蘭慧 邵建忠

摘 要：外源性蛋白酶在過去15～20年中已經(jīng)成為商用混合酶制劑的一部分，但僅在過去5～10年內(nèi)才作為單一組分的商用酶——蛋白酶——上市。作為混合酶制劑的組成成分（通常還含有各種碳水化合物酶或糖酶和/或植酸酶），很難將各個(gè)組分成分的貢獻(xiàn)分開，同時(shí)每一種成分的功效具有隱性的價(jià)值而不是明確的價(jià)值。然而，單一組分酶制劑的攻效可以在不同的生產(chǎn)和營養(yǎng)條件下輕松地測(cè)定，并且它們與其他酶的互補(bǔ)性也很容易描述清楚。非反芻動(dòng)物飼料添加外源性蛋白酶的動(dòng)機(jī)是在保持動(dòng)物生產(chǎn)性能的前提下顯著降低飼料成本。這一目標(biāo)通常是用給最低成本配方中的酶提供的營養(yǎng)基質(zhì)替換日糧中昂貴的蛋白質(zhì)/氨基酸源來實(shí)現(xiàn)的。最近的重點(diǎn)已經(jīng)從這種經(jīng)典的方法轉(zhuǎn)向?yàn)榈鞍酌笐?yīng)用中的所謂“額外蛋白（extra-proteinaceous）”效應(yīng)，包括環(huán)境效益、墊料管理、腸道恢復(fù)力、均勻性和微生物穩(wěn)定性。雖然這些“次要”效應(yīng)可能并不是動(dòng)物生產(chǎn)使用蛋白酶的主要?jiǎng)訖C(jī)，但它們?cè)絹碓矫黠@，且需要進(jìn)行解釋。此外，如果能夠了解這些效應(yīng)，那么它們可以主動(dòng)轉(zhuǎn)化成生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，如較低的飼料轉(zhuǎn)化率和較高的日增重。

本綜述的目的是簡(jiǎn)要總結(jié)當(dāng)前非反芻動(dòng)物生產(chǎn)中單一組分外源性蛋白酶應(yīng)用技術(shù)的現(xiàn)狀，并提出可以解釋“額外蛋白”效應(yīng)的機(jī)制。最后將討論可提高外源性蛋白酶對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能產(chǎn)生有益作用的日糧/動(dòng)物因素。

關(guān)鍵詞：蛋白酶；蛋白質(zhì)；家禽；豬；氨基酸；營養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S816 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2018）01-0065-03

飼用酶是一個(gè)激動(dòng)人心的成功案例。從β-葡聚糖酶在歐洲斯堪的納維亞的出現(xiàn)，到阿拉伯木聚糖酶在西歐、加拿大和澳大利亞的發(fā)展，再到植酸酶、淀粉酶和蛋白酶在全球范圍內(nèi)的出現(xiàn)?，F(xiàn)今，全球飼用酶市場(chǎng)接近10億美元，并且還在迅速增長中。蛋白酶，作為獨(dú)立的酶，是飼用酶市場(chǎng)的一個(gè)后起之秀，僅在過去的5～10年才成為特定市場(chǎng)和研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。然而，近20年來，蛋白酶的活性在一系列混合產(chǎn)物中被公布出來，但其有益的效應(yīng)是隱式的，而不是明確的。研究飼用酶的“生命周期”在一定程度上是可以預(yù)測(cè)的，最初的重點(diǎn)是目標(biāo)營養(yǎng)物質(zhì)，如碳水化合物酶和能量、植酸酶和磷、脂肪酶和脂質(zhì)、蛋白酶和蛋白質(zhì)，但隨后快速拓展到其他營養(yǎng)物質(zhì)。就植酸酶的研究而言，早期的重點(diǎn)是磷，且在一定程度上是針對(duì)鈣，之后是針對(duì)氨基酸和能量。今天，植酸酶和植酸鹽在對(duì)動(dòng)物腸道健康、蛋白質(zhì)沉積、肌醇、離子平衡、植酸源和特征變化等的影響方面已經(jīng)出現(xiàn)了許多細(xì)微差別。鑒于至少需要有20～30年的飼用酶商業(yè)化應(yīng)用的可持續(xù)研究（由植酸酶帶頭）所積累的基礎(chǔ)知識(shí)，蛋白酶的技術(shù)知識(shí)小車正以更加快的步伐在移動(dòng)。最初對(duì)外源性蛋白酶在動(dòng)物生產(chǎn)中作用的研究是針對(duì)其對(duì)動(dòng)物（主要是仔豬和肉仔雞）生產(chǎn)性能的作用，隨后是對(duì)氮消化率的影響（下文將更詳細(xì)地描述）。研究人員探索了氨基酸和其他非蛋白質(zhì)營養(yǎng)物如脂肪的回腸消化率以及蛋白酶與各種日糧成分之間的相互作用。在現(xiàn)代的參考條件下，蛋白酶研究正在積極查找證據(jù)，以證明蛋白酶通過改變動(dòng)物腸道黏膜的完整性、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、環(huán)境可持續(xù)性和腸道伸張強(qiáng)度使腸道健康出現(xiàn)有益的改變。本文的目的是介紹外源性蛋白酶在非反芻動(dòng)物生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用文獻(xiàn)，并提出蛋白酶的作用遠(yuǎn)超出提高氨基酸和蛋白質(zhì)消化率的作用機(jī)制。最后，提出會(huì)影響蛋白酶作用大小和一致性的各種因素，并討論它們的影響。

