艾尼瓦爾·吾買爾, 阿布來提·阿布力孜, 帕提古麗·阿布拉， 阿迪力·阿不都熱合曼, 周文婷, 鄔利婭·伊明

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011; 2新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校， 新疆 和田 848000)

原發(fā)性高血壓(EH)指循環(huán)動脈血壓增高為主的臨床綜合癥，是由多基因、多因素綜合作用而導(dǎo)致的一種錯綜復(fù)雜的常見疾病，在高血壓病的發(fā)生發(fā)展過程中，隨著疾病的進展，靶器官逐漸受到損害可發(fā)生如血管重構(gòu)、腎小球受損和心肌肥厚等嚴重的器官損傷，最終導(dǎo)致致命性的并發(fā)癥[1-2]。EH的發(fā)病機制到目前為止仍在不斷探索當中，除遺傳因素、飲食因素、精神因素以及神經(jīng)-內(nèi)分泌機制外，炎癥因素在EH的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸中也扮演了極其重要的角色[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者處于低度炎癥狀態(tài)，其血清炎癥分子含量明顯增加[4-6]。而一些大規(guī)模的前瞻性研究結(jié)果表明，炎癥可能于高血壓發(fā)生之前就存在，是高血壓發(fā)病及預(yù)后的獨立預(yù)測因素[7-8]。本文以6月齡和12月齡自發(fā)性高血壓大鼠為研究對象，探討性別及年齡因素對高血壓大鼠炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物80只原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，6月齡和12月齡雌性雄性各20只，SPF級，由上海第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。實驗期間，保持動物房室溫在22℃左右，相對濕度70%左右，自動照明(12 h明，12 h暗)。動物自由飲水及進食。所有實驗動物的使用，得到第二軍醫(yī)大學(xué)動物管理機構(gòu)的同意，符合第二軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會的管理準則。

1.2實驗儀器與試劑MPA-大鼠尾動脈無創(chuàng)測壓系統(tǒng)(上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司)，超高速低溫離心機(Eppendorf 公司)，F(xiàn)TC2000 實時熒光PCR 檢測儀(加拿大楓嶺公司)，數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海倍曼生物科技有限公司)。戊巴比妥鈉(Sigma公司產(chǎn)品)。IL-6和TNF-α放射免疫分析試劑盒由北京北方雅生物技術(shù)研究所提供。焦炭酸二乙脂(DEPC)由Genview 公司提供；TRIzol, RNAse inhibitor TaKaRa, Oligd(T)18, dNTPS Takara, 10×PCR buffer Takara均由上海Sango生物工程公司提供。

1.3實驗方法

1.3.1 大鼠血壓的測定 大鼠清醒狀態(tài)下，以尾動脈血壓測定儀測定其收縮壓。將大鼠置血壓測定儀的恒溫箱內(nèi)加熱至37℃，以尾套置于尾根部，將壓力傳感器置于尾部下方，記錄大鼠尾動脈的搏動曲線。大鼠在此環(huán)境中穩(wěn)定30 min，待尾動脈搏動明顯時開始測定。連續(xù)測定6次取均數(shù)，連續(xù)測定2 d，以2 d測定值的均數(shù)為該動物的血壓值(以收縮壓>150 mmHg為篩選標準，低于此標準者剔除)。

1.3.2 血清的制備及炎癥因子的測定 經(jīng)尾動脈測壓合格的SHR大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉動物，頸動脈插管取血2 mL注入試管中，待凝固后分離血清，4℃ 3 000 rpm離心5 min，取上清液-20℃保存，用放射免疫分析試劑盒測定血清TNF-α及IL-6的含量，測定方法按試劑盒說明書進行。

