趙天瑤，張亞宏，金濤，康玉凡

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綠豆萌發(fā)過程中蛋白組分及亞基變化

趙天瑤1，張亞宏1，金濤2，康玉凡1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100193；2濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心/湖北省澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北荊州 434025）

【目的】探索不同萌發(fā)時(shí)期綠豆分離蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以及蛋白質(zhì)組分（分離蛋白、球蛋白和清蛋白）的亞基組成及含量變化，為綠豆蛋白的加工利用提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎玫入婞c(diǎn)沉淀法提取綠豆分離蛋白，并根據(jù)Osborne分類法制備綠豆清蛋白、谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，比較分析萌發(fā)前后綠豆分離蛋白及各蛋白組分含量的變化，同時(shí)通過SDS-PAGE電泳進(jìn)一步分析萌發(fā)前后蛋白亞基組成及數(shù)量的變化?！窘Y(jié)果】隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠豆分離蛋白的含量呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，萌發(fā)36 h時(shí)與未萌發(fā)的綠豆相比提高了9.4%。綠豆清蛋白含量隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸下降的趨勢(shì)，萌發(fā)84 h時(shí)含量最小，為20.47 mg?g-1。球蛋白隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，萌發(fā)48 h時(shí)其含量最大，且比未萌發(fā)時(shí)提高了3.47倍。萌發(fā)對(duì)綠豆醇溶蛋白的含量變化影響不大。綠豆谷蛋白含量在萌發(fā)12—36 h和48—72 h變化無明顯差異，但相對(duì)于未萌發(fā)的綠豆仍有一定程度的提高。綠豆蛋白酶活性在萌發(fā)36 h后不斷上升，變化相對(duì)較大，72 h時(shí)開始下降。SDS-PAGE電泳圖及光密度掃描分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠豆分離蛋白主要由7條條帶組成（Ⅰ—Ⅶ），萌發(fā)過程中各條帶相對(duì)含量不斷減少，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，分子量在25—66 kD的條帶含量逐漸降低，分子量在18—25 kD的亞基條帶含量在萌發(fā)的前72 h有所增加，萌發(fā)至96 h時(shí)幾乎只剩下Ⅳ條帶。綠豆清蛋白主要由4條條帶組成（Ⅰ—Ⅳ），分子量分別為61.56、48.99、29.88和20.42 kD，萌發(fā)過程中條帶Ⅰ相對(duì)含量從0 h的18.4%降至60 h的16.4%，萌發(fā)72 h后條帶Ⅰ消失；條帶Ⅱ在萌發(fā)過程中始終存在，但是含量不斷減少；條帶Ⅲ和條帶Ⅳ也在萌發(fā)過程中不斷減少，萌發(fā)72 h后消失。同時(shí)，分子量為18—25 kD的亞基條帶相對(duì)含量在24—60 h增加，萌發(fā)至72 h逐漸消失，幾乎只剩下條帶Ⅱ。綠豆球蛋白主要由5條條帶組成（Ⅰ—Ⅴ），分子量分別為66、61、50、32和26 kD。萌發(fā)過程中亞基條帶Ⅰ和Ⅱ都在萌發(fā)96 h時(shí)消失；而條帶Ⅲ在萌發(fā)過程前期（0—60 h）相對(duì)含量逐漸增大，為34.4%—41.8%，萌發(fā)72 h后條帶Ⅲ含量迅速下降，萌發(fā)至96 h時(shí)僅為10.8%；亞基條帶Ⅳ和Ⅴ萌發(fā)至84 h后消失。分子量在18—25 kD的亞基條帶在萌發(fā)24—60 h時(shí)有所增加，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)降解甚至消失?！窘Y(jié)論】適當(dāng)萌發(fā)能提高蛋白的含量，促進(jìn)大分子亞基發(fā)生水解，同時(shí)有利于小分子亞基或多肽生成，但萌發(fā)時(shí)間過長(zhǎng)并不完全利于蛋白的利用。

