趙祥升，楊美華，吳海峰，舒曉燕

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南 海口 571100；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

巴戟天為茜草科多年生植物巴戟天(MorindaofficinalisHow)的干燥根，是我國著名的南藥和保健藥材，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕之功效，在臨床上主要用于治療陽痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、少腹冷痛、風(fēng)濕痹痛、筋骨萎軟等癥[1]。巴戟天主要分布于廣東、海南、廣西、福建等熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]，主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類、蒽醌類和多糖[3-4]。目前，從巴戟天中已分離得到7種環(huán)烯醚萜苷和34種蒽醌類化合物[5]，并對這些化合物進行了定性和定量分析[6-8]，但尚未見巴戟天中主要環(huán)烯醚萜苷類和蒽醌類化合物裂解行為的報道。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是快速分離和鑒定天然藥物中活性成分的有效方法，電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF MS)等高分辨質(zhì)譜技術(shù)憑借其在質(zhì)量精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)可溯源性等方面的優(yōu)勢，越來越廣泛地應(yīng)用于中藥分析領(lǐng)域[9-10]。利用LC-Q-TOF MS 既可以獲得化合物的分子離子信息，又可以在碰撞碎裂后獲得豐富的離子碎片信息，有助于準確推測其可能的分子式以及化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律[11]。環(huán)烯醚萜苷類和蒽醌類化合物在電噴霧負離子模式下有較高的靈敏度，能夠獲得豐富的碎片離子信息[12-13]。

本工作擬在UPLC-ESI-Q/TOF MS負離子模式下，對巴戟天中主要的4種環(huán)烯醚萜苷(水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、車葉草苷酸和車葉草苷)和2種蒽醌類(甲基異茜草素和甲基異茜草素-1-甲醚)化合物的質(zhì)譜裂解行為進行研究，以期為其他同類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供技術(shù)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Waters AcquityTMUPLC 色譜儀，Waters Xevo G2-XS四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；Mili-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品；DK-S型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；XS105DU電子分析天平：上海托利多有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

巴戟天：采自海南，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所南藥資源中心鑒定為茜草科植物巴戟天(MorindaofficinalisHow)的根；甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；實驗用水：Mili-Q超純水；水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、車葉草苷酸和車葉草苷對照品：純度>98%，上海同田生物科技有限公司產(chǎn)品；甲基異茜草素和甲基異茜草素-1-甲醚對照品：純度>98%，成都克洛瑪生物科技有限公司產(chǎn)品。6種對照品的結(jié)構(gòu)式示于圖1。

圖1 6種對照品的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of 6 compounds

1.3 實驗條件

電噴霧離子源(ESI)，負離子掃描模式；毛細管電壓2.5 kV；錐孔電壓50 V；離子源溫度125 ℃；校正液為亮氨酸腦啡肽；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200；脫溶劑氣(N2)流速800 L/h；脫溶劑氣溫度600 ℃；碰撞氣為氬氣；注射泵直接進樣。

1.4 供試溶液的制備

精密稱取適量的水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、車葉草苷酸、車葉草苷、甲基異茜草素和甲基異茜草素-1-甲醚對照品，用甲醇溶解，并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，使對照品濃度為1 mg/L，過0.22 μm濾膜，即得供試溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析

電噴霧電離是一種軟電離技術(shù)，易得到相對分子質(zhì)量信息，但利用該技術(shù)產(chǎn)生的準分子離子內(nèi)能較小，產(chǎn)生的碎片離子較少[14]。在ESI-模式下的一級質(zhì)譜中，6種對照品化合物均檢測到脫氫準分子離子峰[M-H]-，幾乎沒有碎片離子，易于確定化合物的相對分子質(zhì)量。在得到準分子離子后，調(diào)整碰撞誘導(dǎo)解離能，可獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息，6種化合物[M-H]-離子的ESI-MS/MS譜圖示于圖2。

2.2 二級質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

2.2.1環(huán)烯醚萜苷 環(huán)烯醚萜類化合物的基本母核是環(huán)烯醚萜醇，具有環(huán)狀烯醚及半縮醛羥基，半縮醛羥基性質(zhì)活潑，故該類化合物多以苷類存在[15]。巴戟天中的環(huán)烯醚萜苷屬于環(huán)戊烯型，由1個特征的二氫吡喃環(huán)順式連接1個五元環(huán)。通常，該類化合物首先丟失中性分子H2O、CO2、葡萄糖殘基等，其次是二氫吡喃環(huán)和糖環(huán)(葡萄糖)的斷裂[12]。以車葉草苷酸為例，二氫吡喃環(huán)和糖環(huán)的斷裂途徑示于圖3，其母環(huán)斷裂后形成的特征離子可用于鑒別母核結(jié)構(gòu)[12,15]。

