孫吉鳳 何海濤

(長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春 130031)

黃芩素(BAI)是一種從傳統(tǒng)中藥黃芩的根中提取出的黃酮類化合物〔1，2〕，具有多種藥理作用，在臨床上應(yīng)用廣泛。BAI具有抗乳腺癌、食管癌、胃癌等作用〔3,4〕。喉癌是一種耳鼻咽喉頭頸部最常見的惡性腫瘤，絕大部分為鱗狀細(xì)胞癌。近年來，其發(fā)病率正在穩(wěn)步上升〔5,6〕。喉癌的臨床治療手段不斷被改進(jìn)，但其化療效果仍不理想。近年來從天然中藥資源中發(fā)掘有效抗癌藥物成為腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同濃度BAI通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料及方法

1.1細(xì)胞與試劑 人喉癌Hep-2 細(xì)胞購于ATCC公司。RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco/BRL公司產(chǎn)品。BAI、碘化丙啶(PI)購于Sigma公司，BAI用二甲基亞砜(DMSO)溶解后置于-20℃冰箱保存。半胱天冬酶(caspase)-3、caspase-9活性檢測試劑盒購于Chemicon公司。Bradford法蛋白含量檢測試劑盒購于凱基生物技術(shù)公司。Trizol 試劑購于美國Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自Takara公司，Bcl-2、Bax、GAPDH 基因引物由IDT公司合成。兔抗人caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax和GAPDH 單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自美國Cell Signaling公司，電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自Millipore公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 喉癌細(xì)胞株Hep-2于含5%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，全濕度，5%CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.3檢測細(xì)胞凋亡情況 采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，取對數(shù)期生長的Hep-2細(xì)胞以1×106細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)和同步化培養(yǎng)各24 h后，分別加入BAI(終濃度分別為20、40、80 μmol/L)，設(shè)5個平行樣，同時設(shè)陰性對照組。分別培養(yǎng)24、48 h后，經(jīng)4℃、1 000 r/min離心，制成單層細(xì)胞懸液，取1 ml濃度為5×105個/ml細(xì)胞，4℃的70%乙醇固定24 h，加入含RNaseA的PI染液，37℃避光染色30 min，300目細(xì)胞篩過濾，混勻，待測。

1.4檢測對caspase-3、9激活作用 按上述方法進(jìn)行培養(yǎng)，并加入BAI(終濃度為20、40、80、120 μmol/L)，同時設(shè)陰性對照組，設(shè)5個平行樣。分別培養(yǎng)24、48 h后，按照說明書(Chemicon公司)操作，消化收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取蛋白并Bradford法定量后，用分光光度法分別檢測各組OD405 nm(發(fā)色基團(tuán)在此波長處存在最大吸收峰)，由于不同活性的caspase-3及caspase-9對試劑盒提供的底物(序列特異性的多肽與發(fā)色基團(tuán)耦聯(lián)的復(fù)合物)的剪切能力與剪切下來的發(fā)色基團(tuán)量呈正比，最后計算 OD給藥組/OD陰性對照的倍數(shù)來表示 caspase-3、caspase-9活化程度。

1.5檢測Bcl-2和Bax mRNA表達(dá) 按上述方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并分別加入BAI(終濃度為20、40、80 μmol/L)，設(shè)陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h或48 h，分別用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，鑒定及定量后，用RT-PCR試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。合成引物終濃度為2 μmol/L，引物序列，Bcl-2上游：5′-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3′，下游：5′-AGGCACCCAGGGTGATGCA-A-3′，擴(kuò)增片段長度304 bp；Bax上游：5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，下游：5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′，擴(kuò)增片段長度257 bp；以GAPDH為內(nèi)參，擴(kuò)增片段長度為260 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)，Bcl-2為95℃ 5 min預(yù)變性，然后進(jìn)入94℃ 1 min、63℃ 30 s、72℃ 30 s的循環(huán)，之后延伸72℃ 10 min，共28個循環(huán)；Bax 利用梯度(TD)-PCR，先94℃，5 min預(yù)變性，然后進(jìn)入94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 2 min的循環(huán)，循環(huán)40次；最后以上個循環(huán)均進(jìn)入延伸72℃，10 min。內(nèi)參GAPDH用上述兩個條件均可。PCR產(chǎn)物電泳后用凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照并分析。