綠豆；萌發(fā)；蛋白組分；亞基

0 引言

【研究意義】隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步，人民生活質(zhì)量不斷改善，對(duì)食品的健康越來越關(guān)注。目前，天然產(chǎn)品的價(jià)值正在超過合成產(chǎn)品，由于動(dòng)物蛋白價(jià)格昂貴，利用率有限，在世界范圍內(nèi)尤其在一些貧窮國(guó)家，低價(jià)的膳食纖維蛋白不斷被利用，人們對(duì)植物蛋白的關(guān)注正在不斷增強(qiáng)?；谖覈?guó)人多地少和糧食轉(zhuǎn)化效率低的現(xiàn)狀，開發(fā)植物蛋白刻不容緩。綠豆是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源作物，其蛋白的生產(chǎn)成本僅為動(dòng)物蛋白的15%左右，具有廣闊的應(yīng)用前景和豐富的保健功能[1-3]。萌發(fā)后的綠豆不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值增加，同時(shí)含有豐富的蛋白質(zhì)和生物活性[4]。然而，目前綠豆的工業(yè)化多以生產(chǎn)淀粉為主，綠豆蛋白卻被用作牲畜飼料或者廢棄物，資源浪費(fèi)嚴(yán)重[5]。因此，研究綠豆萌發(fā)過程中各蛋白組分及亞基含量的變化，有利于開發(fā)綠豆蛋白的應(yīng)用潛力，提高其有效利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】種子在萌發(fā)過程中內(nèi)部新陳代謝增加，分子量較大的貯藏蛋白被水解和消耗，不溶性氮含量下降；蛋白質(zhì)組分及其氨基酸構(gòu)成發(fā)生變化，影響其營(yíng)養(yǎng)及功能特性[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，小扁豆和馬嘴豆蛋白質(zhì)的含量會(huì)逐漸上升[8]；萌發(fā)5 d后的豌豆分離蛋白含量有所增加，是潛在的食品添加劑[9]。此外，種子萌發(fā)可以使谷物和豆類等中有毒、有害或抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量有所減少或消除，提高蛋白與淀粉的消化率，同時(shí)也可以增加谷物內(nèi)某些限制性氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量[10]。豆類在萌發(fā)過程中不僅蛋白質(zhì)含量會(huì)增加，同時(shí)其亞基組成也會(huì)發(fā)生一定的變化。SAVELKOUL等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，大豆萌發(fā)過程中一些大的蛋白質(zhì)亞基條帶在萌發(fā)1—2 d時(shí)開始消失，萌發(fā)2 d后蛋白質(zhì)小分子亞基逐漸出現(xiàn)；大豆7S球蛋白的α、α’亞基和11S球蛋白的酸性亞基在萌發(fā)過程中不同程度的被分解，分子量在20.0—35.0 kD的亞基條帶在萌發(fā)后出現(xiàn)[10,13]。王素雅等[14]對(duì)萌發(fā)過程中小扁豆蛋白亞基的變化研究發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)第3天后小扁豆蛋白質(zhì)中分子量較大的酸性亞基發(fā)生降解，一些分子量較小的亞基條帶（28—32、20和10 kD）出現(xiàn)，但是一些原始亞基（35、30、12和11 kD）并未發(fā)生變化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管萌發(fā)能夠提高種子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和蛋白含量已得到充分的研究證實(shí)，但對(duì)綠豆不同萌發(fā)時(shí)期蛋白含量和亞基變化的研究鮮有報(bào)道，探索其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律對(duì)蛋白的開發(fā)和利用十分重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過研究綠豆萌發(fā)過程中蛋白組分含量的動(dòng)態(tài)變化，并進(jìn)一步探究其蛋白亞基組成及含量的變化規(guī)律，為提高綠豆蛋白的利用提供重要的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)開拓綠豆的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017—2017年在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

供試綠豆品種為‘白綠8號(hào)’（蛋白質(zhì)含量為（27.23± 0.80）g/100 g，脂肪含量為（0.62±0.06）g/100 g，總糖含量為（36.35±0.78）g/100 g），由吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。氫氧化鈉、鹽酸、氯化鉀、氯化鈉、三氯乙酸、蔗糖、乙醇、丙酮、溴酚藍(lán)均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭慌Ｑ宓鞍?、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)于北京廣達(dá)恒益科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

人工氣候培養(yǎng)箱（上海比朗儀器有限公司）；HW.SY21-KP4恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器有限公司）；KDN-08C定氮儀（上海雷磁儀器廠）；UV759CRT紫外分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；Centrifuge 5810R離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）；索氏脂肪抽提器（天津玻璃儀器廠）；RADWAG分析天平（北京乾明基因技術(shù)有限公司）；TKHZ-C型恒溫振蕩器（北京佳源興業(yè)科技有限公司）；JY600C型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 萌發(fā)處理 挑選大小一致、健康飽滿綠豆籽粒，加入80℃的蒸餾水（1﹕3）燙種3 min后加常溫蒸餾水浸泡10 h；最后將浸泡好的綠豆種子平鋪到發(fā)芽盤中，將發(fā)芽盤放入人工氣候箱中避光孵育，條件設(shè)定溫度為（22±1）℃，濕度（80±5）%，每隔6 h澆水一次[15-16]。每隔12 h取樣一次，取樣后經(jīng)液氮處理，保存在-40℃冰箱中備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取

