齊傳翔，徐奎，牟玉蓮，楊述林，李奎，吳添文

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豬CBR1基因不同拷貝形式克隆及其多態(tài)性分析

齊傳翔1,2，徐奎1,3，牟玉蓮1，楊述林1，李奎1，吳添文1

（1中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2揚州大學獸醫(yī)學院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009；3山東藍思種業(yè)股份有限公司，山東日照 276800）

【目的】獲得豬CBR1基因不同拷貝形式編碼區(qū)序列，了解其序列特征，分析豬CBR1基因不同拷貝形式的多態(tài)性及其與繁殖性能間的相關性?！痉椒ā恳晕逯干截i睪丸組織的cDNA為模板，采用克隆測序技術獲得豬CBR1基因不同拷貝形式編碼區(qū)序列。利用DNASTAR對CBR1不同拷貝形式編碼的氨基酸序列進行分析。利用DNAMAN軟件分析豬CBR1基因不同拷貝形式間的同源性，及其與多個哺乳動物間的同源性。利用ExPaSy提供的Protparam 在線軟件分析豬CBR1基因不同拷貝的蛋白質(zhì)理化特性。采集136頭大白和47頭長白繁殖母豬耳組織樣，提取基因組DNA，采用PCR-測序檢測豬CBR1基因不同拷貝形式的多態(tài)位點，分析其與繁殖性能的相關性。【結(jié)果】豬CBR1基因的3個不同拷貝形式均編碼3個外顯子，其編碼區(qū)序列全長分別為870，870和846bp，其12—18位氨基酸殘基均為保守的GlyXXXGlyXGly序列，符合CBRs家族的結(jié)構特性。同源性比對結(jié)果顯示，CBR1基因不同拷貝形式的CDS序列同源性達87%以上，不同哺乳動物間的CBR1基因的CDS序列同源性達82%以上，可見哺乳動物CBR1基因在進化過程中比較保守。CBR1的3種不同拷貝形式編碼蛋白質(zhì)的理化特性較為相近，均不穩(wěn)定，且為親水性蛋白，說明其3個不同拷貝形式可能在體內(nèi)發(fā)揮著類似的功能。多態(tài)性分析結(jié)果顯示，拷貝V1中發(fā)現(xiàn)5個SNP位點，拷貝V2中發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，拷貝V3中發(fā)現(xiàn)2個SNP位點。大白豬中，拷貝V1的啟動子上游153 bp處的A/T突變和外顯子3的379 bp處的C/T突變，拷貝V2上游10 bp處的AC插入突變、外顯子1—63 bp處C/T突變和內(nèi)含子1—76 bp處G/T突變與產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關。長白豬中的SNP位點則與繁殖性能不相關?！窘Y(jié)論】獲得了豬CBR1基因不同拷貝形式的編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)了5個與大白豬經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)顯著相關的SNP位點，CBR1基因可能作為有價值的候選基因應用于大白豬的繁殖性能選育。

豬；羰基還原酶1基因；重測序；de-novo組裝

0 引言

【研究意義】提高繁殖性能是豬育種的重要目標。純系選育和配套雜交一直是豬傳統(tǒng)育種的重要手段，但其周期長，需耗費大量的人力、物力和財力，如丹麥用50年的時間才將長白豬的胎產(chǎn)仔數(shù)提高到1.0頭[1]，嚴重制約豬傳統(tǒng)育種的發(fā)展。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的快速發(fā)展，利用相關技術研究影響豬繁殖性能的相關基因，尋找提高豬繁殖性能的新方法[2]，對更好地了解豬的分子育種、縮短育種時間，加快育種進程具有重要的理論和實際意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)外學者已對豬繁殖性狀的分子遺傳改良開展了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)雌激素受體（estrogen receptor, ER）基因[3]、催乳素（prolactin receptor, PRLR）基因[4]、促卵泡素β亞基（follitropin subunit beta, FSHβ）基因[5-6]、骨橋蛋白（osteopontin, OPN）[7]、視黃醇結(jié)合蛋白4（retinol binding protein 4, RBP4）[8]等均不同程度地影響豬的繁殖效率。羰基還原酶（carbonyl reductases, CBRs）是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的氧化還原酶，其重要成員——羰基還原酶1（carbonyl reductases 1, CBR1），在藥物代謝[9]、細胞保護[10-11]和腫瘤發(fā)生[12-15]等眾多生理過程發(fā)揮著重要作用。CBR1也在生殖系統(tǒng)中表達[16-17]，主要參與前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）向前列腺素F2-alpha（PGF2α）的轉(zhuǎn)變[18-19]，在動物的妊娠階段發(fā)揮著重要作用[20-22]。前期研究對五指山豬基因組進行重測序[23]，通過De-novo組裝發(fā)現(xiàn)：豬CBR1基因具有4個拷貝，其中3個拷貝具有完整的開放閱讀框，另一個為假基因?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于人、嚙齒類動物CBR1基因功能研究的報道較多，但對于豬CBR1基因的報道較少，尤其是其多個不同拷貝形式的序列及其多態(tài)性與繁殖性能間的相關性仍未見研究報道?！緮M解決的關鍵問題】本試驗選擇CBR1基因作為研究影響母豬繁殖性能的候選基因，獲取該基因的不同拷貝形式的編碼區(qū)序列，探討其在多態(tài)性與母豬繁殖性能的關聯(lián)性，以期為豬的繁殖性能選育提供新的分子標記。