注：a.水晶蘭苷；b.去乙酰車葉草苷酸；c.車葉草苷酸；d.車葉草苷；e.甲基異茜草素；f.甲基異茜草素-1-甲醚圖2 6種化合物[M-H]-離子的ESI-MS/MS圖譜Fig.2 ESI-MS/MS spectra of [M-H]- ions of 6 compounds

圖3 環(huán)烯醚萜苷類化合物的裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of iridoid glycosides

調(diào)節(jié)碰撞電壓，對車葉草苷酸的準分子離子[M-H]-m/z431進行CID分析，產(chǎn)生了m/z371、269、251、225、191、165、147、179、119等碎片離子(圖2c)，其中m/z371比m/z431減少了60 u，推測可能是C8位上中性丟失了1分子CH3COOH，而相似的丟失也發(fā)生在m/z191與m/z251之間。在環(huán)烯醚萜苷的MS/MS中，中性丟失葡萄糖殘基(162 u，Glc)和葡萄糖(180 u，Glucose)比較常見，離子m/z269 (m/z431-162 u)和m/z251(m/z431-180 u)均是由此產(chǎn)生的。碎片離子m/z225、251是由前體離子m/z269脫去C4(6)上的CO2和H2O 分子形成；m/z251 進一步失去1分子CO2得到碎片離子m/z207。此外，還發(fā)現(xiàn)了脫去乙烯酮(C2H2O)的現(xiàn)象，如m/z183(m/z225 -C2H2O)、m/z165(m/z207-C2H2O)的形成。由上述分析可知，車葉草苷酸主要的裂解途徑是丟失Glc、CO2、H2O、CH3COOH、C2H2O等母環(huán)上的功能基團。

圖4 ESI負離子模式下，車葉草苷酸可能的裂解途徑 Fig.4 Proposed fragmentation pathways of asperulosidic acid in ESI-MS/MS

車葉草苷的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜裂解途徑與車葉草苷酸類似，但其裂解途徑較車葉草苷酸簡單，在MS/MS中形成的碎片離子較少，主要有m/z147、191等(圖2c)，這些離子主要是由母環(huán)脫去取代基生成的。但增加解離電壓后，沒有發(fā)現(xiàn)二氫吡喃環(huán)斷裂的特征離子，只發(fā)現(xiàn)了糖環(huán)斷裂特征離子m/z119。ESI負離子模式下車葉草苷的裂解行為示于圖5。

圖5 ESI負離子模式下，車葉草苷可能的裂解途徑 Fig.5 Proposed fragmentation pathways of asperuloside in ESI-MS/MS

去乙酰車葉草苷酸的結(jié)構(gòu)與車葉草苷酸類似，僅脫去1分子乙烯酮。在MS/MS中，去乙酰車葉草苷酸主要脫去母核的取代基，如H2O、CO2、葡萄糖殘基或葡萄糖。碎片離子m/z371、345、227、209是由準分子離子m/z389[M-H]-分別脫去1分子H2O、CO2、葡萄糖殘基和葡萄糖形成；離子m/z371、209、191失去1分子CO2，形成碎片離子m/z327、165、147；離子m/z327、191、165、147也有可能由其前體離子(m/z345、209、183、165)失去1分子H2O形成。去乙酰車葉草苷酸中母環(huán)和糖環(huán)也發(fā)生了斷裂，形成了m/z119、113、101、89、71、59等離子，但母環(huán)較糖環(huán)斷裂后形成的碎片離子豐度低。去乙酰車葉草苷酸可能的裂解途徑示于圖6。

水晶蘭苷為去乙酰車葉草苷酸的同分異構(gòu)體，二者的質(zhì)譜裂解行為類似，主要是母核上取代基的丟失和糖環(huán)的斷裂，但碎片離子豐度不同。水晶蘭苷在ESI負離子模式下可能的裂解途徑示于圖7，其裂解行為在越桔屬植物中已有報道[19]。