（1）綠豆分離蛋白制備 綠豆除雜后進(jìn)行烘干、磨粉，過80目篩備用。稱取2 g（精確到0.0001 g）左右樣品，置于干燥的燒杯中，加入蒸餾水浸泡，用0.5 mol?L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)提取液的pH，后放入恒溫水浴鍋中進(jìn)行浸提。30 min后將燒杯混合液倒入離心管中，在-4℃、400 r/min的條件下離心20 min，吸取上清液，將其pH調(diào)至4.6，同時(shí)加入0.05 mol?L-1HCl溶液攪拌，使沉淀均勻。得到的沉淀經(jīng)過冷凍干燥后可得綠豆蛋白粉[17]。

（2）綠豆各蛋白組分制備 采用Osborne分級(jí)提取工藝[18-20]的方法，略作修改。脫脂后的萌發(fā)綠豆粉溶于蒸餾水中，料液比為1﹕10，在室溫條件下攪拌1 h后離心（8 000×，20 min，4℃），過濾上清液，加入500 mL蒸餾水再次進(jìn)行水提，操作條件與之前相同。合并兩次所得上清液，調(diào)節(jié)等電點(diǎn)進(jìn)行酸沉后離心（8 000×，20 min，4℃），冷凍干燥的成品即為清蛋白。

將提取清蛋白后的沉淀用0.5 mol?L-1NaCl進(jìn)行浸提，在室溫條件下攪拌浸提1 h后離心（8 000×，20 min，4℃），過濾上清液。再加500 mL 0.5 mol?L-1NaCl對(duì)沉淀進(jìn)行再次浸提，操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液，調(diào)節(jié)等電點(diǎn)并離心獲得沉淀，進(jìn)行冷凍干燥，所得樣品即為球蛋白。

將提取球蛋白后所得的沉淀用70%（v/v）的乙醇進(jìn)行浸提，在室溫條件下攪拌浸提1 h后離心（8 000×，20 min，4℃），過濾上清液。然后再用70%乙醇對(duì)沉淀再次浸提，操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后再進(jìn)行冷凍干燥，所得樣品即為醇溶蛋白。

將提取醇溶蛋白后所得的沉淀用0.05 mol?L-1的NaOH溶液進(jìn)行浸提，室溫條件下攪拌浸提1 h后離心（8 000×，20 min，4℃），過濾上清液。然后再用0.05 mol?L-1NaOH溶液對(duì)沉淀進(jìn)行再次浸提，操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液，邊攪拌邊向其中滴加20%（w/v）的三氯乙酸，至三氯乙酸的最終濃度為5%（w/v），離心后所得沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌3次；然后將沉淀進(jìn)行熱風(fēng)干燥，所得樣品即為谷蛋白。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量和蛋白酶活力的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定萌發(fā)后各蛋白的含量，以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[21]；蛋白酶活力參照凌猛等[22]方法，以酪氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定275 nm處吸光值，結(jié)果以U?mg-1表示。

1.3.4 SDS-PAGE電泳 參照LAEMMLI等[23]的方法，采用濃度為12%的分離膠，濃度為5%的濃縮膠進(jìn)行不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳，板的厚度約1.5 mm。稱取1.5 mg的不同蛋白樣品，加入樣品緩沖液（0.1 mol?L-1Tris-HCl、1% SDS、0.1 g?L-1溴酚藍(lán)、150 g?L-1蔗糖，pH 8.0）500 μL，電泳前靜置一夜或沸水浴3—5 min，離心后上樣，上樣量為10 μL。

電泳時(shí)采用恒流模式，樣品在濃縮膠部分時(shí)采用20 mA電流進(jìn)行電泳，在分離膠部分將電流增至40 mA。采用考馬斯亮藍(lán)溶液R-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色1 h，然后使用脫色液進(jìn)行過夜脫色。采用JY系列凝膠成像分析用于電泳結(jié)束后凝膠條帶的觀察、拍攝，采用Quantity-one軟件（version4.6）進(jìn)行光密度掃描分析，根據(jù)各蛋白條帶遷移率計(jì)算各亞基相對(duì)分子量，并計(jì)算各蛋白組分含量及純度。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)處理均平行測(cè)定3次，運(yùn)用Excel整理各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果。所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS software Ver.20.0（SPSS Inc.，Chicago，Illinois）的LSD（最小顯著性差異法）進(jìn)行差異顯著性分析（＜0.05），圖表中各結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 綠豆萌發(fā)過程各蛋白組分含量

