鄔利婭·伊明, 帕提古麗·阿布拉, 凱薩爾·力瓦依丁, 阿迪力·阿不都熱合曼,周文婷, 艾尼瓦爾·吾買爾

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011； 2新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校， 新疆 和田 848000； 3新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院 ，烏魯木齊 830049)

原發(fā)性高血壓(EH)是一種最為常見的心血管疾病之一，是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)病率和死亡率增加的危險(xiǎn)因素之一[1]。EH的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，到目前為止仍在不斷探索當(dāng)中。近年來(lái)許多研究結(jié)果提示炎癥因素在EH的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸中扮演了非常重要的角色[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者處于一種低度炎癥狀態(tài)，患者血清炎癥分子含量明顯增高[3-4]。大規(guī)模的前瞻性研究結(jié)果顯示，患者在發(fā)展為高血壓之前就處于低度炎癥狀態(tài)，提示炎癥反應(yīng)可能在高血壓發(fā)生之前就存在，是導(dǎo)致高血壓發(fā)病及預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[5-6]。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的過(guò)度激活是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要病理生理學(xué)機(jī)制之一，血管緊張素Ⅱ (AngⅡ) 是RAS中最重要的生物活性物質(zhì)，主要通過(guò)與靶器官細(xì)胞膜上的AngⅡ 1型受體(AT1)結(jié)合而發(fā)揮其生理和病理效應(yīng)，諸如收縮血管作用，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)醛固酮、血管加壓素分泌，血管平滑肌增殖，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖等[7-8]。此外，AngⅡ有很強(qiáng)的促炎癥反應(yīng)作用，是一種具有較強(qiáng)的致炎作用的活性多肽,可參與炎癥反應(yīng)中的所有過(guò)程[9-10]，它以血壓依賴性和非血壓依賴性機(jī)制誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[11]，而引起器官損傷[12]。

已有研究顯示，雌激素對(duì)炎癥反應(yīng)有一定的調(diào)節(jié)作用[13- 16]，對(duì)RAS的激活也存在一定的性別差異[17-18]。本研究以6月齡原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為研究對(duì)象，探討SHR靶器官損傷及炎癥因子的性別差異性，并以AngⅡ及內(nèi)皮素(ET-1)與炎癥因子做相關(guān)性分析，以確定導(dǎo)致高血壓性炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因素。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6月齡健康無(wú)特定病原級(jí)(SPF)SHR100只，雌雄各半，購(gòu)自上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)期間，保持動(dòng)物房相對(duì)濕度70%左右，室溫在22℃左右，自動(dòng)照明(12 h明，12 h暗)。大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。大鼠的使用及動(dòng)物的處理，均符合第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的管理準(zhǔn)則。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑MPA-大鼠尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)測(cè)壓系統(tǒng)(上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司)，SN-695B智能放免g測(cè)量?jī)x(上海原子核研究所一廠)，超高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司)，戊巴比妥鈉(Sigma公司產(chǎn)品)。AngⅡ、ET-1濃度，血清白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和雌二醇(E2)濃度放射免疫分析試劑盒由北京北方雅生物技術(shù)研究所提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血壓的測(cè)定 以尾動(dòng)脈血壓測(cè)定儀測(cè)定大鼠清醒狀態(tài)下的收縮壓(SBP)。將大鼠置血壓測(cè)定儀的恒溫箱內(nèi)加熱至37℃，以尾套置于尾根部，將壓力傳感器置于尾部下方，記錄大鼠尾動(dòng)脈的搏動(dòng)曲線。大鼠在此環(huán)境中穩(wěn)定30 min，待尾動(dòng)脈搏動(dòng)明顯時(shí)開始測(cè)定。通過(guò)氣囊充氣阻斷尾血流，使尾動(dòng)脈搏動(dòng)曲線逐漸變小至消失，搏動(dòng)曲線剛剛消失那一點(diǎn)的壓力即為動(dòng)物的血壓值。連續(xù)測(cè)定6次取均數(shù),連續(xù)測(cè)定3 d。第一天為動(dòng)物的訓(xùn)練測(cè)定,可不計(jì)結(jié)果,第二、三天為正式試驗(yàn)，以2 d測(cè)定值的均數(shù)為該動(dòng)物的血壓值。

