冀玉良，王依依

（商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛 726000）

土壤是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中主要的構(gòu)成要素之一，也是陸生生態(tài)系統(tǒng)的重要基礎，而土壤中的微生物又是土壤的重要生物因子[1-2]。土壤的微生物功能就是土壤生物群總生理活性的反映，通常用土壤呼吸作用強度來表示，即一定土壤表面在一定時間內(nèi)所放出的CO2量，它由土壤微生物在生命活動中所吸收的氧和釋放的CO2，以及它們在土壤中的擴散速度所決定。土壤呼吸能力不僅對土壤有機物的分解至關(guān)重要,而且呼吸釋放的CO2也是植物同化作用CO2的重要來源。因此，土壤呼吸強度是衡量土壤肥力的重要指標之一，與植物生長有著密切的關(guān)系[3-4]。中藥材種植中面臨的主要問題是病蟲害的連作障礙，盡管病蟲害的生物防治研究取得了很大進展，一些研究成果已得以推廣應用[5-6]，但目前中藥材生產(chǎn)中病蟲害防治主要依靠的還是農(nóng)藥[7-9]。當農(nóng)藥分解緩慢而又頻繁使用時,相當量的農(nóng)藥就會在一定時期內(nèi)殘留于土壤之中，對土壤微生物功能產(chǎn)生不良的影響[10-11]。甲基硫菌靈（商品名甲基托布津）、多菌靈和農(nóng)用鏈霉素是目前商洛中藥材種植中防治病蟲害普遍采用的3種農(nóng)藥，但有關(guān)3種農(nóng)藥對中藥材生長土壤呼吸功能的抑制的研究目前尚末見報道。通過本試驗研究，旨在揭示3種農(nóng)藥及其4種濃度對桔梗種植土壤微生物呼吸功能的抑制規(guī)律，尋找最佳的農(nóng)藥和合適的用藥劑量，為使用農(nóng)藥防治桔梗等中藥材病蟲害提供指導。

1 材料和方法

1.1 供試農(nóng)藥

選擇目前商洛市中藥材生產(chǎn)的病蟲害防治普遍使用的3種農(nóng)藥甲基硫菌靈、多菌靈和鏈霉素，從市場購得，3種農(nóng)藥分別按說明含量配成100、1000、10000、100000 mg·L－1的溶液。

1.2 供試土壤

土樣來自商洛天士力藥業(yè)集團的桔梗種植基地0～l5 cm深的耕作層土壤，采取五點采樣法，除去土塊等雜物，將五處土壤混在一起裝入無菌自封袋帶回實驗室，平攤在聚乙烯塑料布上，風干過40目篩，備用。

1.3 試驗方法

試驗于室內(nèi)模擬旱地條件進行，對土壤微生物呼吸強度的測定采取密閉直接吸收法，即將供試土壤置于密閉的玻璃瓶內(nèi)進行培養(yǎng)，同時放置NaOH溶液直接吸收微生物呼吸中所釋放出的CO2，再用準確標定的標準HCl滴定溶液中剩余的NaOH量，并由此計算出供試土壤微生物的呼吸能力。具體操作如圖1所示。

圖1 直接吸收法測定土壤吸收功能的培養(yǎng)瓶

分別稱取風干過篩的土樣30 g，置于小燒杯中，往土樣中加適量的無菌水（包括藥液容量在內(nèi)）濕潤，充分混勻，使其濕度接近旱地自然條件狀態(tài)，然后將盛土壤燒杯移至容量為1000 mL的廣口玻璃瓶內(nèi)（具蓋能密閉），為維持瓶內(nèi)濕度在瓶底倒入少量酸性水（按H2SO4：水=2:1的體積比）。將玻璃瓶移至25℃～28℃保溫箱內(nèi)先預培養(yǎng)，一周后取出盛土壤的燒杯，對土樣按4個濃度梯度處理，分別混入 100、1000、10000、100000 mg·L－1的每種藥液3 mL，使3種農(nóng)藥各處理按干土重計算含藥量分別為 10、100、1000、10000 mg·kg－1，同時以加3 mL蒸餾水代替農(nóng)藥作為對照，各處理充分混勻后放回培養(yǎng)瓶內(nèi)。另取50 mL小燒杯（內(nèi)盛經(jīng)標定的NaOH溶液10 mL）置于培養(yǎng)瓶中，用以吸收由土壤微生物呼吸作用所釋放出的CO2。玻璃瓶加蓋后移至保溫箱內(nèi)再培養(yǎng)，按期取出裝有NaOH溶液的小燒杯并立即用準確標定的0.1 mol·L－1HCl滴定燒杯中剩余的NaOH。 接著在玻璃瓶內(nèi)再換入盛有新的NaOH溶液的小燒杯，繼續(xù)按期培養(yǎng)，如此按期換液、培養(yǎng)和測定（1、3、5、7、9、14、19、24、29、34、40、46、52、58、64 d），不同處理的土壤微生物呼吸作用強度用100 g土壤的CO2表示，CO2計算公式為：