圖1顯示了不同萌發(fā)時(shí)期綠豆分離蛋白含量的變化。隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠豆分離蛋白含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，萌發(fā)36 h時(shí)綠豆分離蛋白含量達(dá)到最高，為23.3×10-2g?g-1，萌發(fā)96 h時(shí)其含量最小，為8.79×10-2g?g-1，并且前36 h內(nèi)綠豆分離蛋白含量變化無明顯差異，與未萌發(fā)的綠豆相比，適當(dāng)?shù)拿劝l(fā)使綠豆分離蛋白的含量提高了9.4%，但是隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠豆分離蛋白含量逐漸下降，并且均小于未萌發(fā)的綠豆分離蛋白含量。因此，較長(zhǎng)時(shí)間的萌發(fā)并不利于綠豆分離蛋白的積累。

圖1 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆分離蛋白含量變化

圖2表示不同萌發(fā)時(shí)期綠豆各蛋白含量的變化。由圖2-A可以看出，萌發(fā)過程中綠豆清蛋白含量為20.74—146.42 mg?g-1，并且隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠豆清蛋白的含量逐漸降低，且在不同的萌發(fā)時(shí)期含量具有顯著性差異（＜0.05），在萌發(fā)0 h時(shí)其含量最大，為146.42 mg?g-1，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，在84 h時(shí)含量最小，為20.74 mg?g-1。在萌發(fā)過程中，綠豆球蛋白含量20.74—92.83 mg?g-1，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠豆球蛋白的含量先升高后下降，且在不同的萌發(fā)時(shí)期含量具有顯著性差異（＜0.05），在0 h時(shí)含量最小，在萌發(fā)48 h時(shí)其含量為最大，且比未萌發(fā)時(shí)提高了3.47倍（圖2-B）。萌發(fā)對(duì)綠豆醇溶蛋白的含量變化影響不大；萌發(fā)72 h時(shí)其含量最大，為2.62 mg?g-1，在84 h時(shí)其含量最小，為1.93 mg?g-1（圖3-C）。綠豆谷蛋白含量在萌發(fā)12—36 h內(nèi)和48—72 h內(nèi)變化無顯著性差異，但是整體上萌發(fā)過程提高了綠豆谷蛋白的含量（圖3-D）。通過對(duì)綠豆分離蛋白、清蛋白以及球蛋白含量的比較和分析可知，清蛋白和球蛋白含量變化是引起綠豆分離蛋白含量變化的重要因素。

2.2 蛋白酶活性變化

圖3所示為不同萌發(fā)時(shí)期綠豆蛋白酶活力變化。在綠豆種子整個(gè)萌發(fā)過程中蛋白酶活性總體呈上升的趨勢(shì)。在萌發(fā)0—36 h期間，蛋白酶活性有所上升，但變化相對(duì)較小；萌發(fā)36 h后酶活性仍不斷上升，變化相對(duì)較大。萌發(fā)72 h時(shí)活性趨勢(shì)變化出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，蛋白酶活性開始下降。種子萌發(fā)過程中，蛋白酶被激活和釋放，從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，這對(duì)萌發(fā)過程中綠豆內(nèi)部代謝及貯藏蛋白的變化有重要作用[24]。

2.3 綠豆萌發(fā)蛋白質(zhì)SDS-PAGE及亞基相對(duì)含量

2.3.1 綠豆分離蛋白SDS-PAGE分析 圖4所示為不同萌發(fā)時(shí)期綠豆分離蛋白在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳得到的電泳圖譜。由圖可知，綠豆分離蛋白主要由7條條帶所組成（Ⅰ—Ⅶ）。隨著萌發(fā)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，綠豆分離蛋白不同分子量的亞基含量發(fā)生變化，其中分子量在25—66 kD條帶含量逐漸降低，條帶變?nèi)?；而分子量?8—25 kD的亞基條帶含量在萌發(fā)前60 h左右有所增加，條帶加強(qiáng)，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，所有的亞基條帶都發(fā)生降解，含量減少，條帶減弱，并且在萌發(fā)至96 h時(shí)幾乎只剩下Ⅳ條帶。