1 材料與方法

試驗于2014年1月至2015年12月在中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所實驗室進行。

1.1 試驗樣本

五指山豬睪丸組織樣品于中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所南口基地采集，置于液氮中凍藏，用于提取組織總RNA。對江蘇省常州市豬場的48頭大白母豬和47頭長白母豬、江蘇省南通市豬場的42頭大白母豬、海南省?？谑胸i場的46個大白母豬的耳組織進行采樣，置于裝有75%酒精的離心管中，用冰盒帶回實驗室，用于提取基因組DNA。采集樣本的母豬均為隨機選取，體況良好，并有繁殖性能記錄。

1.2 RNA和DNA提取

采用 TRlzol Reagent（Invitrogen 公司）提取五指山豬睪丸組織總RNA，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo公司）進行反轉(zhuǎn)錄，具體方法詳見說明書。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃冰箱中保存。

采用常規(guī)的酚/氯仿法提取不同豬種耳組織基因組。

1.3 RT-PCR與克隆測序

根據(jù)前期五指山豬重測序de novo拼接結(jié)果，于NCBI網(wǎng)站的引物設計軟件(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）對豬CBR1基因具有完整開放閱讀框的3個拷貝形式（V1、V2和V3）設計引物，引物信息見表1，并以五指山豬睪丸組織的cDNA為模板進行擴增。RT-PCR反應程序：98 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min、退火1 min、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Gel Purification Kit 凝膠回收試劑盒（Omega公司）進行PCR產(chǎn)物純化。純化產(chǎn)物克隆入pMD19-T vector（TaKaRa公司），并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中；采用質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen 公司）提取質(zhì)粒，送天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

表1 豬CBR1基因不同拷貝形式mRNA序列擴增引物

1.4 序列分析

利用DNASTAR對CBR1不同拷貝形式編碼的氨基酸序列進行分析。利用DNAMAN軟件分析豬CBR1基因不同拷貝形式間的序列相似度，及其與其它物種的同源性。利用ExPaSy提供的Protparam在線軟件分析豬CBR1基因不同拷貝的蛋白質(zhì)理化特性。部分哺乳動物CBR1基因序列均從GenBank數(shù)據(jù)庫下載，包括大鼠（, NM_019170.2）、小鼠（, NM_007620.2）、人（, NM_ 001757.3）、猴（, XM_015132918.1）、牛（, NM_001034513.1）、羊（, XM_004003397.3）和犬（, XM_847582.3）、豬（, NM_214073.1）。

1.5 不同豬種CBR1基因多態(tài)性分析

為了進一步檢測CBR1基因不同拷貝形式的SNP位點，并分析這些SNP位點對于母豬產(chǎn)仔性能的影響，根據(jù)前期五指山豬重測序de novo拼接結(jié)果，于NCBI網(wǎng)站的引物設計軟件對豬CBR1基因具有完整開放閱讀框的3個拷貝形式設計了9對引物，涵蓋了該基因三個拷貝的所有外顯子區(qū)域（表2）。PCR反應程序：98 ℃預變性5 min；95℃變性40-60 s、退火40—60 s、72℃延伸40-60 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送由天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

