進(jìn)一步純化培養(yǎng)。通過鏡檢挑取形態(tài)特征和排列與產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌相似的菌落劃線接種與0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)斜面,于恒溫培養(yǎng)箱30℃ ±1℃培養(yǎng)24 h～48 h,即為純培養(yǎng)。

1.2.5 生化鑒定 將純培養(yǎng)物分別接種于M.R.、V-P、木糖、鼠李糖、甘露醇、七葉苷、葡萄糖、麥芽糖等培養(yǎng)基中,于36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.6 小鼠毒力試驗 從已鑒定為產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌分離菌株試管斜面上挑取1接種環(huán)的細(xì)菌接種于含5 mL LB的試管中,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,取0.1 mL接種0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)斜面上培養(yǎng)8 h～12 h后,用L棒刮下菌苔,用5 mL滅菌的生理鹽水稀釋與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?。并根?jù)比濁管所含的細(xì)菌濃度換算出所需的菌懸液濃度,即每毫升含1.0×1010CFU/mL的菌懸液,所得出的就是測試菌液。取此菌懸液進(jìn)行小鼠腹腔注射,每株菌注射2只,每只注射0.5 mL,觀察小鼠發(fā)病及死亡情況,并設(shè)置對照組,對照組小鼠注射0.5 mL滅菌生理鹽水。

2 試驗結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 在120份樣品中有11份樣品在PALCAM瓊脂培養(yǎng)基長出了疑似產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的特征性菌落,菌落為圓形灰綠色,大小2～3 mm,有些菌落有黑色凹陷。

2.2 革蘭氏染色結(jié)果 對11份樣品中的典型菌落進(jìn)行革蘭染色,染色鏡檢顯示,有9份樣品中染色結(jié)果符合產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌,產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌為革蘭陽性短小桿菌,大小為 0.4～0.5 μm ×0.5～2 μm,兩端鈍圓,呈“V”字形或“ Y”字形,單在排列。通過分離培養(yǎng)和染色鏡檢,得到9株疑似產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的純培養(yǎng)物。

2.3 生化鑒定結(jié)果 9株菌的生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的生化鑒定

通過生化鑒定,9株菌中有4株菌符合產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌,分別是1,2,5號和8號菌株;產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌M.R.、V-P試驗陽性,能發(fā)酵麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖和七葉苷,不發(fā)酵甘露醇和木糖。

2.4 小鼠毒力試驗結(jié)果 小鼠接種1號、2號、5號、8號產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌6～8 h后表現(xiàn)食欲不振,精神委靡,被毛雜亂,運(yùn)動遲緩,呼吸困難。其中1號、2號表現(xiàn)為身體向一側(cè)傾斜,后腿拖拉,共濟(jì)失調(diào),最后死亡。剖檢死亡的小鼠可見胸腔積液,肺臟腫大、邊緣鈍圓,有出血斑,肝臟腫大,呈紫紅色。

3 討論

產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌病是由產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌引起的一種人獸共患病,其中羊最為敏感。產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌作為一種重要的病原菌,廣泛存在于自然界,由于產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌對各種惡劣環(huán)境條件有著較強(qiáng)的耐受性,使得其較易處于食物鏈的每一個環(huán)節(jié)而導(dǎo)致人和動物發(fā)病,使得各種食品受到污染,最終嚴(yán)重威脅人類的健康[5]。本試驗通過傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定技術(shù)從阿拉爾市周邊規(guī)?；B(yǎng)羊場采集的樣本中分離出4株產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌,且4株產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌對小鼠均有致病性,可見產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌為阿拉爾市規(guī)模化養(yǎng)羊場的主要病原菌之一。通過阿拉爾市周邊規(guī)?；B(yǎng)羊場產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌帶菌情況的調(diào)查,為阿拉爾市規(guī)模化養(yǎng)羊場羊病防治提供理論依據(jù)。

從新疆阿拉爾周邊樣品的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌調(diào)查結(jié)果來看,120份樣品中有4份樣品為陽性,陽性率為3.3%,與王一明等調(diào)查的結(jié)果基本相似,陽性率為4.0%[6]。此調(diào)查采集都是新鮮樣品,在生產(chǎn)線上第一時間采集,樣品受環(huán)境污染機(jī)率較小,可以真實(shí)反映羊群的帶菌情況,但是還需對分離鑒定菌株進(jìn)行分子水平的毒力基因檢測等。

產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌作為一種重要的食源性人獸共患性病原在過去的幾十年一直受到高度重視,相信隨著對單核細(xì)胞李氏桿菌的深人研究,我們會更加深人和全面地了解病原菌的致病機(jī)制,為更好地控制重大疾病提供依據(jù)。

4 結(jié)論

從阿拉爾市無菌操作采集羊鼻拭檢樣120份,其中4份樣品中分離并鑒定為產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌,帶菌率達(dá)3.3%。

對鑒定的4株進(jìn)行小鼠的致病性試驗,分離鑒定的4株產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌均引起小鼠發(fā)病,其中2株菌可使小鼠在感染后72 h內(nèi)死亡。調(diào)查結(jié)果為該地區(qū)動物性食品安全評估及產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的監(jiān)測提供參考和科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

[1] Murray E G D,Webb R A,Swann M B R.A disease of rabbits characterized by a large mononuclear leucocytosos,caused by a hitherto undescribed bacillus bacterium monocytogenes[J].J Pathol bacterial,1926,29:407-439.

[2] 楊霞,剡根強(qiáng),王靜梅,等.新疆部分地區(qū)綿羊及青貯飼草中單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志,2004,40(8):19-20.

[3] Membre J M,Kubaczka M,Dubois J,et al.Temperature effect on Listeria monocytogenes Growth in the event of Contamination of Cooked Pork Products[J].Food Prot,2004,67(3):463-469.

[4] 十二種病原微生物可能影響中國人的健康.www.biologic.cn2088.com,2002,04:05.

[5] 馬光強(qiáng),劉麗娟,文明,等.山羊源產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的分離與鑒定[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,37(3):33-38.

[6] 王一明,張海蘭,李靜,等.新疆部分地區(qū)綿羊及其環(huán)境中單核細(xì)胞增多性李氏桿菌分布狀況的調(diào)查[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2008,29(3):90-92.