圖2 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆各蛋白含量變化

圖3 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆蛋白酶活力變化

采用光密度掃描分析電泳圖結(jié)果見表1，不同萌發(fā)時(shí)期，綠豆分離蛋白組分存在差異。在萌發(fā)過程中，條帶Ⅰ—Ⅶ的相對(duì)含量不斷減少，分別為1.07%—0.26%、5.28%—0.53%、6.61%—1.0%、38.5%—15.7%、3.43%—1.02%、9.89%—1.42%及9.69%—2.67%，即萌發(fā)使分子量較大的組分發(fā)生降解，降解為小分子蛋白組分。這是由于萌發(fā)過程中蛋白水解酶活性提高，使蛋白發(fā)生了降解[25]。但分子量在18—25 kD的蛋白條帶相對(duì)含量在萌發(fā)前72 h不斷提高，條帶加強(qiáng)，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，小分子量的組分都會(huì)發(fā)生降解，最后幾乎只剩Ⅳ條帶。這些變化與萌發(fā)過程中理化性質(zhì)的變化有一定的相關(guān)性。

2.3.2 綠豆清蛋白SDS-PAGE分析 圖5所示為不同萌發(fā)時(shí)期綠豆清蛋白在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳得到的電泳圖譜。由圖可知，綠豆清蛋白主要由4條條帶所組成（Ⅰ—Ⅳ），分子量分別為61.56、48.99、29.88及20.42 kD。隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠豆清蛋白不同分子量的亞基含量發(fā)生變化，4條亞基含量逐漸降低，條帶不斷減弱，萌發(fā)至72 h時(shí)，有的條帶消失，萌發(fā)至96 h幾乎只剩下條帶Ⅱ，同時(shí)從圖譜中可以看出分子量為18—25 kD的亞基含量在萌發(fā)24—60 h有所增加，條帶加強(qiáng)，但是在萌發(fā)后期也出現(xiàn)條帶不斷減弱直至消失，幾乎只剩下條帶Ⅱ。

采用光密度掃描分析電泳圖結(jié)果見表2，由表可知，不同萌發(fā)時(shí)期的綠豆清蛋白多肽或亞基存在差異，相對(duì)含量為Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅳ。萌發(fā)過程中條帶Ⅰ相對(duì)含量為從開始的18.4%降至60 h的16.4%，萌發(fā)72 h后條帶Ⅰ消失，條帶Ⅱ在萌發(fā)過程中始終存在，但是含量不斷減少，相對(duì)含量從51.1%降至27.0%，條帶Ⅲ和條帶Ⅳ也在萌發(fā)過程中不斷減少，至萌發(fā)72 h后消失，這與綠豆萌發(fā)過程中清蛋白含量減少相一致。同時(shí)，分子量在18—25 kD的亞基條帶含量在24—60 h增加，可能是大分子多肽降解后形成小分子多肽條帶，但是萌發(fā)至72 h后，這部分的亞基條帶逐漸消失，幾乎只剩下條帶Ⅱ。

2.3.3 綠豆球蛋白SDS-PAGE分析 圖6所示為不同萌發(fā)時(shí)期綠豆球蛋白在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳得到的電泳圖譜。在該條件下，綠豆球蛋白主要由5條條帶所組成（Ⅰ—Ⅴ），分子量分別為66、61、50、32和26 kD。隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠豆球蛋白不同分子量的亞基含量發(fā)生變化，其中綠豆球蛋白亞基條帶Ⅰ含量在萌發(fā)過程中逐漸下降且在萌發(fā)84 h后消失；萌發(fā)初期8S球蛋白Ⅲ亞基條帶出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，這與球蛋白在萌發(fā)過程中的含量變化相一致，8S的其他亞基條帶相對(duì)含量逐漸下降，甚至出現(xiàn)了條帶消失，這是由于萌發(fā)過程中蛋白酶活性增加，使得大分子亞基或多肽出現(xiàn)降解。同時(shí)，在萌發(fā)24—60 h的18—25 kD小分子量亞基條帶有所增加，但隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，小分子亞基也會(huì)出現(xiàn)降解甚至消失。這說明適當(dāng)?shù)拿劝l(fā)使大分子亞基發(fā)生水解，有利于小分子亞基或多肽生成。

圖4 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆分離蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

表1 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆分離蛋白組分相對(duì)含量

圖5 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆清蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