100 g土壤的CO2=（空白值—滴定值）×C×CO2摩爾質(zhì)量×100／土樣質(zhì)量（g）

式中：C 為標準 HCl濃度（mol·L－1），空白值為未吸收CO2的全部NaOH的標準HCl滴定值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 2016統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

圖2、圖3和圖4是根據(jù)不同劑量的甲基硫菌靈、多菌靈和鏈霉素對土壤進行處理后每一時間點所測得的CO2的曲線,圖中顯示了3種農(nóng)藥不同劑量處理對土壤呼吸影響的動態(tài)變化規(guī)律。

圖2 甲基硫菌靈不同劑量對土壤呼吸作用的影響

不同劑量的甲基硫菌靈處理土壤（見圖2），施藥后的第1天，測得的CO2基本上接近對照,但隨著時間的延長（從第3～46天），不同劑量的甲基硫菌靈處理土壤產(chǎn)生的CO2明顯低于對照，表明施藥對微生物的呼吸功能產(chǎn)生了明顯的抑制，至第46天后，各處理與對照開始逐步接近，說明農(nóng)藥對微生物的呼吸抑制逐漸降低。就不同處理的比較來看，呈現(xiàn)出高劑量的處理產(chǎn)生的CO2低于低劑量處理，如10 mg·kg－1劑量處理產(chǎn)生的CO2與對照很接近，至第5天和第7天的測定結(jié)果顯示產(chǎn)生的CO2還高于對照，這說明低劑量、短時間的施藥還能刺激和促進呼吸功能，但隨后則呈現(xiàn)出抑制作用。而 100、1000 mg·kg－1處理產(chǎn)生的CO2明顯降低，與對照相比達到P＜0.05的差異顯著性水平,10000 mg·kg－1劑量處理與對照相比達到P＜0.01的差異顯著性水平，即對土壤的呼吸功能產(chǎn)生顯著的影響。至第46天以后，各個處理與對照的差異變小，推測可能是微生物對農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性，或者是農(nóng)藥被微生物慢慢轉(zhuǎn)化和分解的緣故。

殺菌劑多菌靈對土壤微生物呼吸影響表現(xiàn)出和甲基硫菌靈基本相似的規(guī)律（見圖3），但在開始一段時間（1～24 d）低劑量和高劑量處理下產(chǎn)生的CO2與對照（CK）的差異均比甲基硫菌靈處理大，說明抑制作用明顯，10 mg·kg－1劑量處理 P＜0.05，在 100、1000、l0000 mg·kg－1劑量處理下均達到P＜0.01的顯著性水平。而且與甲基硫菌靈不同的是，多菌靈的各個處理在施藥后短期 (7 d內(nèi))呼吸作用降低的幅度更為明顯，如l0000 mg·kg－1多菌靈處理在第 3 天、 第 5 天、第7天產(chǎn)生的CO2分別是同一時期對照的70.67%、63.49%和 46.88%, 而 l0000 mg·kg－1甲基硫菌靈處理在第3天、第5天和第7天產(chǎn)生的CO2分別是同一時期對照的94.7%、85.7%和65.6%。另外多菌靈在施藥第7天以后，各個處理與對照的差異開始變小，表現(xiàn)出比甲基硫菌靈較早向?qū)φ战咏?，這說明相對甲基硫菌靈，多菌靈降低呼吸作用快，幅度也大，但抑制作用持續(xù)時間短，土壤呼吸功能恢復較快，推測這可能是土壤微生物對多菌靈更容易適應，或者是多菌靈更容易被土壤微生物轉(zhuǎn)化和分解的緣故。

圖3 多菌靈不同劑量對土壤呼吸作用的影響

圖4 鏈霉素不同劑量對土壤呼吸作用的影響

鏈霉素與甲基硫菌靈、多菌靈也表現(xiàn)出相似的規(guī)律（見圖4），無論是高劑量或低劑量的處理，多次測得的結(jié)果也均低于對照，但從總體上來說動態(tài)曲線比較平緩，顯示出降低呼吸作用的幅度比前兩種農(nóng)藥小，各劑量處理整個變化過程中基本上與對照保持同樣的趨勢。其中低劑量處理與對照相比不明顯，只是10000 mg·kg－1劑量處理與對照的差異顯著（P＜0.05），對土壤呼吸具有較大的抑制作用。另外在低劑量處理第5天也表現(xiàn)出對土壤呼吸功能有促進作用。