1.3.3 Real-time RT-PCR檢測大鼠腎組織中炎癥因子的mRNA水平 取各組大鼠腎組織100 mg在液氮中碾磨成粉狀，加入1mL TRIzol試劑、酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法準備總RNA。所有試劑及耗材均為DNase, RNase-Free。應(yīng)用紫外分光光度計檢測RNA樣品260 nm和280 nm處的吸光度(OD)，濃度=OD260 nm×40 μg/mL×稀釋倍數(shù)；純度=OD260 nm/OD280 nm(比值在1.8～2.0間為RNA純度優(yōu)良)。以2.0 μg總RNA為模板，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總反應(yīng)體系25 μL。所得cDNA-20℃凍存。根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中同源基因的序列的報道設(shè)計寡核苷酸引物，引物序列見表1。待測樣品均作復(fù)管，每次實驗均以不加模板的PCR體系作為陰性對照。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min(熱啟動)，94℃ 30 s(變性)，65℃ 30 s(退火)，72℃ 30 s(延伸)，40個循環(huán)。結(jié)果用MJ opticon monitor軟件分析?；虮磉_水平用倍數(shù)變化來表示(2-ΔΔCt法)：基因表達量采用實驗組/對照組=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的-Ct參比)實驗-(Ct目的-Ct參比)對照。

表1 候選基因短片段引物序列

2 結(jié)果

2.1對血清炎癥因子的影響雄性SHR(SHR-M)大鼠血清IL-6的含量明顯高于同齡的雌性(SHR-F)大鼠，不論雌性還是雄性SHR-12m大鼠血清IL-6的含量均明顯高于SHR-6m大鼠，結(jié)果見表2。SHR-6m血清TNF-α不存在性別差異，而雄性SHR-12m大鼠血清TNF-α的含量明顯高于同齡的雌性大鼠，并隨著年齡的增加，血清TNF-α明顯增多。

2.2SHR腎組織中IL-6mRNA表達SHR-6m-F大鼠IL-6 mRNA的表達低于SHR-6m-M大鼠約53%(P<0.05)， SHR-12m-F大鼠IL-6 mRNA的表達低于SHR-12m-M約272%(P<0.05)。SHR-12m-M大鼠IL-6的mRNA的表達高于SHR-6m-M大鼠約242%(P<0.05)，SHR-12m-F大鼠中IL-6的mRNA的表達高于同性別SHR-6m約69%(P<0.05)，見圖1。

2.3SHR腎組織中TNF-α的mRNA表達與SHR-M比較， SHR-6m-F和SHR-12m-F大鼠TNF-α的mRNA的表達明顯低于同齡雄性，分別低54%和50%；但年齡因素對的TNF-α mRNA的表達影響不大，見圖2。

表2 SHR血中的IL-6和TNF-α的含量

注：與SHR-6m-F大鼠比較，*P<0.05，**P<0.01；與SHR-12m-F大鼠比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與SHR-6m-M大鼠比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

EH已成為世界上最為重要的公共衛(wèi)生問題，是心血管、腦血管及腎病發(fā)病率及死亡率增加的最主要的危險因素。炎癥可能參與高血壓及高血壓相關(guān)并發(fā)癥的病理學(xué)過程，在高血壓靶器官損失發(fā)展過程中起了一定的作用[9-10]。IL-6是一種參與免疫和炎癥反應(yīng)的多功能的促炎細胞因子，活化的單核細胞是血液中IL-6的主要來源。收縮壓以及舒張壓的升高與血清IL-6 水平密切相關(guān)。這說明其在高血壓的病理過程中有著直接或者間接的影響[11]。高血壓患者血漿TNF-α濃度明顯高于正常血壓者，且其濃度隨病程進展而逐漸升高。TNF-α對血管內(nèi)皮有直接損傷作用，可通過直接的細胞毒作用，破壞血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙；促進炎癥介質(zhì)IL-6的分泌，參與血管平滑肌細胞的增殖、分化和調(diào)控，從而使血管壁增厚、管腔狹窄、外周阻力增高，促進高血壓形成[12-13]。