表2 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆清蛋白亞基或多肽相對(duì)含量

采用光密度掃描分析電泳圖如表3所示，萌發(fā)過程亞基條帶Ⅰ含量為14.4%—1.45%，萌發(fā)至96 h時(shí)條帶Ⅰ消失；萌發(fā)過程中條帶Ⅱ相對(duì)含量為6.57%—3.36%，萌發(fā)至96 h時(shí)條帶Ⅱ消失；而條帶Ⅲ在萌發(fā)過程前期0—60 h時(shí)相對(duì)含量逐漸增大，為34.4%—41.8%，當(dāng)萌發(fā)72 h后條帶Ⅲ含量迅速下降，萌發(fā)至96 h時(shí)僅為10.8%；亞基條帶Ⅳ和Ⅴ在萌發(fā)過程中的相對(duì)含量分別為5.80%—2.27%和9.60%—2.96%，萌發(fā)至84 h時(shí)，兩條帶消失。

3 討論

3.1 綠豆萌發(fā)過程中各蛋白組分含量的變化

豆類種子萌發(fā)過程中蛋白酶、淀粉酶、植酸酶被激活，使得蛋白質(zhì)、碳水化合物及脂肪等被降解，豆類的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功能特性得以提高[26]。大豆種子在整個(gè)萌發(fā)過程中蛋白酶的活性總體呈上升趨勢(shì)，萌發(fā)0—39 h期間蛋白酶活性變化較小，萌發(fā)72 h后活性下降[27]，與本研究中綠豆萌發(fā)過程中蛋白酶活性的變化一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆[28]、小扁豆[29-30]和豌豆[31]種子在萌發(fā)過程中球蛋白含量都呈逐漸降解的趨勢(shì)；銀杏種子在整個(gè)萌發(fā)過程中，其球蛋白和清蛋白含量呈逐漸下降趨勢(shì)，醇溶蛋白和谷蛋白含量變化幅度較小[32]，這與本研究的結(jié)果基本一致。種子萌發(fā)過程中各蛋白組分降解成胚及幼苗生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，釋放能量用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和分化，促進(jìn)種子的萌發(fā)及幼苗形成[32]。前人在研究萌發(fā)過程中蕎麥蛋白的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)使蕎麥的清蛋白減少，谷蛋白含量增加，這與綠豆的萌發(fā)過程蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化有相似性，從營(yíng)養(yǎng)角度看，蛋白組分的含量變化尤其是不易被人體消化的清蛋白減少，更有利于人體的吸收[33]。有研究表明，面筋蛋白的主要構(gòu)成是醇溶蛋白和谷蛋白，而醇溶蛋白和谷蛋白含量在作物中的含量普遍較低，這是影響食品加工特性（黏彈）的重要因素[34]。綠豆萌發(fā)后蛋白質(zhì)的含量及組分發(fā)生改變，這可能會(huì)有助于提高蛋白的加工特性。

圖6 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆球蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

表3 不同萌發(fā)時(shí)期綠豆球蛋白各組分亞基或多肽相對(duì)含量

3.2 綠豆萌發(fā)過程中分離蛋白亞基的變化

綠豆主要4種蛋白——清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白占綠豆蛋白的比例分別約為49.60%、23.58%、19.42%、7.47%，即綠豆蛋白主要以清蛋白和球蛋白為貯藏蛋白，這與前人關(guān)于豆類植物和許多雙子葉植物中主要蛋白是清蛋白和球蛋白的研究結(jié)論一致[35-36]。在種子的萌發(fā)過程中不僅有胚的發(fā)育，體內(nèi)貯藏蛋白也會(huì)分解和轉(zhuǎn)化[37]。研究發(fā)現(xiàn)，豇豆萌發(fā)過程中的蛋白質(zhì)條帶數(shù)量呈下降趨勢(shì)[38]；大豆蛋白質(zhì)隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，其大分子蛋白質(zhì)逐漸消失[27]；不同蕓豆品種發(fā)芽過程中蛋白亞基變化的總體趨勢(shì)是分子量越大的亞基越早消失，分子量越小的亞基越晚消失[39]；此外，小麥[40]、豌豆[41]、花生[42]、玉米[43]等種子隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，其大分子的蛋白質(zhì)亞基首先被降解，之后較小的蛋白質(zhì)亞基開始降解，與本研究的結(jié)果一致。這一過程提高了蛋白質(zhì)的功能特性，有助于消化。本研究中，通過綠豆分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖和組分含量變化表可知，綠豆分離蛋白的主要亞基有7種，分子量集中在45—66 kD及18—35 kD這兩個(gè)區(qū)域，在萌發(fā)初期以大分子為主，變化較小，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，幾乎所有的蛋白條帶和含量都發(fā)生變化，較大分子量的蛋白含量減小，有的甚至在萌發(fā)后期出現(xiàn)幾乎快要消失的現(xiàn)象，小分子蛋白的含量有所上升，這與前人研究的萌發(fā)過程中少量的貯藏蛋白在有限的區(qū)域降解的觀點(diǎn)相符[44]。