2.2.2蒽醌 蒽醌類化合物中，酚羥基上O原子和苯環(huán)間存在p-π共軛，共軛體系結(jié)構(gòu)決定了其分子的穩(wěn)定性。在質(zhì)譜選擇性離子碰撞誘導(dǎo)解離中，該類化合物的主要裂解方式是逐級失去母核基團中CO并保留共軛體系。此外，側(cè)鏈取代基(主要為OH、CH3、OCH3、COOH)容易以H2O、CH3、CH2、 CO2等中性小分子片段的形式丟失[20-21]。

甲基異茜草素與甲基異茜草素-1-甲醚的結(jié)構(gòu)相似，僅C1位的取代基(OH、OCH3)不同，在ESI負離子模式下均能生成信號較強的[M-H]-準分子離子(m/z253和m/z267)，二者可能的裂解途徑示于圖8。在MS/MS下，離子m/z225和m/z209 由分子離子峰[M-H]-m/z253 分別丟失1分子CO和CO2所得；m/z225繼續(xù)失去1分子CO得到m/z197 碎片離子；離子m/z209分別失去1分子CO和CH2得到碎片離子m/z181 和m/z195。甲基異茜草素-1-甲醚準分子離子峰[M-H]-m/z267 的裂解比甲基異茜草素簡單，主要產(chǎn)生了m/z252 [M-H-CH3]-和m/z224 [M-H-CH3-CO]-2個碎片離子。

圖6 ESI負離子模式下，去乙酰車葉草苷酸可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of deacetyla sperulosidic acid in ESI-MS/MS

圖7 ESI負離子模式下，水晶蘭苷可能的裂解途徑Fig.7 Proposed fragmentation pathways of monotropein in ESI-MS/MS

圖8 ESI負離子模式下，甲基異茜草素可能的裂解途徑Fig.8 Proposed fragmentation pathways of rubiadin in ESI-MS/MS

3 結(jié)論

使用ESI-Q-TOF MS/MS技術(shù)研究了巴戟天中4種環(huán)烯醚萜苷和2種蒽醌類化合物的裂解行為，分析了化合物在負離子模式下主要的特征碎片離子、裂解模式和相應(yīng)的質(zhì)譜圖。環(huán)烯醚萜苷在ESI-模式下主要的裂解途徑首先是脫去母環(huán)上的功能取代基，如H2O、CO2、CH3COOH和糖單元等；其次是母環(huán)上半縮醛結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化造成二氫吡喃環(huán)和糖環(huán)的斷裂。而蒽醌類化合物，逐級丟失CO和取代基是該類成分主要的裂解途徑。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版(一部)[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：81.

[2] YONG J P, LU C Z, HUANG S J, et al. Chemical components isolated from the roots ofMorindaofficinalis[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2015, 51(3): 548-549.

[3] CHOI J, LEE K T, CHOI M Y, et al. Antinociceptive anti-inflammatory effect of Monotropein isolated from the root ofMorindaofficinalis[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28(10): 1 915-1 918.

[4] ZHANG H L, ZHANG Q W, ZHANG X Q, et al. Chemical constituents from the roots ofMorindaofficinalis[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2010, 8(3): 192-195.

[5] 黃珍珍. 巴戟天的化學(xué)成分及其生物活性研究[D]. 廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[6] 吳凌鳳,曾令杰. 巴戟天化學(xué)成分與質(zhì)量控制研究進展[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報,2012,28(1):98-101.

WU Lingfeng，ZENG Lingjie. Chemical constituents from the roots ofMorindaofficinalisand the quality control[J]. Journal of Guangdong Pharmaceutical University, 2012, 28(1): 98-101(in Chinese).

[7] LI C, DONG J, TIAN J, et al. LC/MS/MS determination and pharmacokinetic study of iridoid glycosides monotropein and deacetylasperulosidic acid isomers in rat plasma after oral administration ofMorindaofficinalisextract[J]. Biomedical Chromatography, 2015, 30(2): 163-168.

[8] 王美玲,張清清,付爽,等. UPLC-Q-TOF MSE技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)庫篩查方法快速分析巴戟天化學(xué)成分[J]. 質(zhì)譜學(xué)報,2017,38(1):75-82.

WANG Meiling, ZHANG Qingqing, FU Shuang, et al. Characterization ofMorindaofficinalisHow by UPLC-Q-TOF MSEcoupled with UNIFI Database filter[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2017, 38(1): 75-82(in Chinese).

