劉曉晨，吳圣勇，雷仲仁，王海鴻

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不同溫度下兩株球孢白僵菌侵染西花薊馬的生長動力學及其毒力

劉曉晨，吳圣勇，雷仲仁，王海鴻

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點試驗室，北京 100193）

【目的】通過比較兩株球孢白僵菌（）在不同溫度條件下侵染西花薊馬（）的生長動力學及其毒力，探討球孢白僵菌菌體增殖和殺蟲毒力的關系，為提高球孢白僵菌對西花薊馬的殺蟲效率提供理論支持。【方法】首先，在20、25和30℃ 3個溫度條件下，連續(xù)記錄第1—8天西花薊馬被兩株球孢白僵菌菌株（SCWJ-2和GZGY-1-3）侵染后的死亡率，并以未被真菌感染的西花薊馬為對照，計算其累積校正死亡率，選擇第3天的數據（對照死亡率為2%—5%）比較兩個菌株的殺蟲效率。其次，在20、25和30℃ 3個溫度條件下，連續(xù)記錄第1—8天內平板培養(yǎng)的上述兩個菌株的菌落直徑，選取第3天兩個菌株的菌落生長直徑數據進行比較分析。最后，提取20、25和30℃溫度下，西花薊馬分別被兩株球孢白僵菌侵染第1、2和3天的混合DNA，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術定量球孢白僵菌在每個宿主樣品體內的拷貝數，選取第3天兩個菌株的基因拷貝數進行比較分析。【結果】生物測定結果顯示，在檢測溫度（20—30℃）范圍內，球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2對西花薊馬成蟲均具有較高致病性，無論任何溫度和何種菌株，西花薊馬從處理后第2天開始有死亡個體出現，第8天時，SCWJ-2和GZGY-1-3造成的校正死亡率分別為83%—91%和79%—90%。以第3天的校正死亡率為指標（對照死亡率為2%—5%），30℃下菌株SCWJ-2毒力顯著高于GZGY-1-3（＜0.05），25℃和20℃下兩個菌株毒力無顯著差異（＞0.05）。平板培養(yǎng)試驗表明，在檢測溫度（20—30℃）范圍內，兩個菌株菌落直徑隨著時間推移而增加，第8天時，菌株SCWJ-2和GZGY-1-3的菌落直徑分別為31—36、28—32 mm。選取第3天菌落生長直徑數據進行比較，菌株SCWJ-2在3個溫度下的菌落直徑均顯著大于菌株GZGY-1-3（＜0.05）。實時熒光定量結果顯示，除30℃下的菌株SCWJ-2之外，兩個菌株在西花薊馬體內的基因拷貝數都在第1天時下降，2 d后又逐漸上升。使用第3天西花薊馬體內的基因拷貝數進行分析，在30℃下菌株SCWJ-2真菌拷貝數顯著大于GZGY-1-3（＜0.05），25℃和20℃下兩個菌株基因拷貝數無顯著差異（＞0.05）?！窘Y論】真菌在被侵染蟲體內的基因拷貝數受到菌株和溫度的影響，這與生物測定結果相一致。與菌株GZGY-1-3相比，SCWJ-2更適合高溫條件下對西花薊馬的防治。