1.6檢測多種凋亡相關(guān)基因、蛋白酶及其酶原的蛋白表達(dá) 采用Western印跡法，按上述方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，加入終濃度為40 μmol/L的BAI，設(shè)陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48 h，按試劑說明書操作，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，裂解細(xì)胞提取蛋白，測定蛋白濃度。取含50 μg總蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，分段電壓分別為80、120 V。電泳后，進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，4℃100V，轉(zhuǎn)膜1 h；然后室溫?fù)u床封閉1.5 h；充分洗膜后，加稀釋的一抗(Bcl-2、Bax及GAPDH單克隆抗體按1∶200稀釋；caspase-3、caspase-9單克隆抗體按1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜；充分洗膜后，加稀釋的二抗(HRP-鼠抗兔IgG按1∶4 000)37℃孵育2 h，充分洗膜；按照ECL檢測試劑盒操作；利用BIO-RAD凝膠成像及分析系統(tǒng)對各蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BAI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 隨藥物濃度增加，24 h BAI組細(xì)胞凋亡率逐漸增加，48 h BAI組細(xì)胞凋亡率逐漸增加，同時相同濃度組間，48 h凋亡率顯著高于24 h，見表1；凋亡峰明顯，見圖1；各BAI組與陰性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率增加具有時間和濃度依賴性。

圖1 BAI組誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡

組別24h凋亡率48h凋亡率陰性對照組346±007360±037BAI組 20μmol/L1406±0161)1589±0221)2) 40μmol/L4169±0041)4434±0041)2) 80μmol/L6505±0041)7229±0041)2)

與陰性對照組比較：1)P<0.05；與24 h比較：2)P<0.05；下表同

2.2BAI激活caspase-3、9活性 隨藥物濃度增加，24 h BAI組caspase-3活性從陰性對照組的1.84倍增加到5.20倍；caspase-9活性從陰性對照組的1.53倍增加到3.74倍。48 h BAI組隨藥物濃度增加，caspase-3活性從陰性對照組的1.78倍增加到5.26倍；caspase-9活性從陰性對照組的1.83倍增加到4.75倍；各BAI組與陰性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時相同濃度組間，48 h caspase活性顯著高于24 h(P<0.05)，見表2。提示BAI可以激活caspase-3、caspase-9活性，并具有時間和濃度依賴性。

表2 BAI對Hep-2細(xì)胞caspase-3及caspase-9活性的影響

2.3BAI影響B(tài)cl-2及Bax基因mRNA表達(dá) 隨BAI濃度增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)逐漸減少，明顯低于陰性對照組，48 h明顯低于24 h；Bax mRNA表達(dá)隨BAI濃度增加而增加，明顯高于陰性對照組，48 h明顯高于24 h；Bcl-2/Bax比隨BAI濃度增加而降低，見圖2、表3，各BAI組與陰性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明BAI抑制癌基因Bcl-2 mRNA表達(dá)，促進(jìn)抑癌基因Bax mRNA表達(dá)，具有時間和濃度依賴性。

2.4BAI影響多種凋亡相關(guān)基因、蛋白酶及其酶原的表達(dá) 40 μmol/L BAI作用后，與陰性對照組相比，隨作用時間增加，BAI組抑癌基因Bax蛋白表達(dá)量增加，癌基因Bcl-2蛋白表達(dá)量減少；酶原蛋白(procaspase)-9蛋白表達(dá)量減少，與之相反，caspase-9蛋白表達(dá)量增加；procaspase-3蛋白表達(dá)量減少，caspase-3蛋白表達(dá)量增加，各BAI組與陰性對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表4。BAI可以上調(diào)Bax、caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2、procaspase-9、procaspase-3蛋白表達(dá)水平，具有時間依賴性。

M：DL-2000Marker；1～4為24 h，分別為陰性對照組，BAI組20、40、80 μmol/L；5～8為48 h，分別為陰性對照組，BAI組20、40、80 μmol/L圖2 BAI對Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

圖3 Hep-2 細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、procaspase-9、caspase-9、procaspase-3、caspase-3蛋白表達(dá)

組別Bcl?2/GAPDH24h48hBax/GAPDH24h48hBcl?2/Bax24h48h陰性對照組1216±0041331±0030394±0020301±003309442BAI組 20μmol/L0723±0021)0631±0042)0624±0031)0810±0042)159078 40μmol/L0415±0031)0388±0011)2)1142±0041)1650±0031)2)036024 80μmol/L0220±0011)0114±0021)2)1300±0021)1917±0011)2)017006

