黃健萍 王君 林思恩

[摘要] 該研究利用牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有往牙本質(zhì)-牙髓組織分化的潛能，結(jié)合新型生物材料擬鈣粘蛋白多肽修飾的透明質(zhì)酸優(yōu)越的生物學(xué)活性，綜合運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)手段，探討了此支架材料對人牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)為牙本質(zhì)-牙髓組織的能力的影響。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細(xì)胞；牙再生；水凝膠；生物材料；組織工程

[中圖分類號] R7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-5654（2018）03（c）-0162-02

保留有功能的牙髓或者促進(jìn)牙髓再生對于復(fù)雜牙髓疾病的治療具有重要意義。隨著對組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的深入研究，牙髓來源的干細(xì)胞與生物材料、誘導(dǎo)細(xì)胞生長或分化的相關(guān)因子進(jìn)行復(fù)合為牙源性組織再生帶來了新的希望。該研究充分利用牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞（DPSCs）多向分化的潛能，以鈣粘蛋白多肽修飾的透明質(zhì)酸（HA）水凝膠為載體，發(fā)揮 DPSCs 在牙本質(zhì)-牙髓再生中的作用及新型生物材料HA的理想的組織相容性、生物降解性、良好的孔隙率和機(jī)械性能，為復(fù)雜牙髓疾病尋求新的治療手段，具有良好的應(yīng)用前景。

1 方法

1.1 制備鈣粘蛋白多肽修飾的HA多孔水凝膠

配備1%透明質(zhì)酸鈉（74kDa）溶液，加入94%甲基丙烯酸酐，調(diào)整pH至8.0，冰上反應(yīng)24 h。以透析法將溶液中分子量大小為6～8 k的大分子單體進(jìn)行純化。將鈣粘蛋白多肽（Ac-HAVDIGGGC）、亂序多肽（Scr， Ac-AGVGDHIGC）分別與親和素結(jié)合分子RGD（Ac-HAVDI GGGC）相連接。隨后與HA骨架在堿性磷酸鹽緩沖液于37℃過夜。以上材料混合致孔劑（PMMA）可以在紫外照射下以I2959催化交聯(lián)成2%水凝膠樣多孔支架結(jié)構(gòu)。

1.2 牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞（DPSCs）的分離

牙齒完整拔出后沖洗消毒，無菌條件取出牙髓，D-Hanks液反復(fù)沖洗，剪成小塊，加入3 g/LⅠ型膠原酶和4 g/L dispase 消化1～1.5 h；直徑70 μm尼龍篩過濾成單細(xì)胞懸液，500 g/min 離心5 min，將細(xì)胞以含15%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液重懸后接種于塑料培養(yǎng)瓶。細(xì)胞生長接近融合時常規(guī)傳代，擴(kuò)增培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 體外誘導(dǎo)條件水凝膠對DPSCs分化的影響

1.3.1 水凝膠對DPSCs成牙、成脂分化作用 制備鈣粘蛋白水凝膠二維涂層種植DPSCs，體外以成牙、成脂肪培養(yǎng)液培養(yǎng)。其中成牙誘導(dǎo)液組分為H-DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素、地塞米松1 nM、抗壞血酸50 μM和β-磷酸甘油20 mM，行茜素紅或堿性磷酸酶（ALP）染色。成脂誘導(dǎo)液組分為H-DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清、100 μ/mL青鏈霉素、地塞米松50 nM、異丁基甲基黃嘌吟0.5 mM、胰島素10 μg/mL和吲哚美辛50 μM，誘導(dǎo)后行油紅O染色。

1.3.2 水凝膠對DPSCs成神經(jīng)分化影響 鈣粘蛋白水凝膠二維涂層種植DPSCs，以含20%FBS及3 mmol/L巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24 h，洗滌后換成二甲基亞砜（DMSO）和200 mmol/L丁化羥基苯甲醚（BHA）的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)。取培養(yǎng)48 h后行免疫熒光染色觀察DPSCs成神經(jīng)分化潛能，觀察中間絲（Nestin）表達(dá)水平。