1.6 統(tǒng)計方法

利用SPSS19.0軟件的廣義線性模型（GLM）對各繁殖性能值與基因型間的關系進行最小二乘法估計：繁殖性能觀察值=群體均值+基因型效應+隨機殘差效應，結(jié)果以“最小二乘均數(shù)±標準差”的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 豬CBR1基因不同拷貝形式的擴增

鑒于CBR1基因在生殖器官中表達，本研究采集了五指山豬的睪丸組織，并進行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。以五指山豬睪丸組織cDNA為模板，利用CBR1-V1、CBR1-V2和CBR1-V3引物進行擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到特異性良好且與目的片段大小一致的擴增片段（圖1）。測序后發(fā)現(xiàn)擴增片段長度分別為940、1 116和952 bp，與引物設計時預期長度一致。

2.2 豬CBR1基因不同拷貝形式編碼區(qū)序列分析

將mRNA序列與前期獲得的五指山豬重測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，V1的CDS全長為870 bp，編碼289個氨基酸，含3個外顯子，長度分別為289，108和473 bp。V2的mRNA序列與NCBI中的CBR1基因序列（NM_214073.1）相符，其CDS全長為870 bp，編碼289個氨基酸，含3個外顯子，長度分別為289，108和473 bp。V3的CDS全長為846 bp，編碼281個氨基酸，含3個外顯子，長度分別為289，108和449 bp。3個拷貝形式所有內(nèi)含子邊界均符合GT-AG規(guī)則。利用DNASTAR對CBR1不同拷貝形式編碼的氨基酸序列進行分析，3個拷貝氨基端的12—18位氨基酸殘基為保守的GlyXXXGlyXGly序列（圖2），符合CBRs家族的結(jié)構特性[21]。

1-2：V1擴增產(chǎn)物，3-5：V2擴增產(chǎn)物，6-7：V3擴增產(chǎn)物，M：100 bp marker

利用DNAMAN軟件對CBR1基因的CDS序列進行比對，發(fā)現(xiàn)V1與V2序列的同源性高達90%，與V3的同源性高達87%。此外，CBR1基因在不同哺乳動物物種間的同源性較高，人與猴間的同源性最高，為96%，與豬之間的同源性為84%，與大鼠、小鼠間的同源性略低，但也達到了82%。

2.3 豬CBR1的蛋白質(zhì)結(jié)構分析

使用ExPaSy提供的Protparam在線軟件（http://web.Expasy.org/protparam）分析豬CBR1基因不同拷貝形式蛋白質(zhì)序列的各項理化參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：豬CBR1基因拷貝V1的分子式為C1397H2255N393O425S13，分子量為31 773.43，理論等電點為6.12，消光系數(shù)為28 460，體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)41.21，脂肪系數(shù)為91.00，疏水性均值（GRAVY）為-0.208。豬CBR1基因拷貝V2的分子式為C1401H2243N395O419S11，分子量為31 677.28，理論等電點為7.60，消光系數(shù)為29825，體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)42.15，脂肪系數(shù)為87.34，疏水性均值為-0.237。豬CBR1基因拷貝V3的分子式為C1352H2183N379O408S10，分子量為30 596.10，理論等電點為7.63，消光系數(shù)為22 710，體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)42.31，脂肪系數(shù)為90.50，疏水性均值為-0.205。上述結(jié)果表明，CBR1基因的3個不同拷貝形式的蛋白質(zhì)均較不穩(wěn)定（一般認為蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)小于40時，表示預測的蛋白穩(wěn)定；大于40時，預測蛋白不穩(wěn)定），且為親水性蛋白。

表2 CBR1基因不同拷貝形式多態(tài)性擴增引物信息

圖2 豬CBR1基因不同拷貝形式的氨基酸序列分析

左圖：豬CBR1基因不同拷貝形式間的同源性分析；右圖：豬CBR1基因拷貝V2與不同物種間的同源性分析

2.4 豬CBR1基因不同拷貝形式的多態(tài)性分析及其與繁殖性能的相關性

針對常州、南通和海口市的136頭大白和47頭長白繁殖母豬的進行SNP分型。所涉及的引物涵蓋了3個拷貝的所有外顯子區(qū)域。序列拼接結(jié)果顯示，所有的大白、長白豬個體，均含有3個完整的CBR1不同的拷貝類型，序列與五指山豬一致。

