鄭 康，郭晴晴，劉 學(xué)，邱雪梅，樊丹平，趙雨坤，呂愛平，何小鵑＊＊

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京 100700；2.香港浸會大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 香港；3.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 6100312）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性系統(tǒng)性關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的多關(guān)節(jié)自身免疫系統(tǒng)疾病，其基本病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜炎癥導(dǎo)致的關(guān)節(jié)滑膜異常增生、血管翳形成，軟骨和軟骨下骨質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)發(fā)生畸形和強(qiáng)直。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（Collageninduced arthritis，CIA）小鼠在臨床表現(xiàn)以及病理改變等方面與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有諸多相似之處，是目前用于研究RA最常用也是最理想的一種實(shí)驗(yàn)動物模型[1,2]。DBA/1小鼠作為CIA模型的“金標(biāo)準(zhǔn)”造模技術(shù)路線已十分成熟[3,4]。但隨著分子生物學(xué)及細(xì)胞工程新技術(shù)的發(fā)展，遺傳工程技術(shù)改造的基因工程小鼠已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究?；虼虬屑夹g(shù)下的轉(zhuǎn)基因小鼠多數(shù)使用C57BL/6小鼠而非DBA/1小鼠，但C57BL/6小鼠CIA造模發(fā)病率存在很大的不確定性[5]，因此對影響C57BL/6小鼠CIA造模發(fā)病率條件的篩選及方法優(yōu)化尤為重要。

1 試劑與動物

1.1 動物

C57BL/6小鼠50只，雌雄各半，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號碼：SCXK（京）2014－0004。在恒溫恒濕環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑

完全弗氏佐劑（Chondrex）、雞II型膠原（Chondrex）、蘇木素染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）、伊紅染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）、TNF-a、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒(eBioscience)。

2 方法

2.1 小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的制備

低溫冰水浴條件下，將雞Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑以1∶1等體積比例混合，攪拌乳化機(jī)乳化至滴水不溶狀態(tài)。充分乳化后2 h內(nèi)將乳劑與尾根部皮下注射，每只小鼠100 μL。與21天后加強(qiáng)免疫一次，相同方法注射每只小鼠50 μL[6]。

2.2 小鼠關(guān)節(jié)炎評分

小鼠造模發(fā)病后開始關(guān)節(jié)炎評分，每周兩次。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分=無紅腫；1分=小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分=趾關(guān)節(jié)和小趾關(guān)節(jié)腫脹；3分=踝關(guān)節(jié)以下部位腫脹；4分=整個足爪腫脹（包含踝關(guān)節(jié)）。每次記錄小鼠四肢的評分，累計(jì)最高評分為16分。

2.3 病理學(xué)觀察

第一次免疫49天后，將小鼠處死，分離小鼠發(fā)病關(guān)節(jié)后于4%多聚甲醛中固定48 h。固定后置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣，每日更換脫鈣液直至脫鈣完全。將脫鈣好的踝關(guān)節(jié)分別與濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后經(jīng)蘇木素-伊紅（H＆E）染色，中性樹膠封固后顯微鏡下觀察。

2.4 血清炎癥因子檢測

第一次免疫49天后，將小鼠處死并分離小鼠血清。參照訂購ELISA試劑盒說明書操作檢測小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，兩組間差異采用t檢驗(yàn)；多組間差異采用S-N-K的方差分析，分析前各組及組間進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠造模成功率與周齡的關(guān)系

由表1結(jié)果可見，相同膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎方法下，7周齡組小鼠造模成功率為20%；10周齡組造模成功率30%；11周齡組小鼠造模成功率30%；12周齡組小鼠造模成功率40%；14周齡組小鼠造模成功率為60%。使用GraphPad Prism 6將小鼠周齡與造模成功率做相關(guān)性分析，由圖一結(jié)果可見，小鼠造模成功率隨周齡增加，相關(guān)性分析結(jié)果為R2=0.8645。

表1 各周齡膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠造模成功率

圖1 膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠造模成功率與周齡關(guān)系

3.2 造模成功率與小鼠性別關(guān)系

造模成功率與小鼠性別關(guān)系由結(jié)果可見，雄性小鼠造模成功率為54%，雌性小鼠造模成功率46%，二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=25，P＞0.05）。

3.3 膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎評分及病理變化

圖3結(jié)果顯示膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠于第一次免疫28天后開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎臨床癥狀，隨時間推移，于第一次免疫40天后達(dá)到峰值。圖4結(jié)果A顯示膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠發(fā)病后踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，趾關(guān)節(jié)紅腫并發(fā)生明顯形態(tài)變化，正常小鼠（B）關(guān)節(jié)正常無變化，符合CIA造模后49天典型的關(guān)節(jié)炎癥狀。圖5關(guān)節(jié)病理結(jié)果顯示，CIA造模49天后小鼠關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)典型的關(guān)節(jié)炎病理癥狀，包括關(guān)節(jié)局部炎性細(xì)胞浸潤，骨破壞及血管翳形成，如箭頭所示。圖6結(jié)果顯示，CIA造模后小鼠血清炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α與正常組小鼠相比明顯升高（n=8；**，與正常小鼠Non-CIA相比，P＜0.01）。

圖2 造模成功率與小鼠性別關(guān)系

圖3 膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎評分

圖4 膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠大體特征

圖5 膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠病理特征（放大倍數(shù)：300倍）

圖6 膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠血清炎癥因子

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作為免疫系統(tǒng)疾病，其發(fā)病受到年齡影響[7-9]。本研究結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠CIA造模成功率受小鼠周齡變化的影響。隨著小鼠周齡的增加，CIA造模成功率逐漸提高。

研究表明，機(jī)體的免疫功能變化與機(jī)體免疫細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系[15,10]。而T細(xì)胞的分布及功能作為細(xì)胞免疫功能的核心[11,12]，又與年齡的變化的聯(lián)系密切[13]。有研究結(jié)果表明，T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)各種成分中對老化過程最敏感的成分,隨著年齡的增加，機(jī)體中T細(xì)胞功能首先發(fā)生變化[14,15]。隨著小鼠周齡的增加，小鼠中樞免疫器官T細(xì)胞活化功能和細(xì)胞免疫功能受到影響[15,16]，對外源性抗原免疫應(yīng)答逐漸增高[15,18,19]。因此，隨著小鼠周齡的增加，小鼠機(jī)體T細(xì)胞的功能受到影響，引起免疫反應(yīng)的敏感，從而可能導(dǎo)致CIA造模成功率的增加。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與這一預(yù)測相符，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

本研究中我們采用小鼠分別為7，10，11，12及14周齡，其中發(fā)病率最高小鼠為14周齡，且此周齡段小鼠[20]為成熟期小鼠，是CIA造模小鼠中常用周齡段小鼠。造模后小鼠臨床評分所顯示的腫脹程度、小鼠關(guān)節(jié)病理結(jié)果等均顯示為典型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠癥狀。這一結(jié)果也為選用C57BL/6小鼠開展類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)參考。

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