1.3.2 血清及血漿的制備 經(jīng)尾動(dòng)脈測(cè)壓SBP>150 mmHg的SHR大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，頸動(dòng)脈插管取血2 mL注入試管中，在室溫放置2 h待凝固， 4℃3 000 rpm/min離心5 min，分離血清-20℃保存；取血2 mL，迅速注入放在冰水冷卻的含酶抑制劑3.0 mmol/L EDTA-Na220 μL、3.4 mmol/L 8-輕基哇琳20 μL及3.2 mmol/L二疏基丙醇10 μL的試管中，搖勻后迅速放回冰水中冷卻，4℃1 000 rpm/min離心15 min，分離血漿-20℃保存用于測(cè)定AngⅡ；取血1 mL，迅速注入放在冰水冷卻的含酶抑制劑7.5%EDTA-Na215 μL及抑肽酶20 μL的抗凝管中，搖勻后迅速放回冰水中冷卻，4℃3 000 rpm/min離心10 min，分離血漿放入-20℃保存用于測(cè)定ET-1。

1.3.3 靶器官指數(shù)的測(cè)定 大鼠麻醉取血后，迅速打開胸腔和腹腔，依次取出心臟、胸主動(dòng)脈和腎臟。用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖凈血液后放入，將心臟以濾紙吸干水分后稱重，分離出左、右心室，分別稱重計(jì)算計(jì)算心室及左心室指數(shù)即心室重和體質(zhì)量比(VW/BW)及左心室重和體質(zhì)量比(LVW/BW)。取右腎吸干水分，稱重計(jì)算腎指數(shù)即右腎重和體質(zhì)量比(RKW/BW)。取胸主動(dòng)脈，去除其粘附的脂肪組織和結(jié)締組織，濾紙吸干水分并稱重，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其長(zhǎng)度，計(jì)算血管指數(shù)即胸主動(dòng)脈重和長(zhǎng)度之比(AW/L)，觀察靶器官損傷程度。

1.3.4 血漿AngⅡ與ET-1及血清炎癥因子的測(cè)定 用放免試劑盒測(cè)定血清TNF-α、IL-1β及IL-6 的含量及血漿AngⅡ和ET的含量，測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果

2.1性別對(duì)SHR的收縮壓及靶器官損傷的影響雄性SHR(SHR-M)組的SBP和體質(zhì)量高于雌性SHR(SHR-F)組(P<0.01)。SHR-F組的VW/BW和LVW/BW大于SHR-M組(P<0.01)，LVW/RVW和AW/length小于SHR-M組(P<0.01)， RKW/BW和RCT/RMT性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 性別對(duì)SHR血壓及器官損傷參數(shù)

注： 與SHR-F組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2SHR的AngⅡ、ET、E2及炎癥因子的性別差異SHR-F組血漿AngⅡ的含量低于SHR-M組(P<0.05)，血漿ET的含量高于SHR-M組(P<0.01)；SHR-F組血清IL-1β的含量高于SHR-M組(P<0.01)，IL-6的含量低于SHR-M組(P<0.05)，血清TNF-α性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 性別對(duì)血中AngⅡ、ET-1、E2和炎癥因子的含量的影響

注： 與SHR-F組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3AngⅡ、ET-1與E2及炎癥因子的相關(guān)性對(duì)血清炎癥因子與血漿AngⅡ及ET進(jìn)行線性相關(guān)分析結(jié)果表明:SHR-F組血漿AngⅡ的含量與血清E2含量呈正相關(guān)(P<0.05)，見圖1；血漿AngⅡ的含量與炎癥因子IL-1β及IL-6血漿的含量呈正相關(guān)(P<0.05)，見圖2、3；血漿AngⅡ的含量與TNF-α無(wú)相關(guān)性，ET與各炎癥因子無(wú)相關(guān)性；SHR-M組血漿AngⅡ與炎癥因子IL-1β及IL-6之間呈正相關(guān)(P<0.05)，見圖4、5；ET-1與IL-6呈正相關(guān)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與其他炎癥因子無(wú)相關(guān)性。