球孢白僵菌；西花薊馬；真菌生長動力學；實時熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】西花薊馬（）是一種重要的世界性農業(yè)害蟲[1-3]，對農業(yè)生產構成較大威脅[4-6]。球孢白僵菌（）是一種廣譜性蟲生真菌，已被大量應用于西花薊馬的防治[7-12]。蟲生真菌孢子附著并穿透昆蟲體壁[13]后，菌絲在昆蟲血腔內生長，能夠產生有毒代謝產物[14]、消耗宿主體內營養(yǎng)、穿透宿主的重要器官和阻止血淋巴流動等，最終導致宿主昆蟲死亡[15]。然而，室內適溫下篩選出的對西花薊馬具有相似殺蟲效率的球孢白僵菌菌株，在田間實際應用時效率卻顯著不同[16-17]。菌體增殖能力的差異是引起菌株間毒力差異的重要原因[18]，田間溫度可能通過影響真菌菌體增殖，導致不同菌株間最終殺蟲效率不同[19]。因此，研究不同溫度對球孢白僵菌侵染的生長動力學影響，對提高田間防治效果具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，許多評價真菌菌體增殖與殺蟲效率關系的研究大多是通過體外試驗完成的。例如，檢測液體培養(yǎng)的菌絲和孢子數，固體培養(yǎng)的菌落直徑等[20-25]。EKESI等[20]報道了溫度對2株球孢白僵菌和4株綠僵菌（）的孢子萌發(fā)和菌落直徑生長的影響，進而影響了對薊馬（）的致病性；Adamo等[24]研究表明，隨著溫度的升高靈桿菌（）或蠟狀芽孢桿菌（）生長速率加快，進而影響對寄主蟋蟀（）的致病能力；HUNT等[25]檢測了不同溫度下昆蟲體內病原菌的生長狀況，把感染綠僵菌（）的果蠅（）分別于不同溫度環(huán)境下處理相同時間后采樣，培養(yǎng)并計數菌落的數量，結果表明昆蟲體表病原菌生長狀況與溫度密切相關。然而，上述方法都無法模擬真菌當時所處的寄主體內營養(yǎng)和免疫壓力環(huán)境，不能很好地代表真菌的自然生長動力學。關于檢測真菌在活體內增殖的方法，曾有報道使用顯微鏡法測定血球計數板上被感染的昆蟲體內芽生孢子和/或菌絲片段的數量[26]，但這一技術在感染初期和末期得到的結果很不精確，因為宿主在感染初期其血淋巴中的菌體很少，而在感染后期芽生孢子和菌絲片段又太多，均無法精確計數[26]。【本研究切入點】實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術為準確定量真菌在昆蟲體內生長數量提供了便利[27-29]。但目前為止，還未有利用此項技術分析同種真菌不同菌株在不同溫度下昆蟲宿主體內生長動力學的研究?！緮M解決的關鍵問題】針對適溫下對西花薊馬殺蟲毒力相似，而高溫下顯著不同的球孢白僵菌兩個菌株GZGY-1-3和SCWJ-2，在設定的溫度下，比較兩個菌株經平板培養(yǎng)的菌落直徑和侵染薊馬后在蟲體內的基因拷貝數，結合生物測定數據，分析真菌菌體增殖和殺蟲效率間的關系，以期為提高田間應用球孢白僵菌防治西花薊馬的效率提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2016—2017年在中國農業(yè)科學院植物保護研究所完成。

1.1 供試昆蟲

西花薊馬成蟲于2013年采自北京市昌平區(qū)的辣椒上，在室內用豆角飼養(yǎng)，置于人工氣候箱內（MLR-351H，SANYO Electric Co., Ltd）。飼養(yǎng)溫度（25±1）℃，光周期14L﹕10D，相對濕度60%—80%。

1.2 供試菌株

球孢白僵菌菌株SCWJ-2和GZGY-1-3分別采集于四川和貴州，現保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號分別為CGMCC No.9253和No.9254。試驗時，用無菌接種環(huán)于斜面上刮下分生孢子，涂于CMA產孢培養(yǎng)基（瓊脂20 g·L-1、硝酸銨1 g·L-1、玉米粉20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、麥麩10 g·L-1、水合硫酸鎂1 g·L-1和硝酸二氫鉀3 g·L-1）上，在恒溫培養(yǎng)箱（GXZ-9240A）光周期12 L﹕12D，（25±1）℃中培養(yǎng)15 d。

孢子萌發(fā)率檢測：用接種環(huán)刮下2 mg孢子粉置于50 mL的三角瓶中，加入10 mL高溫滅菌的萌發(fā)液（4%葡萄糖，1%酵母提取物，0.05吐溫-80），在（25±1）℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)18 h，于400×顯微鏡（OLYMPUS，BX51）下鏡檢，萌發(fā)率＞90%可用于試驗。