1.3.3 Real Time PCR檢測水凝膠對DPSCs的成牙分化影響 成牙分化誘導(dǎo)7 d后，以Trizol提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，參照Takara一步法，檢測Osterix（OSX）、I型膠原（Col 1a1）基因表達(dá)水平。

1.4 裸鼠體內(nèi)條件下水凝膠復(fù)合DPSCs的成牙髓分化效果

按上述體外實(shí)驗(yàn)部分準(zhǔn)備含鈣粘蛋白、亂序多肽及對照組水凝膠包裹DPSCs，細(xì)胞密度為2×107/mL。在特制的模具內(nèi)光交聯(lián)成型。在苯巴比妥鈉腹腔麻醉?xiàng)l件下，8周齡的裸鼠（n=12）背部皮下分別種植含有鈣粘蛋白多肽的水凝膠、亂序多肽修飾的水凝膠及對照組HA水凝膠。8周后，麻醉下處死裸鼠并取樣冰凍切片后作茜素紅和Von Kossa檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 體外條件下水凝膠對DPSCs的成牙、成脂肪、成神經(jīng)分化的影響

經(jīng)成牙分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后，鈣粘蛋白多肽組ALP和茜素紅染色均顯著增強(qiáng)；經(jīng)成神經(jīng)誘導(dǎo)后，免疫熒光檢測到鈣粘蛋白多肽組中間絲（Nestin）的表達(dá)較其它兩組顯著增強(qiáng)，見圖2。取RNA行RT-PCR分析提示，成骨分化指標(biāo)OSX和Col1a1的表達(dá)量較對照組HA顯著增強(qiáng)（均P<0.01），見圖1。

2.2 裸鼠體內(nèi)水凝膠對DPSCs成牙分化的影響

各組三維水凝膠經(jīng)裸鼠體內(nèi)種植8周后，經(jīng)von Kossa染色和茜素紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在每組水凝膠內(nèi)都有不同程度的鈣沉積，以鈣粘蛋白多肽組鈣沉積量最為顯著，見圖2。

3 討論

該研究探討了體內(nèi)和體外人牙髓干細(xì)胞在鈣粘蛋白多肽修飾的HA水凝膠條件下的牙本質(zhì)-牙髓再生能力，結(jié)果提示，鈣粘蛋白多肽修飾的HA水凝膠可以作為牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的理想支架，有助于牙本質(zhì)-牙髓再生。

牙髓具有自我修復(fù)及再生能力，當(dāng)牙髓組織受到外來刺激時，DPSCs 可遷移至牙髓暴露之處并取代退化的成牙本質(zhì)細(xì)胞。DPSCs除了具有自我更新的能力之外，還具有多種分化潛能，包括成牙本質(zhì)、成骨、成脂肪、成神經(jīng)及成血管內(nèi)皮的能力[1-2]。鈣粘蛋白是存在于細(xì)胞膜的一種跨膜蛋白，被認(rèn)為是牙和骨發(fā)育過程中細(xì)胞-細(xì)胞聯(lián)接及間充質(zhì)的緊密聚集的關(guān)鍵因子。有報道認(rèn)為，如果將間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）或者成骨細(xì)胞表面的 鈣粘蛋白用特定的抗體進(jìn)行封閉，MSC 及成骨細(xì)胞的成骨能力均會受到顯著的抑制[3]。此外，還有研究報道鈣粘蛋白基因變異會導(dǎo)致骨髓來源 MSC 成骨功能受損，造成骨發(fā)育遲緩，并趨向成脂分化[4]。該研究中生物材料的原料透明質(zhì)酸HA來源于自然資源提取物，與其他材料相比，HA 不僅在生物相容性和促進(jìn)細(xì)胞增殖方面具有優(yōu)勢，而且其可控的物理機(jī)械性能及促進(jìn)成骨分化特性使其在牙本質(zhì)-牙髓再生組織工程領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2017-12-20）