用于不同拷貝基因型分析的9對引物中，5對引物的擴增產(chǎn)物檢測到多態(tài)性位點。

拷貝V1中，CBR1-V1-EX1擴增產(chǎn)物檢測到拷貝V1啟動子上游153 bp處存在A/T突變；CBR1-V1-EX2擴增產(chǎn)物檢測到拷貝V1內(nèi)含子1的836 bp處存在A/G突變；CBR1-V1-EX3擴增產(chǎn)物檢測到拷貝V1外顯子3的73 bp處存在A/G突變，賴氨酸突變?yōu)榫彼幔?52 bp處均存在A/G突變，為同義突變，均編碼纈氨酸，379 bp處存在C/T突變，絲氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?/p>

拷貝V2中，CBR1-V2-EX1擴增產(chǎn)物中檢測到拷貝V2啟動子上游10 bp處存在CA插入突變，外顯子1的63 bp檢測到C/T突變，為同義突變，均編碼異亮氨酸，67 bp處均檢測到C/T突變，精氨酸突變?yōu)樯彼幔瑑?nèi)含子1的76 bp處檢測出G/T突變。

拷貝V3中，CBR1-V3-EX3擴增產(chǎn)物檢測到拷貝V3的外顯子3的358 bp存在C/T突變，纈氨酸突變?yōu)楸彼?，外顯子3的374 bp存在A/G突變，為同義突變，均編碼亮氨酸（圖4）。

其中，CBR1不同拷貝形式的多態(tài)性與繁殖性能間的分析結(jié)果顯示，各SNP位點上不同基因型的長白豬的經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)、經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)差異均不顯著（≥0.05）。大白豬中，拷貝V1的啟動子上游153bp TT基因型個體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AT基因型（=0.047），外顯子3—379 bp處TT基因型個體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于CT基因型（=0.042）；拷貝V2上游10 bp處無AC插入的純合子基因型個體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AC插入純合子基因型（=0.028），外顯子1—63 bp處CC基因型個體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于TT基因型（=0.027），內(nèi)含子1—76 bp處GG基因型個體的經(jīng)產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于TT基因型（=0.026，表3）。

3 討論

提高繁殖性能是豬育種的重要目標，國內(nèi)外學者已就豬繁殖性狀做了大量的研究，但幾乎都是從單個或者多個基因的結(jié)構、功能及其與上下游基因之間的關系進行研究[24-26]。關于基因不同拷貝數(shù)及其拷貝類型對于繁殖性狀的影響及其作用機制卻尚未見報道。本研究基于前期對五指山豬的基因組重測序的結(jié)果，針對參與繁殖性能調(diào)控的多拷貝基因——CBR1開展研究，為進一步增加對豬繁殖性狀調(diào)控機制的認識提供了新的分子基礎。

本研究獲得了CBR1基因3種不同拷貝形式的全長編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)不同拷貝形式氨基端的12—18位氨基酸殘基為保守的GlyXXXGlyXGly序列，符合CBRs家族的結(jié)構特性，可借此形成Rossman折疊，與不同輔因子結(jié)合[27]。

表3 CBR1基因多態(tài)性與繁殖性能相關性分析

相同指標同列數(shù)據(jù)標不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）；標相同字母或無字母標注表示差異不顯著（＞0.05）

In the same column, values with different small letter mean significant difference (＜0.05); While with the same or no letter mean no significant difference (＞0.05)

CBR1基因不同拷貝類型形式的CDS序列同源性達87%以上，不同哺乳動物間的CBR1基因的CDS序列同源性達82%以上，一方面說明不同哺乳動物CBR1基因在進化過程中比較保守，另一方面也說明CBR1可能在不同物種內(nèi)均發(fā)揮著重要的生物學功能。

CBR1基因的3種不同拷貝形式編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構相似，生理、生化特性接近，說明3個不同拷貝形式可能在體內(nèi)發(fā)揮著類似的功能。同時，這3種蛋白質(zhì)均不穩(wěn)定，且為親水性蛋白，可能與其發(fā)揮氧化還原作用有關。