[9] WU H, GUO J, CHEN S, et al. Recent developments in qualitative and quantitative analysis of phytochemical constituents and their metabolites using liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2013, 72(2): 267-291.

[10] LING Y, LIU K, ZHANG Q, et al. High performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization and quadrupole time-of-flight-mass spectrometry as a powerful analytical strategy for systematic analysis and improved characterization of the major bioactive constituents from Radix[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2014, 98(10): 120-129.

[11] 孟哲,石志紅,呂運開,等. 超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查乳制品中磺胺類與氟喹諾酮類藥物[J]. 分析化學(xué),2014,42(10):1 493-1 500.

MENG Zhe, SHI Zhihong, LV Yunkai, et al. Rapid screening of fluoroquinolones and sulfonamides in dairy products using ultra performance liquid chromatography coupled to high resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(10): 1 493-1 500(in Chinese).

[12] 李存滿,梁鑫淼,薛興亞. 電噴霧離子源正離子模式下環(huán)烯醚萜苷的質(zhì)譜裂解行為[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報,2013,34(3):567-572.

LI Cunman, LIANG Xinmiao, XUE Xingya. Electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry of iridoid Glucosieds in positive ion mode[J]. Chemical Journal of Chinese Universtiy, 2013, 34(3): 567-572(in Chinese).

[13] 董靜,王弘,萬樂人,等. 高效液相色譜/電噴霧-離子阱-飛行時間質(zhì)譜分析鑒定中藥虎杖中的主要化學(xué)成分[J]. 色譜,2009,27(4):425-430.

DONG Jing, WANG Hong, WAN Leren, et al. Identification and determination of major constituents inPolygonumcuspidatumSieb.et Zucc by high performance liquid chromatography/electrospray ionization-ion trap-time-of-flight mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2009, 27(4): 425-430(in Chinese).

[14] 李娟,宋樹美,王少敏,等. 電噴霧質(zhì)譜法研究4種青蒿素類藥物的質(zhì)譜裂解特征[J]. 質(zhì)譜學(xué)報,2009,30(3):148-153.

LI Juan, SONG Shumei, WANG Shaomin, et al. Study of fragmentation behavior for 4 artemisinins by electrospray ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2009, 30(3): 148-153(in Chinese).

[15] 李存滿,駱亞薇,田寶勇. 環(huán)烯醚萜苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究進展[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報,2015,39(6):522-526.

LI Cunman, LUO Yawei, TIAN Baoyong. Research progress on mass spectral fragmentation of iridoids[J]. Journal of Hebei Normal University, 2015, 39(6): 522-526(in Chinese).

[16] LI C M, ZHANG X L, XUE X Y, et al. Structural characterization of iridoid glucosides by ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry Rcm, 2008, 22(12): 1 941-1 954.

[17] REN L, XUE X, ZHANG F, et al. Studies of iridoid glycosides using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry Rcm, 2007, 21(18): 3 039-3 050.

[18] ES-SAFI N E, KERHOAS L, DUCROT P H. Fragmentation study of iridoid glucosides through positive and negative electrospray ionization, collision-induced dissociation and tandem mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry Rcm, 2007, 21(7): 1 165-1 175.

[19] HEFFELS P, MüLLER L, SCHIEBER A, et al. Profiling of iridoid glycosides in Vaccinium species by UHPLC-MS[J]. Food Research International, 2017, 100: 462-468.

[20] 董紅嬌,陳曉虎,曾銳. UPLC-Q-Exactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用快速分析民族藥小大黃的化學(xué)成分[J]. 中草藥,2016,47(14):2 428-2 435.

DONG Hongjiao, CHEN Xiaohu, ZENG Rui. Rapid analysis on chemical constituents in roots of Rheum pumilum by UPLC coupled with hybrid quadrupole-orbitrap MS[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，2016, 47(14): 2 428-2 435(in Chinese).

[21] 陳毅,單鳴秋,王海麗,等. UPLC-Q-TOF-MS分析茜草炒炭前后的化學(xué)成分變化[J]. 中國中藥雜志,2017,42(5):923-930.

CHEN Yi, SHAN Mingqiu, WANG Haili, et al. Changes of chemical constituents in Rubiae Radix et Rhizoma before and after carbonized by UPLC-Q-TOF-MS method[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2017, 42(5): 923-930(in Chinese).