本研究以SHR大鼠為研究對象，檢測了不同性別6月齡和12月齡EH大鼠血清炎癥因子的濃度和腎組織中炎癥因子的mRNA表達。IL-6血清濃度和腎組織中mRNA表達的結(jié)果是一致的。6月齡和12月齡自發(fā)性高血壓大鼠血清中IL-6的濃度和腎組織中IL-6 mRNA表達均呈現(xiàn)雄性大鼠明顯高于雌性大鼠，同一性別的比較結(jié)果顯示，老年大鼠(12月齡)的血清中IL-6的濃度和腎組織中IL-6 mRNA表達均高于成年大鼠(6月齡)，提示雌激素呈現(xiàn)了一定的抗炎作用，隨著年齡的增長，不論雌雄炎癥反應(yīng)均會增強。

血清TNF-α的濃度在成年大鼠EH中無性別差異,但在老年大鼠呈現(xiàn)雄性大鼠的濃度明顯高于雌性大鼠。同性別不同年齡大鼠的結(jié)果顯示，隨著年齡的增長，血清TNF-α的濃度明顯升高，這種差別在雄性大鼠更明顯。腎組織中TNF-α mRNA表達的結(jié)果顯示，在同齡不同性別的成年和老年EH大鼠中，雄性大鼠的表達水平明顯高于雌性大鼠，但在同一性別不同年齡大鼠中該表達無差異。血清TNF-α的結(jié)果和腎臟mRNA表達的結(jié)果不一致，推測血清的測定有一定誤差，擬在以后的研究中使用靈敏度較高的檢測方式進行檢測及驗證。

綜上所述，EH的發(fā)生發(fā)展中炎癥反應(yīng)起了一定的作用，EH性炎癥反應(yīng)存在性別差異性，并隨著病程的進展炎癥反應(yīng)加重。

參考文獻：

[1] KANNEL W B. Fifty years of Framingham Study contributions to understanding hypertension[J]. J Hum Hypertens,2000,14(2):83-90.

[2] SU D F, MIAO C Y. Blood pressure variability and organ damage[J]. Clin ExpPharmacol Physiol,2001, 28(28):709-715.

[3] MESSERLI F, WILLIAMS B, RITZ E. Essential hypertension[J]. Lancet,2007, 370(9587): 591-603.

[4] SESSO H D, BURING J E, RIFAI N, et al. C-reactive protein and the risk of developing hypertension[J]. J Am Med Assoc,2003, 290(22):2945-2951.

[5] CHAE C U, LEE R T, RIFAI N, et al. Blood pressure and inflammation in apparently healthy men[J]. Hypertension,2001, 38(3):399-403.

[6] SCHILLACI G, PIRRO M, GEMELLI F, et al. Increased C-reactive protein concentrations in never-treated hypertension:the role of systolic and pulse pressures[J]. J Hypertens,2003, 21(10):1841-1846.

[7] ENGSTROM G, LIND P, HEDBLAD B, et al. Long-term effects of inflammation-sensitive plasma proteins and systolic blood pressure on incidence of stroke[J]. Stroke,2002, 33(12):2744-2749.

[8] NISKANEN L, LAAKSONEN D E, NYYSS?NEN K, et al. Inflammation, abdominal obesity, and smoking as predictors of hypertension[J]. Hypertension. 2004,44(6):859-65.

[9] HIGAKI J, AOKI M, MORISHITA R, et al. In vivo evidence of the importance of cardiac angiotensin-converting enzyme in the pathogenesis of cardiac hypertrophy[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(2):428-434.

[10] LIU A J, MA X J, SHEN F M, et al. Arterial baroreflex: a novel target for preventing stroke in rat hypertension[J]. Stroke,2007,38(6):1916-1923.

[11] 張鳳, 戴小華. IL-6、TNF-α參與高血壓腎病損害研究進展[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志, 2014(1):78-80.

[12] 孔麗娟, 江丹娜. 高血壓與炎癥因子關(guān)系研究進展[J]. 現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué), 2008, 20(12):988-989.

[13] 吳婷, 宗剛軍. 高血壓病與炎癥反應(yīng)相關(guān)性的研究進展[J]. 心臟雜志, 2013(5):606-608.