孢子懸浮液制備：將孢子加入滅菌的0.05%吐溫-80溶液，配成107個孢子/mL的懸浮液。

1.3 生物測定

取約2 000頭西花薊馬成蟲置于上述孢子懸浮液中浸泡5 s，對照組薊馬用0.05%的吐溫溶液處理5 s。用細毛筆將西花薊馬挑到濾紙上，吸干多余液體，然后轉移至放有豆角葉片的培養(yǎng)皿（直徑約為7 cm）中，用保鮮膜密封培養(yǎng)皿，并用細針頭在保鮮膜上扎孔保持透氣。分別放入20、25和30℃的培養(yǎng)箱內，光周期12 L﹕12D，每天記錄死亡的西花薊馬數量，并把死亡薊馬挑入一個墊有濕潤濾紙的滅菌的培養(yǎng)皿內，5—6 d后顯微鏡觀察是否有菌絲長出，以確定是否為白僵菌侵染致死。連續(xù)記錄8 d，計算其累積校正死亡率并制作西花薊馬的累積校正死亡率曲線。每個處理重復6次，每次100頭西花薊馬。在3個溫度下，選擇第3天的數據（對照死亡率為2%—5%）比較兩個菌株殺蟲效率。

1.4 菌落直徑測定

參考TEFERA等[23]的方法，將15 mL的薩氏培養(yǎng)基倒入直徑9 cm的滅菌培養(yǎng)皿冷卻，取50 μl 107個/mL的球孢白僵菌孢子懸浮液滴于培養(yǎng)基中央，然后分別置于20、25和30℃溫度環(huán)境，光周期14L﹕10D的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每天定時測量菌落直徑并進行比較，每個溫度下每個菌株重復6次。

1.5 西花薊馬體內球孢白僵菌生長動力學

取樣：用上述球孢白僵菌孢子懸浮液處理西花薊馬后，分別放置于20、25和30℃下，于0、24、48和72 h取樣，每個時間點取6次重復，每個重復100只。提取DNA進行后續(xù)絕對熒光定量試驗。

DNA提?。貉心シ椒▍⒖糂ell等[27]，在裝有樣品的研磨管中分別加入0.25 g直徑為0.2 mm的鋯珠和0.8 mm的硅珠，然后放在TissueLyzerTM（Qiagen）組織研磨儀中30 Hz下干磨1 min。研磨期間，為了保持每個管中真菌都能夠被充分研磨，每隔15 s中斷一次，進行研磨管位置的重新調整。然后加入200μl核裂解液，繼續(xù)如上研磨。研磨結束，采用Wizard?基因組DNA純化試劑盒（Promega，USA）提取組織體內的混合DNA，用Nuclease-Free Water溶解。

標準曲線和樣品定量：通過球孢白僵菌的轉錄間隔區(qū)（ITS2）與核糖體RNA序列（GenBank登錄號：AF345539）設計qRT-PCR中的引物和探針。探針：6-FAM-ACAGCTCGCACCGGA-MGB；上游引物：5′-GCCGGCCCTGAAATGG-3′；下游引物：5′-GATTCGAGGTCAACGTTCAGAAG-3′。qPCR試驗在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 上運行，運行體系為20 μl：8 μlNuclease-Free Water，10 μl TaqMan Universal Master Mix Ⅱ，無UNG，上下游引物各0.5μl，1 μl探針。運行過程：95℃預變性2 min，95℃15 s，60℃1 min循環(huán)40次。標準曲線制作：用無菌的0.05%吐溫-80配置108個/mL球孢白僵菌孢子懸浮液，取1 mL至研磨管離心甩去上清，然后按上述方法研磨提取DNA。將提取的108個GZGY-1-3孢子的DNA按10倍梯度從108逐級稀釋至102（考慮到試驗時DNA的劑量，100個孢子的DNA量被認為是儀器檢測的極限），利用qPCR制得。通過標準曲線來對樣品進行絕對定量。