3.3 綠豆萌發(fā)過程中清蛋白亞基的變化

綠豆清蛋白中各類必需氨基酸含量較高，是相對(duì)于其他組分蛋白較為優(yōu)質(zhì)的蛋白，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。有研究表明，綠豆清蛋白主要含有6條蛋白分子條帶，分別是136.88、61.56、48.99、29.88、25.66和20.42 kD，其中分子量為48.99 kD的條帶較寬、顏色深，說明綠豆清蛋白以該亞基分子組分居多[45]，這與本研究中基本一致。在本研究中，萌發(fā)初期即0—24 h條帶Ⅱ含量變化較小，原因可能是大分子量蛋白的降解補(bǔ)充了該分子量蛋白降解的量，因此前期變化較小[27]，同時(shí)條帶Ⅱ在整個(gè)萌發(fā)過程中始終存在，但也是不斷地減弱，與之相反的是一些小分子量的蛋白（14.4—35 kD）含量有所增加，但是在萌發(fā)后期都會(huì)發(fā)生降解，含量較少。綠豆清蛋白在體內(nèi)的消化率較低，是較難消化的蛋白，可能是因?yàn)榍宓鞍讓?duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，但是萌發(fā)后清蛋白含量下降，大分子蛋白被降解，會(huì)使綠豆清蛋白的消化率提高[46]。

3.4 綠豆萌發(fā)過程中球蛋白亞基的變化

綠豆球蛋白主要分為8S球蛋白和11S球蛋白，其中8S球蛋白占球蛋白總量的89%左右，分子量約為200 kD，共由4個(gè)多肽分子構(gòu)成；而綠豆的11S球蛋白則與其他豆類的有所差異，含量較小，分子量約為360 kD，主要由40和24 kD兩種亞基通過二硫鍵構(gòu)成；另外，研究表明綠豆中還含有少量的堿性7S球蛋白，含量極小[1]。本研究與前人研究相一致。隨著萌發(fā)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)大分子蛋白條帶Ⅰ和Ⅱ顏色變淺，寬度逐漸變窄，甚至在萌發(fā)至72 h開始慢慢消失，而條帶Ⅲ則出現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，可能是因?yàn)閯傞_始萌發(fā)時(shí)，大分子蛋白被分解成較小分子蛋白，補(bǔ)充了這部分蛋白分子的含量，因此剛開始有所增加，萌發(fā)48 h后會(huì)迅速降解，這是因?yàn)槊劝l(fā)時(shí)綠豆體內(nèi)的酶活性增加，使蛋白分子降解。同時(shí)，一些小分子蛋白條帶（14.4—25 kD）在萌發(fā)前60 h時(shí)不斷增加，之后不斷減少甚至消失。綠豆8S球蛋白中不含有二硫鍵，而11S球蛋白中含有二硫鍵，綠豆萌發(fā)時(shí)，11S球蛋白條帶不斷地減少，可能是由于萌發(fā)過程中，酶活性增加后使11S球蛋白的二硫鍵斷裂，降解成41 kD和20 kD的亞基。

通過分析可知，綠豆分離蛋白與綠豆清蛋白和球蛋白電泳圖變化相似，說明綠豆清蛋白和球蛋白是綠豆的主要貯藏蛋白，在萌發(fā)過程中分離蛋白的變化主要由清蛋白和球蛋白所引起，清蛋白SDS-PAGE電泳圖亞基條帶主要集中在45—66 kD和25—35 kD兩個(gè)區(qū)域，球蛋白與其相似，這與楊繼民[47]利用SDS-PAGE分離蕎麥清蛋白、球蛋白、分離蛋白的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

