葛穩(wěn)博 梁文魁

摘 要：本文主要通過(guò)對(duì)小鼠跑輪運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)，使小鼠達(dá)到力竭，并且產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞，從而研究力竭性運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)性疲勞對(duì)小鼠血乳酸、血尿素和肝糖原的影響。實(shí)驗(yàn)以健康小鼠為研究對(duì)象，以一定負(fù)荷的跑輪來(lái)建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?shí)驗(yàn)組在常溫下每天跑輪30min，轉(zhuǎn)速為24r/min，對(duì)照組則不用參加運(yùn)動(dòng)，安靜即可，其余條件兩組相同。記錄兩組24h的體重、攝食量和飲水量。最后采用眼球取血、肝臟取材測(cè)量小鼠的血乳酸、血尿素、肝糖原等的生化指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：力竭性運(yùn)動(dòng) 血乳酸 血尿素 肝糖原 運(yùn)動(dòng)性疲勞

中圖分類(lèi)號(hào)：G808 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-2813（2018）04（a）-0016-02

1 前言

1.1 研究背景

隨著時(shí)代科技的不斷發(fā)展，運(yùn)動(dòng)員的競(jìng)技運(yùn)水平隨之增高，競(jìng)爭(zhēng)也就越加激烈，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷逐漸接近或超出運(yùn)動(dòng)員身體生理的極限，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性疲勞。因此，近年來(lái)對(duì)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的關(guān)注及研究也越來(lái)越多，對(duì)于提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)、體育和醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到了巨大推動(dòng)作用。

1.2 研究目的

本實(shí)驗(yàn)選用12周齡的昆明種雄性小鼠，通過(guò)力竭性運(yùn)動(dòng)使小鼠產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞，來(lái)探討研究力竭性運(yùn)動(dòng)前后，小鼠血乳酸、血尿素和肝糖原等生化指標(biāo)的具體變化。

1.3 研究意義

凡是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不可避免都會(huì)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞，血乳酸、血尿素和肝糖原是判斷運(yùn)動(dòng)性疲勞的生化指標(biāo)。近年來(lái)，對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞越來(lái)越重視。研究和掌握血乳酸、血尿素和肝糖原變化的一些規(guī)律和特征，對(duì)于提高身體素質(zhì)和運(yùn)動(dòng)成績(jī)具有十分重要的意義[1]。

2 實(shí)驗(yàn)與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

選用的是12周齡昆明種雄性健康小鼠20只，該鼠種是河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中心提供，體重大約是35～40g，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)級(jí)嚙齒類(lèi)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用的水為蒸餾水。小鼠分籠飼養(yǎng)，監(jiān)測(cè)飲水與攝食量，自然光照，室溫（20±2）℃、濕度相對(duì)恒定，安靜無(wú)噪音。定期更換小鼠的墊料，清洗鼠籠、吸水瓶，讓小鼠有一個(gè)干凈的環(huán)境，保證小鼠的健康生長(zhǎng)。

2.2 血標(biāo)本、肝臟和肌肉的采集

小鼠進(jìn)行力竭性運(yùn)動(dòng)后即刻，通過(guò)眼球取血，用離心管來(lái)獲得血標(biāo)本，并立即放入離心機(jī)中離心，離心機(jī)中樣品的放置應(yīng)對(duì)稱(chēng)，否則將會(huì)影響離心機(jī)的正常工作，進(jìn)而影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程；打開(kāi)小鼠的腹腔，切下一塊小鼠的肝臟。將獲得的動(dòng)物肝臟放入裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中漂洗，洗去組織中的血液，漂洗的過(guò)程在低溫條件下進(jìn)行，漂洗完成后，將肝臟放在吸水紙上吸凈肝臟上的生理鹽水。然后從小鼠的肝臟上切下一塊大小約3g的組織。在轉(zhuǎn)移剪碎的組織時(shí)要注意勻漿器保持垂直，盡量避免組織粘在勻漿器壁上。實(shí)驗(yàn)取材過(guò)程中對(duì)小鼠的處置，符合中華人民共和國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》[2]。