表4 BAI對Bcl-2、Bax、procaspase-9、caspase-9、procaspase-3、caspase-3、蛋白相對表達(dá)的影響

3 討 論

黃芩是一味歷史悠久的中藥材，醫(yī)書對黃芩的記載始于《神農(nóng)本草經(jīng)》，BAI制劑在臨床中應(yīng)用于傳染性肝炎、咽炎、急慢性胃腸炎、上呼吸道感染等多種疾病的治療。BAI具有抗乳腺癌、食管癌、胃癌〔3,4〕等作用。本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一系列有關(guān)BAI對人喉癌hep-2細(xì)胞作用的研究〔7,8〕。細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡都是生命的基本現(xiàn)象，保證機(jī)體的正常發(fā)育和健康。已有大量研究表明，腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡所致，近年來通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為抗腫瘤的一個重要研究方向〔9,10〕。本文結(jié)果與前期研究〔7〕吖啶橙染色(AO)法檢測到細(xì)胞在BAI(40、80 μmol/L)作用24 h后呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)結(jié)果一致。

促凋亡基因活性受抑制和抗凋亡基因被激活是誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而長期存活的主要原因，細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的精確過程〔9〕。真核細(xì)胞凋亡途徑主要包括死亡受體(外源性)途徑、線粒體(內(nèi)源性)途徑、B粒酶途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途。細(xì)胞凋亡主要包括凋亡誘導(dǎo)、調(diào)控執(zhí)行和效應(yīng)3個階段〔11〕。其中線粒體途徑是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑〔12〕，Bcl-2、Bax家族和caspase在線粒體途徑中發(fā)揮極為重要的作用〔13〕。Bcl-2家族分為Bcl-2亞家族(抗凋亡)、Bax亞家族(促凋亡)及BH3亞家族(促凋亡)三類20余種，其中Bcl-2和Bax是其中最重要的抗凋亡基因(癌基因)和促凋亡基因(抑癌基因)〔14〕。Bax存在于胞質(zhì)中，在凋亡信號的誘導(dǎo)下，Bax轉(zhuǎn)移到線粒體外膜處，先形成Bax/Bax二聚體，然后結(jié)合成簇〔15〕；與線粒體相互作用，降低線粒體跨膜電位，在Ca2+濃度升高的情況，改變線粒體通透性〔16,17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BAI可以通過誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，線粒體外膜處聚集成簇，降低線粒體跨膜電位；BAI具有調(diào)控胞質(zhì)Ca2+濃度升高的能力〔18〕，所以BAI接下來可以改變線粒體通透性。在線粒體凋亡途徑中，線粒體通透性改變后，細(xì)胞色素(Cyt)C將從線粒體釋放到胞質(zhì)。而Bcl-2作為線粒體上的一種跨膜因子，將阻止Bax的這個過程，阻止CytC釋放到胞質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明BAI可以通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)和上調(diào)Bax，促進(jìn)線粒體凋亡途徑中CytC釋放到胞質(zhì)。在線粒體凋亡途徑中，從線粒體釋放到胞質(zhì)的CytC進(jìn)而與Apaf-1形成多聚體，并進(jìn)一步與在胞質(zhì)中以酶原形式存在的caspase-9前體形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9。caspase是一類可引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，其中caspase-9是啟動酶中最重要的一種，caspase-3是效應(yīng)酶中最重要的一種〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，BAI可以通過線粒體凋亡途徑，進(jìn)一步激活喉癌細(xì)胞的caspase-9。在線粒體凋亡途徑中，激活的caspase-9作為啟動酶，將進(jìn)一步誘使procaspase-3激活為caspase-3；caspase-3作為最重要的效應(yīng)酶，將進(jìn)一步激活激活級聯(lián)反應(yīng)，將切斷肽鍵、直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、降解細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架、使染色質(zhì)凝聚、DNA斷裂為DNA梯度等，最終使得細(xì)胞凋亡〔17〕。BAI可以誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞出現(xiàn)DNA梯度〔8〕。說明BAI可以通過線粒體凋亡途徑進(jìn)一步激活caspase-3，并發(fā)揮其效應(yīng)酶作用和后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，Bcl-2還有另一方面的作用，可以作為caspase-3的直接底物，抑制caspase-3的合成，抑制凋亡〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BAI促進(jìn)caspase-3的合成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，BAI通過上調(diào)Bax在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)及Bcl-2/Bax，促進(jìn)Bax在線粒體外膜處聚集成簇，降低線粒體跨膜電位，進(jìn)而降低線粒體跨膜電位，促進(jìn)CytC釋放到胞質(zhì)，進(jìn)而與激活的caspase-9及Apaf-1形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-3及后續(xù)線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡。

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