圖5 不同農(nóng)藥各處理培養(yǎng)期間釋放的CO2累計總量比較

從3種農(nóng)藥各處理組培養(yǎng)期間累計釋放的CO2總量統(tǒng)計來看（見圖 5）,與圖 2、圖 3、圖 4 也較為一致。從圖5中可以看出，在甲基硫菌靈和鏈霉素低劑量 10 mg·kg－1處理下產(chǎn)生的CO2總量與對照無明顯差異，多菌靈與對照在P＜0.05水平上有明顯差異（對照為660 mg/100 g干土，甲基硫菌靈、鏈霉素和多菌靈分別為632、631、604 mg/100 g干土）， 多菌靈在低劑量處理下產(chǎn)生的CO2總量與對照的差異與它在處理初期對呼吸作用抑制就比較大以及與整個過程與對照相差比較明顯相吻合。從CO2總量還反映出3種農(nóng)藥各個高劑量處理組與對照均有明顯的差距，達到P＜0.01的顯著性水平。同時圖 5 中也反映出高劑量的 1000、10000 mg·kg－1兩個處理之間無明顯的差異。

3 討論與結(jié)論

本研究采用密閉直接吸收法，研究了3種農(nóng)藥甲基硫菌靈、多菌靈和農(nóng)用鏈霉素及其4種濃度對桔梗種植土壤微生物呼吸功能的影響。總體來看，在3種農(nóng)藥作用下，土壤的微生物呼吸功能都受到了抑制，農(nóng)藥對土壤微生物呼吸功能的影響與其劑量直接相關(guān)，高濃度農(nóng)藥處理對微生物呼吸功能的抑制水平和抑制期均明顯超過低濃度，低濃度農(nóng)藥對土壤微生物呼吸功能的影響不大，即使產(chǎn)生一定的抑制作用，在短期內(nèi)也可以較快恢復；高濃度處理對土壤微生物呼吸功能的影響較為明顯，且恢復緩慢。

施藥濃度越大土壤受到的抑制也越大，隨著施藥時間的延長，各處理與對照的差異逐漸減小。同時因農(nóng)藥及其劑量的不同抑制作用的表現(xiàn)不完全相同。其中甲基硫菌靈對土壤微生物的呼吸的抑制持續(xù)時間長，施藥46 d后才開始向?qū)φ栈謴?。多菌靈對土壤微生物呼吸功能的抑制在施藥初期表現(xiàn)最為明顯，隨后抑制作用減輕，各劑量處理土壤的呼吸作用就逐漸向?qū)φ栈謴?。鏈霉素的抑制作用相對較小，各處理土壤整個過程和對照基本保持同樣的變化趨勢。另外，在施藥的初期低劑量的甲基硫菌靈和鏈霉素都表現(xiàn)出對土壤呼吸功能有刺激和促進作用，3種農(nóng)藥的高劑量處理和對照之間差異顯著，但各高劑量處理之間差異不顯著。

土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和關(guān)系極其復雜，農(nóng)藥對微生物呼吸功能的影響不僅與農(nóng)藥的毒性大小有關(guān)，也與微生物對農(nóng)藥的抗性和農(nóng)藥在土壤中是否容易被分解有關(guān)[10-12]。作用長的農(nóng)藥可能是由于微生物對其抵抗力差或其較難分解而存留期長的緣故，作用短的可能相反。本研究發(fā)現(xiàn)的多菌靈抑制作用初期明顯，第7天后減輕的結(jié)論，與徐瑞福[13]和向月琴[14]等的研究結(jié)果是一致的，同時也印證了甲基硫菌靈通常在分解中先要轉(zhuǎn)化為多菌靈而發(fā)揮作用，故甲基硫菌靈較多菌靈具有在土壤中作用時間長的性質(zhì)[15-16]。

農(nóng)藥對土壤微生物呼吸功能的影響與其劑量直接相關(guān)，高濃度農(nóng)藥處理對微生物呼吸功能的抑制水平和抑制期均明顯超過低濃度，低濃度農(nóng)藥對土壤微生物呼吸功能的影響不大，即使產(chǎn)生一定的抑制作用，在短期內(nèi)也可以較快恢復；高濃度處理對土壤微生物呼吸功能的影響較為明顯，且恢復緩慢。

本研究發(fā)現(xiàn)的3種農(nóng)藥不同的抑制作用表現(xiàn)提示人們，在桔梗種植的病蟲害防治中，不應一味選擇高劑量的施藥濃度，同時在達到同樣防治效果的前提下，應選擇對土壤抑制作用小，在土壤中存留時間短、易于分解的農(nóng)藥。根據(jù)本研究的結(jié)果，建議在桔梗病蟲害防治中考慮到農(nóng)藥殘留問題時選用多菌靈，因為多菌靈雖然開始大幅度地降低了呼吸作用，當然對有益微生物和病源微生物都會降低，但在快速殺菌后，土壤呼吸功能在短期內(nèi)就能恢復。其次在殺菌效果相同的情況下選用農(nóng)用鏈霉素，因為農(nóng)用鏈霉素降低呼吸作用的幅度相對較小，對土壤肥力損失較少。如果在有些情況下甲基硫菌靈防治效果好，濃度也不宜太大。土壤微生態(tài)是一個很復雜的系統(tǒng)，關(guān)于農(nóng)藥使用后到底是對那一類微生物影響最大，以及農(nóng)藥怎樣影響土壤微生物類群結(jié)構(gòu)、土壤酶活性與土壤肥力，還有待進一步研究。

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