2.3 血乳酸、血尿素和肝糖原的測(cè)定

（1）血尿素的測(cè)定：尿素被脲酶分解生成氨，氨在堿性的條件下被氧化生成氯胺。氯胺與苯酚及次氯酸在亞硝基鐵氰化鈉的催化下生成藍(lán)色的靛酚，標(biāo)準(zhǔn)液也需經(jīng)過(guò)同樣的處理。這時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算出血液中尿素的含量[3]。

尿素試劑測(cè)定盒的成分如下：

R1：脲酶試劑：6000U/L，穩(wěn)定劑適量。

R2：緩沖劑：0.1mol/L磷酸鹽，pH8.0。

R3：顯色劑I：亞硝基鐵氰化鈉及苯酚10g/L。

R4：顯色劑Ⅱ：含次氯酸鈉5g/L；標(biāo)準(zhǔn)液：7.14mmol/L酶工作液的制備；取一份脲酶試劑與9份pH8.0緩沖液混勻。離心好的血液從離心機(jī)中取出，用移液管取出血清待用。取3只試管編號(hào)，按照下表進(jìn)行操作。

各試管中試劑的加入量分別為（mmol/L）：

空白管：血清無(wú)、標(biāo)準(zhǔn)液無(wú)、蒸餾水0.02、酶工作液2.00、顯色劑Ⅰ2.00、顯色劑Ⅱ2.00。

標(biāo)準(zhǔn)管：血清無(wú)、標(biāo)準(zhǔn)液0.02、蒸餾水無(wú)、酶工作液2.00、顯色劑Ⅰ2.00、顯色劑Ⅱ2.00。

樣品管：血清0.02、標(biāo)準(zhǔn)液無(wú)、蒸餾水無(wú)、酶工作液2.00、顯色劑Ⅰ2.00、顯色劑Ⅱ2.00。

各試管充分混合后，放入37℃的水浴箱中水浴15分鐘，取出冷卻至室溫。在550nm波長(zhǎng)下，以空白管調(diào)零，然后測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管的吸光度。

公式為：血尿素（mmol/L）=樣品管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×7.14。

注意事項(xiàng)如下。

①由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程要用到強(qiáng)酸，所以實(shí)驗(yàn)后的廢液不能直接倒入水池，應(yīng)該倒入廢液缸（燒杯）中；

②水浴時(shí)間影響顯色，應(yīng)該嚴(yán)格控制時(shí)間。

③移液管用完之后一定要清洗，避免交叉感染。

（2）血乳酸的測(cè)定。

乳酸氧化酶將乳酸氧化生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫被氧化產(chǎn)生電子，乳酸濃度與電子流的強(qiáng)度有著密切關(guān)系，電子流強(qiáng)度與乳酸濃度有一個(gè)成正比的關(guān)系。乳酸分析儀監(jiān)測(cè)電子流的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)乳酸溶液進(jìn)行比較，從而測(cè)定血乳酸的濃度。

（3）肝糖原的測(cè)定。

在濃硫酸的作用下，糖原可以發(fā)生變化。其產(chǎn)物與顯色劑作用形成藍(lán)色化合物。與同法處理的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液比色定量[4]。因在濃堿溶液中糖原很穩(wěn)定，故在顯色之前為了保留糖原先將組織放入濃堿中加熱以破壞其他成分[5]。

取干凈試管3支，按如下操作。

試劑（mL）溶液分別為：蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.05mg/mL）、肝臟制備液、0.2%蒽酮溶液。

空白管容量：1.0、無(wú)、無(wú)、2.5標(biāo)準(zhǔn)管容量：無(wú)、1.0、無(wú)、2.5樣品管容量：無(wú)、無(wú)、1.0。

混合均勻后，沸水浴10min，冷卻至室溫。在分光光度計(jì)620nm的波長(zhǎng)處用空白管溶液調(diào)零，然后測(cè)定其余各管溶液的吸光度。