綠豆分離蛋白的含量隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，清蛋白含量呈逐漸下降的趨勢(shì)，球蛋白呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，醇溶蛋白含量變化較小，谷蛋白含量有所增加。萌發(fā)不同時(shí)期蛋白的亞基條帶存在差異，綠豆分離蛋白、清蛋白的大分子亞基條帶（25—66.2 kD）在萌發(fā)過程中不斷降解，含量不斷減少，小分子亞基條帶（18—25 kD）在萌發(fā)前期和中期含量不斷增加；綠豆球蛋白在萌發(fā)過程中條帶Ⅲ（50 kD）一直存在，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其他與分離蛋白和清蛋白亞基變化一致，萌發(fā)后期大分子與小分子量蛋白含量繼續(xù)減少甚至消失。綜上所述，適當(dāng)萌發(fā)可以提高綠豆蛋白的加工特性，有利于人體消化吸收，可加強(qiáng)綠豆蛋白功能性食品的開發(fā)與應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

The Changes of Protein Components and Subunits in Process of Mung Bean Germination

ZHAO TianYao1, ZHANG YaHong1, JIN Tao2, KANG YuFan1

(1College of Agronomy, China Agricultural University, Beijing 100193;2Engineering Research Center of Ecology and Agricultural use of Wetland, Ministry of Education/Hubei Key Laboratory of waterlogging disaster and wetland agriculture, Jingzhou 434025, Hubei)

【Objective】In order to provide the scientific basis for processing and utilization of mung bean protein, the dynamic changes of mung bean isolated protein, albumin, globulin, gluten and gliadin in different germination stages were investigated.【Method】The isolated protein of mung bean were extracted by isoelectric point precipitation method, and the albumin, gluten, globulin and gliadin of mung bean were prepared according to Osborne classification. The content of each kind of proteins and the activity of protease were determined in different germination period. The changes of composition and quantity of protein subunit before and after germination were further analyzed by SDS-PAGE electrophoresis.【Result】With the extension of germination time, the contents of mung bean isolated protein increased first and then decreased. The mung bean isolated protein was increased by 9.4% compared to non-germinated mung bean. The mung bean albumin content was decreased after the germination, which the minimum value was 20.47 mg?g-1. The globulin content was increased first and then decreased with the increasing of germination time, with the minimum was observed at 0 h and the highest at 48 h after germination. However, the gliadin content was not influenced by the germination. There was no significant difference in the gluten content of mung bean between the 12-36 h and 48-72 h germination, but the content is still higher than non-germinated seed. Mung bean protease activity increased within 36 h germination, and began to decline at 72 h. Analysis of SDS-PAGE electrophoresis and optical density scanning results showed that there were 7 bands (Ⅰ-Ⅶ) in the mung bean isolated protein, and the relative content of each band decreased continuously. After the germination, the molecular weight of 25 kD to 66 kD proteins gradually decreased. The content of 18 kD and 25 kD isolated proteins increased within 72 h germination, and almost only remained Ⅳ after 96 h of germination. Mung bean albumin mainly consisted of four bands (Ⅰ-Ⅳ) with molecular weights of 61.56, 48.99, 29.88 and 20.42 kD, respectively. During the germination process, the relative content of Band I decreased from 18.4% at 0 h to 16.4% at 60 h, and disappeared at 72 h after germination. Although the Band II existed during the whole germination, the relative content of Band II was decreased continuously from 51.1% to 27.0%. Bands Ⅲ and Ⅳ decreased continuously with the germination, and disappeared after 72 h of germination. What’s more, the relative contents of subunit bands with a molecular weight of 18-25 kD increased at 24-60 h and disappeared after 72 h of germination. Mung bean globulin mainly consists of five bands (Ⅰ-Ⅴ) with molecular weights of 66, 61, 50, 32 and 26 kD, respectively. The relative content of subunit bands I and II were disappeared after 96 h of germination. While the relative content of band Ⅲ increased gradually from 34.4% to 41.8% during 0 to 60 h of early stage of germination. Then the band Ⅲ content decreased rapidly after 72 h of germination and measured only 10.8% at 96 h. In the meantime, the relative contents of subunit Band Ⅳ and Ⅴ was not observed after 84 h germination. Subunit bands with a molecular weight of 18-25 kD increased during 24 to 60 h of germination, and then degraded or even disappeared with the germination process.【Conclusion】Appropriate germination not only increase the content of mung bean proteins and promote the hydrolysis of macromolecular subunits, but also facilitates the formation of small molecule subunits or polypeptides.

mung bean; germination; protein component; subunit

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.015

2017-11-10；

2018-01-04

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（食用豆）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-08-07B）

趙天瑤，E-mail：zhaotianyao123@163.com。

康玉凡，E-mail：yfkang@cau.edu.cn