通過對標準品進行10倍梯度稀釋后測定了7個點（108—102）的擴增曲線，得出其標準曲線：=-3.353+35.864（2=0.998）。與生物測定和菌落直徑試驗相一致，選取被侵染第3天的薊馬體內基因拷貝數，進行同一溫度下兩個菌株間數據比較。

1.6 數據處理與分析

用Abbott公式計算累積校正死亡率。用SAS 9.2軟件進行差異顯著性分析。相同溫度下，第3天兩個菌株間殺蟲毒力差異性、平板培養(yǎng)菌落直徑差異性以及被侵染的西花薊馬體內菌體基因拷貝數的差異性均使用檢驗，顯著性水平為＜0.05。基因拷貝數在數據分析前進行對數轉換。

2 結果

2.1 球孢白僵菌GZGY-1-3和SCWJ-2菌株殺蟲毒力比較

生物測定結果顯示，在檢測溫度（20—30℃）范圍內，球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2對西花薊馬成蟲均具有較高致死率。無論任何溫度和何種菌株，西花薊馬從處理后第2天開始死亡，第8天時，SCWJ-2和GZGY-1-3造成的校正死亡率分別為83%—91%和79%—90%（圖1）。以第3天的校正死亡率為指標（對照死亡率為2%—5%），在適溫（20和25℃）下，兩個菌株殺蟲毒力間沒有顯著差異，較高溫度（30℃）下菌株SCWJ-2毒力顯著高于GZGY-1-3（＜0.05）（圖2）。

a：20℃；b：25℃；c：30℃

同一溫度下柱上不同字母表示菌株間差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 球孢白僵菌GZGY-1-3和SCWJ-2菌株菌落直徑比較

平板培養(yǎng)結果顯示，在檢測溫度（20—30℃）范圍內，兩個菌株菌落直徑隨著時間推移而增加，第8天時，菌株SCWJ-2和GZGY-1-3的菌落直徑分別為31—36、28—32 mm（圖3）。對應生物測定結果，選取第3天菌落生長直徑數據，在20、25和30℃下，菌株SCWJ-2菌落直徑均顯著大于菌株GZGY-1-3（＜0.05）（圖4）。

2.3 球孢白僵菌GZGY-1-3和SCWJ-2菌株在被侵染的薊馬體內基因拷貝數

如圖5所示，除30℃下的菌株SCWJ-2之外，兩個菌株在西花薊馬體內的基因拷貝數都在第1天時下降，2 d后又逐漸上升。使用第3天西花薊馬體內的基因拷貝數進行分析，結果如圖6所示，在同一溫度（20或25℃）下，菌株SCWJ-2和菌株GZGY-1-3在西花薊馬體內的基因拷貝數無顯著差異，而在30℃下，菌株SCWJ-2的基因拷貝數顯著高于菌株GZGY-1-3（＜0.05）。

a：20℃；b：25℃；c：30℃

圖3 不同溫度下兩株球孢白僵菌菌株的菌落直徑日生長

Fig. 3 The daily diameter growth of the two strains ofunder different temperatures

圖4 不同溫度下球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2菌落直徑

3 討論

蟲生真菌作為防治害蟲的重要生防因子，其殺蟲效率受實際應用時的環(huán)境溫度的影響。環(huán)境溫度通過影響菌體增殖進而影響蟲生真菌的殺蟲毒力。以前的研究方法中，以顯微鏡法[26]為代表的活體檢測無法進行準確計數，而離體培養(yǎng)的方式[20-23]不能很好的代表被侵染的寄主體內的真菌所處的營養(yǎng)或免疫條件[29]。因此，本研究通過PCR方法檢測真菌在寄主昆蟲體內的基因拷貝數，以檢測離體平板菌落直徑的方法為對照，分析其與生物測定試驗結果的關系。結果表明，在3個溫度下，球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2在蟲體內的基因拷貝數差異，而不是平板菌落直徑差異，與生物測定毒力的差異相一致。在20℃或25℃下兩個菌株的殺蟲效率相似，在30℃下菌株SCWJ-2殺蟲效率顯著高于GZGY-1-3，更適于高溫環(huán)境對西花薊馬的防治。