3 研究結(jié)果

運(yùn)動(dòng)組與安靜組小鼠血乳酸、血尿素和肝糖原含量的測(cè)量值分別為（mmoL/L）：

安靜組：2.67±0.52、3.67±0.45、3.02±3.24；運(yùn)動(dòng)組：2.20±0.41、5.65±0.79、0.77±0.19糖原在細(xì)胞能量需求增加時(shí)被分解為葡萄糖供細(xì)胞合成ATP利用。雖然肝糖原的儲(chǔ)備量并不大，但在神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下，能夠保證血糖含量的相對(duì)穩(wěn)定[6]。

蛋白質(zhì)主要是由氨基酸組成。體內(nèi)可利用的氨基酸有兩個(gè)來(lái)源：一種是來(lái)源于食物蛋白質(zhì)；另一種是來(lái)源于組織、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解的氨基酸。體內(nèi)的這兩種氨基酸主要用于合成細(xì)胞成分以實(shí)現(xiàn)自我更新，也用于合成激素、酶等生物活性物質(zhì)[7]。蛋白質(zhì)也可氧化分解為機(jī)體提供能量，成人的能量供應(yīng)每天大約有18%由蛋白質(zhì)提供。

肝糖原是存在于人體肝臟中的糖原。糖原在細(xì)胞能量需求增加時(shí)被分解為葡萄糖供細(xì)胞合成ATP利用。肌糖原是重要的能源物質(zhì)，儲(chǔ)存在骨骼肌中。肌糖原也可以在機(jī)體急性運(yùn)動(dòng)，尤其在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中提供能量。

4 分析與討論

4.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)血乳酸的影響

隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的大小，運(yùn)動(dòng)后的血乳酸濃度也會(huì)發(fā)生變化。糖原或糖無(wú)氧酵解的產(chǎn)物是乳酸，它主要在骨骼肌中產(chǎn)生，機(jī)體的主要供能的判斷方式是通過(guò)測(cè)定運(yùn)動(dòng)后血乳酸濃度的大小[8]。在力竭性運(yùn)動(dòng)過(guò)程后會(huì)導(dǎo)致乳酸的大量累積以及機(jī)體糖原的迅速消耗，它的主要運(yùn)動(dòng)方式是無(wú)氧代謝為主。因此，在小鼠力竭性運(yùn)動(dòng)后即刻血乳酸濃度會(huì)升高。

4.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)血尿素的影響

血尿素是蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物。在正常的情況下，蛋白質(zhì)的分解代謝率較低，血尿素的含量維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；在力竭性運(yùn)動(dòng)的情況下，機(jī)體能量代謝平衡遭到破壞，糖原消耗過(guò)多、供應(yīng)不足，蛋白質(zhì)、氨基酸的分解代謝率有顯著升高，機(jī)體結(jié)構(gòu)的蛋白以及功能蛋白分解加劇，腎臟功能下降致使尿素的清除能力下降，導(dǎo)致血尿素含量升高[8]。

4.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)肝糖原的影響

機(jī)體可以利用的糖儲(chǔ)備有肌糖原和肝糖原。肝臟是調(diào)節(jié)血糖含量的重要器官，因?yàn)楦闻K可以?xún)?chǔ)存糖原。當(dāng)血糖濃度過(guò)高時(shí)，則葡萄糖合成糖原儲(chǔ)存于肝臟中；當(dāng)血糖濃度過(guò)低時(shí)，則肝臟中的糖原分解形成葡萄糖進(jìn)入血液，提高血糖的含量。國(guó)內(nèi)外的大量資料顯示，力竭性運(yùn)動(dòng)可對(duì)小鼠肝臟的超微結(jié)構(gòu)造成損害，肝糖原、肌糖原的減少[9]，并且隨著力竭性運(yùn)動(dòng)次數(shù)的增多而加重其程度。

本實(shí)驗(yàn)中個(gè)別小鼠血乳酸、血尿素的含量出現(xiàn)安靜組大于運(yùn)動(dòng)組以及安靜組小鼠的肝糖原值小于運(yùn)動(dòng)組小鼠的情況，經(jīng)過(guò)小組討論后認(rèn)為，這種情況與個(gè)體差異以及在取材過(guò)程中小鼠的掙扎、焦慮等因素有關(guān)。在今后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意，對(duì)同一小鼠運(yùn)動(dòng)前后的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行比較，以消除小鼠間的個(gè)體差異的影響。

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