3 討論

本研究以SHR為研究對(duì)象，是原發(fā)性高血壓動(dòng)物模型，其高血壓的發(fā)病機(jī)制屬于混合型。為了避免高血壓以外的因素對(duì)炎癥因子水平的干擾，采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)壓檢測(cè)方法測(cè)定大鼠的血壓，動(dòng)脈壓>150 mmHg作為高血壓形成的標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)定血清炎癥因子和雌二醇，血漿AngⅡ和ET-1水平，并側(cè)測(cè)定心臟、胸主動(dòng)脈和腎臟的器官指數(shù)，評(píng)價(jià)靶器官的損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，成年雌性自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓低于雄性大鼠(P<0.05)，雄性大鼠組的AW/L也高于雌性組(P<0.05),而LVW/BW反而是雌性組大于雄性組(P<0.05)，而LVW/RVW卻是雄性組大于雌性組(P<0.05)。這表明去掉BW的影響后，實(shí)際上雄性大鼠的心室肥厚程度仍然是雄性組比較嚴(yán)重。同齡的雌性大鼠和雄性大鼠的體重有較大的差異，會(huì)干擾LVW/BW值。雌性組血漿AngⅡ水平低于雄性組(P<0.05)，提示性別差異可影響AngⅡ的生成，高血壓的大鼠的血壓和靶器官損失的性別差異與腎素血管緊張素系統(tǒng)的激活有關(guān)。雌性組血漿ET-I水平高于雄性組(P<0.05)。關(guān)于雌性自發(fā)性高血壓大鼠血漿ET-I水平高的原因不清，推測(cè)除了雌激素的作用外，可能還有其他影響的因素存在，詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

圖1雌性SHR的血漿AngⅡ與血清E2的相關(guān)性

圖2雌性SHR的血漿AngⅡ與血清IL-1β的相關(guān)性

圖3雌性SHR的血漿AngⅡ與血清IL-6的相關(guān)性

促炎性細(xì)胞因子的主要生物學(xué)功能就是激活炎性細(xì)胞、促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集并增加其它炎性因子的表達(dá)，參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答。在心血管系統(tǒng)，促炎性細(xì)胞因子可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能不全、誘導(dǎo)趨化因子在心血管系統(tǒng)的表達(dá)，進(jìn)而引起單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn)，導(dǎo)致炎性損傷[19]。本研究顯示：原發(fā)性高血壓大鼠血清中IL-6的濃度雄性組高于雌性組(P<0.05)，雌激素呈現(xiàn)了一定的抗炎作用；血清TNF-α的濃度性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清IL-1β的濃度卻表現(xiàn)為雌性組高于雄性組(P<0.05)，雌激素有可能促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生。關(guān)于雌激素和IL-1β的關(guān)系的研究結(jié)果有一定爭(zhēng)議[20-21]。雌激素和IL-1β之間的內(nèi)在關(guān)系有待于進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

本研究結(jié)果顯示：不論是雌性組還是雄性組，IL-1β和IL-6均與AngⅡ呈正相關(guān)(P<0.05)；炎癥因子與ET-1無(wú)顯著相關(guān)性，提示這2種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生可能主要與體內(nèi)AngⅡ水平有關(guān)，提示腎素血管緊張素系統(tǒng)的激活是引起高血壓性炎癥反應(yīng)的主要原因;雌二醇與AngⅡ呈正相關(guān)(P<0.05)，提示在雌性SHR中雌激素可能促進(jìn)循環(huán)中AngⅡ的生成。

綜上所述，自發(fā)性高血壓大鼠的血壓水平、靶器官的損傷及炎癥因子存在一定的性別差異性，AngⅡ是誘發(fā)高血壓大鼠炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，在雌性高血壓大鼠中雌二醇水平高可增加AngⅡ的產(chǎn)生。

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