a：20℃；b：25℃；c：30℃

菌株SCWJ-2在30℃相對高溫下，殺蟲效果顯著高于GZGY-1-3，可能由于其更好的高溫耐受力?？紤]到SCWJ-2和GZGY-1-3分別來自四川和貴州，這兩個地區(qū)的溫度環(huán)境有一定的差異，菌株來源地不同可能造成兩者在相對高溫下耐熱力不同，進而造成殺蟲毒力的不同。這與俞佳等的結論基本相似[30-31]。

袁盛勇等[11,32]研究表明，球孢白僵菌菌株MZ041016和MZ060812在孢子濃度分別為3.6×108和3×108個/mL時，對西花薊馬成蟲的致死率為分別為82.31%和88.42%；王雅卉等[33]研究表明，菌株CYT4侵染西花薊馬第6天后累積校正死亡率為49.78%。本研究生物測定結果顯示，25℃下兩個菌株在孢子濃度107個/mL時，8 d后對西花薊馬的致死率分別為89%（菌株SCWJ-2）和86%（菌株GZGY-1-3），達到了對西花薊馬較好的毒力效果。綜合考慮對高溫的耐受能力，菌株SCWJ-2和GZGY-1-3是有潛力用于防治西花薊馬的高效菌株[12]。

圖6 不同溫度下球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2侵染西花薊馬3 d后體內基因拷貝數對數

白僵菌侵染西花薊馬的實時熒光定量結果表明，與處理 0 h 相比，菌株SCWJ-2和GZGY-1-3的基因拷貝數大部分在處理24 h時下降，而處理48和72 h時開始回升。侵染初期孢子拷貝數下降可能與以下因素有關：（1）薊馬的活動將體表部分孢子抖落；（2）孢子穿透昆蟲表皮所造成的損耗。Anderson等[28]在研究球孢白僵菌和綠僵菌感染家蠅（）時也發(fā)現了相似的生長模式。而30℃下菌株SCWJ-2拷貝數在24 h時并未下降反而上升，這可能是由于30℃為菌株SCWJ-2的適宜溫度，宿主體內的真菌增殖彌補了體表真菌的損失和消耗。

30℃下，菌株SCWJ-2在薊馬體內的拷貝數顯著高于GZGY-1-3，這與前者比后者具有更高的殺蟲毒力這一生物測定結果相一致。在20或25℃下，兩個菌株在蟲體內拷貝數和生物測定毒力方面結果一致，均無顯著差異，這說明在一定程度上，菌株在宿主昆蟲體內增殖的差異性決定了菌株的毒力不同。此外，真菌在昆蟲體內增殖時，還會產生毒素等[34]，這是否也會導致不同溫度下不同菌株毒力的差異，還需進一步研究。

菌落直徑（真菌在寄主體外生長）檢測結果顯示，在3個檢測溫度下，菌株SCWJ-2菌落直徑均大于GZGY-1-3，20℃和25℃下兩個菌株的菌落直徑差異性與生物測定結果不一致，只有在30℃下與生物測定結果相一致。可見，檢測離體情況下平板培養(yǎng)的真菌菌落直徑這一方法有一定的局限性。真菌在入侵到昆蟲體內時，會接觸到昆蟲血腔中特有的營養(yǎng)環(huán)境[35]和免疫響應系統(tǒng)[25,36]，這是與離體培養(yǎng)基所提供的環(huán)境截然不同的。此外，溫度對平板培養(yǎng)的真菌菌落直徑的影響通常選取的是第7—10天的數據[19,37-38]，遠遠超過了真菌在昆蟲體內的增殖時期。因此，真菌在活體昆蟲內的增殖很難用體外平板上菌落直徑這一數據來準確描述。與之相比，不同溫度下宿主昆蟲體內真菌的基因拷貝數更好地解釋了耐熱性不同菌株殺蟲效率的差異。