目前，關于豬CBR1基因的SNP分型尚未見報道。本研究中，3個拷貝形式中共計檢測出11個SNP位點，拷貝V1中發(fā)現(xiàn)5個SNP位點，拷貝V2中發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，拷貝V3中發(fā)現(xiàn)2個SNP位點。大白豬中，拷貝V1的啟動子上游153 bp處的A/T突變和外顯子3—379 bp的C/T突變，拷貝V2上游10 bp處的AC插入突變、外顯子1—63 bp處C/T突變和內(nèi)含子1—76 bp處G/T突變與產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關。研究表明，在母豬發(fā)情周期、胚胎植入以及妊娠等炎性事件中，黃體變化起著重要作用[28-29]，而由于PGE2和PGF2α對黃體分別具有保護和溶解功能[30]，因此作為催化PGE2向PGF2α轉(zhuǎn)化的關鍵酶[31]，CBR1的表達可能受到上述SNP位點的影響而發(fā)生改變，但有待于進一步的研究證實。此外，在長白豬中，這些SNP位點上不同基因型母豬的繁殖性能間未檢測到顯著差異，一方面可能與品種差異性有關，另一方面也可能是本研究中長白母豬的樣本數(shù)較少，導致一些基因型的檢出率低所致。今后將進一步補充樣本，包括采集以高產(chǎn)仔數(shù)而聞名的太湖豬種進行研究，進一步驗證相關分子標記的準確性。

4 結(jié)論

本研究獲得了豬CBR1基因3個不同拷貝形式的編碼區(qū)序列，了解了其基因特征和蛋白性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)了5個與大白豬經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)顯著相關的SNP位點，為大白豬的繁殖性能選育提供了理論基礎和新的分子標記。

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Cloning of Porcine CBR1 Gene’s Different Copy Forms and Analysis of Its Polymorphism

QI ChuanXiang1,2, XU KUI1,3, MU YuLian1,YANG ShuLin1, LI Kui1, WU TianWen1

(1Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Veterinary Medicine, Yangzhou University/Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, Jiangsu;3Shandong Lansi Seeds Industry Co.,Ltd, Rizhao 276800, Shandong)

【Objective】 In order to obtain and analysis the different copy forms of CBR1 gene coding region, and analysis the correlation between polymorphism and reproductive performance of different copy forms of CBR1 gene in pigs.【Method】 Based on the cDNA of the Wuzhishan pig’s testis , the different copy sequences of CBR1 gene were obtained by cloning sequencing technology. The amino acid sequences encoded by different copy forms of CBR1 gene were analyzed by DNASTAR software. Homology between different copy forms of porcine CBR1 gene, and that compared with other mammals were analyzed using DNAMAN software. The physical and chemical properties of different proteins of porcine CBR1 gene were analyzed by Protparam online software on ExPaSy. 136 Yorkshire and 47 Landrace pig ears samples were selected for DNA extraction and PCR-sequencing to explore the relationship between polymorphism of CBR1 gene and porcine reproductive performance. 【Result】 All the three different copies of CBR1 gene encoded 3 exons, and the sequence length of the coding region were 870bp, 870bp and 846bp respectively. Their 12-18th amino acid residues were GlyXXXGlyXGly, which were in accordance with the CBRs family structural characteristics. The results of homology comparison showed that the CDS sequence homology among different copies of CBR1 gene was more than 87%, and more than 82% among different mammals, indicated that the CBR1 gene of mammal was conserved in evolution process. The physical and chemical properties of 3 different copies of CBR1 were similar, all of them were unstable and belong to hydrophilic proteins, which indicated that they may play a similar role in vivo. Polymorphism analysis showed that 5 SNPs were found in copy V1, 4 SNPs were found in copy V2, and 2 SNPs were found in copy V3. In the Yorkshire pigs, the A/T mutation at the promoter upstream region 153 bp and the C/T mutation at exon3 379 bp in V1; AC insertion at the promoter upstream region 10 bp, C/T mutation at exon 1 63 bp and G/T mutation at intron1 76 bp in V2, were significantly correlated with the multiparous alive litter size, while the SNPs in Landrace pigs were not associated with reproductive performance. 【Conclusion】 Coding region sequence of 3 different copies of CBR1 gene were obtained; 5 SNPs were found significantly associated with multiparous alive litter size , suggested that CBR1 gene may be used as a valuable candidate gene for improving breeding performance of Yorkshire pigs.

swine; CBR1 gene; re-sequencing; de-novo assembly

（責任編輯 林鑒非）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.018

2017-08-16；

2018-01-05

國家自然科學基金（31201780）、國家重大科學研究計劃（2015CB943101）

齊傳翔，E-mail：245484498@qq.com。

吳添文，E-mail：wutianwen@caas.cn