4 結論

在適溫下，球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2均對西花薊馬有較好的殺蟲效率。在較高的溫度下，菌株SCWJ-2比GZGY-1-3在被侵染的薊馬體內基因拷貝數更大，引起的校正死亡率更高，更適合高溫季節(jié)對西花薊馬進行生物防治。真菌在蟲體內的基因拷貝數很好地解釋了不同菌株和不同溫度條件引起的殺蟲毒力的差異。結果為球孢白僵菌在高溫季節(jié)防治西花薊馬的可行性提供了理論支持。

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growth kinetics and virulence of TwoStrains inunder different temperatures

LIU Xiaochen, WU Shengyong, LEI Zhongren, WANG Haihong

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

【Objective】The objective of this study is to compare the growth kinetics and virulence of two strains ofinfected Western flower thrips () under different temperatures, analyze the relationship between the proliferation and insecticidal virulence of, and to provide a theoretical support for improving the efficiency ofagainst.【Method】Firstly, from 1st to 8th day, the mortality of the infectedwith two strains of(SCWJ-2 and GZGY-1-3) under 20, 25, and 30℃ was recorded, and cumulative corrected mortality was calculated while uninfectedwas used as control. The mortality ofinfected with the two strains at the 3rd day (the mortality of control was 2%-5%) was compared. Secondly, under 20, 25 and 30℃, the colony diameter of the two strains was recorded continuously from 1st to 8th day. The colony diameter of the two strains at the 3rd day was compared. Finally, the DNA mixture ofinfected with fungi from 1st to 3rd day under 20, 25 and 30℃ was extracted, respectively. The real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to quantify the copy number of fungi within each insect host sample. The gene copy of two strains under the same temperature at the 3rd day was compared. 【Result】The bioassay results ofagainstshowed that within the tested temperature range (20-30℃), both strains GZGY-1-3 and SCWJ-2 were highly lethal toadults. No matter what the temperature or the strain, the dead individualsappeared from the 2nd day after treatment. On the 8th day, the corrected mortality ofinfected by strain SCWJ-2 and GZGY- 1-3 was 83%-91% and 79%-90%, respectively. The corrected mortality ofinfected by the two strains on the 3rd day was compared (the morality of control were 2%-5%). the virulence of strain SCWJ-2 was significantly higher than that of GZGY-1-3 under 30℃(＜0.05), but there was no significant difference between them under 25 and 20℃(＞0.05). Within the tested temperature range from 20 to 30℃, the colony diameter of two strains increased with time. On the 8th day, the colony diameter of the strains SCWJ-2 and GZGY-1-3 was 31-36 and 28-32 mm, respectively. On the 3rd day, the colony diameter of strain SCWJ-2 was significantly larger than that of strain GZGY-1-3 under all test temperatures(＜0.05). The results of qRT-PCR showed that, with the exception of strain SCWJ-2 at 30℃, the gene copy number of both strains indecreased on the 1st day and gradually increased after 2 days at all the three temperatures. The gene copy number of strain SCWJ-2 withinwas significantly higher than that of strain GZGY-1-3 under 30℃(＜0.05), but there was no significant difference between them under 25 and 20℃(＞0.05). 【Conclusion】 The number of fungal gene copies within insect host was affected by strains and temperatures, which is in accordance with the result of bioassay. Compared withstrain GZGY-1-3, strain SCWJ-2 is more suitable for controllingunder high temperatures.

;; fungal growth kinetics; real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR)

（責任編輯 岳梅）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.006

2017-10-30；

2017-11-21

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0201205）、國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系（CARS-25-B-07）

劉曉晨，E-mail：1804486941@qq.com。

雷仲仁，Tel：010-62815930；E-mail：leizhr@sina.com。通信作者王海鴻，Tel：010-62815930；E-mail：wanghaihong2020@sina.com