1 外源性蛋白酶對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響

Lewis等（1955）和Baker等（1956）首開將外源性蛋白酶用于動(dòng)物飼料之大門。Lewis等（1955）公布了一個(gè)系列的三項(xiàng)仔豬研究結(jié)果（其中一項(xiàng)研究按三個(gè)獨(dú)立部分進(jìn)行并報(bào)道，結(jié)果總共進(jìn)行了六次試驗(yàn)），結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加1%的胃蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶可顯著降低飼料轉(zhuǎn)化率（Feed Conversion Rate，F(xiàn)CR）。此外，胃蛋白酶和胰酶對(duì)FCR的有益作用似乎是獨(dú)立的，但當(dāng)將這三項(xiàng)研究的結(jié)果結(jié)合起來時(shí)，胃蛋白酶和胰酶的聯(lián)合作用使日增重增加約27%、FCR降低約43點(diǎn)（由2.49降到2.06）。當(dāng)各種酶單獨(dú)添加時(shí)，胃蛋白酶（2.88對(duì)2.20）和木瓜蛋白酶（2.82對(duì)2.36）都能夠降低FCR，表明蛋白水解活性是一個(gè)重要的貢獻(xiàn)因子而不是胰蛋白酶混合物中的其他酶。Lewis等（1955）和Baker等（1956）的研究重點(diǎn)是仔豬的斷奶和豆粕代替脫脂奶粉的潛力。

繼Lewis、Baker和同事在20世紀(jì)50年代利用粗蛋白提取物進(jìn)行開創(chuàng)性研究之后，現(xiàn)今的研究工作主要是探索從微生物發(fā)酵而不是直接從胰腺提取物中獲得蛋白酶的酶解作用。Castanon和Marquardt（1989）可能是現(xiàn)代第一個(gè)發(fā)表有關(guān)專門生產(chǎn)的單一組分外源性蛋白酶在動(dòng)物生產(chǎn)中作用的研究人員，他們?cè)u(píng)估了各種酶（包括來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶）在提高蠶豆在來航雞日糧中營養(yǎng)價(jià)值上的潛力。在含>900 g/kg大豆的飼料中添加0.25%（而不是0.50%）的蛋白酶，可以顯著提高來航雞第14天至第21天的增重（由61.0 g增到67.9 g），并能顯著降低其第7天至第21天的FCR（由2.63降到2.49）。但是，當(dāng)在加入酶之前對(duì)蠶豆進(jìn)行高溫高壓處理時(shí)，沒有觀察到類似的反應(yīng)，表明酶的某些有益作用與熱不穩(wěn)定的抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解有關(guān)。

繼Castanon和Marquardt（1989）的早期研究之后，Huo等（1993）研究指出，真菌性和細(xì)菌性蛋白酶在體外可以降低生豆粕中胰蛋白酶抑制劑和凝集素的活性。隨后，Guenter等（1995）研究表明，蛋白酶使飼喂以半精制菜籽油為基礎(chǔ)日糧的肉雞日增重提高3%和FCR降低2%。 Guenter等（1995）和Hessing等（1996）提供的數(shù)據(jù)評(píng)估了酸性或堿性蛋白酶在降低豆粕中凝集素、胰蛋白酶抑制劑和抗原蛋白的抗?fàn)I養(yǎng)作用方面的潛力。得出的結(jié)論是，酸性而不是堿性蛋白酶在體外具有降解大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白以及Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制劑的能力，但是這兩種蛋白酶對(duì)凝集素都沒有作用。同時(shí)，這些作用體現(xiàn)在生產(chǎn)性能的改善上：第7～27天的采食量和增重顯著增加，氮的回腸表觀消化率系數(shù)由0.76提高0.85。該作者據(jù)此認(rèn)為，在介紹這些純粹是針對(duì)大豆中各種蛋白質(zhì)的抗?fàn)I養(yǎng)作用的變化時(shí)必須極其小心。最近，Rooke等（1998）證明酸性而不是堿性蛋白酶可以提高剛斷奶仔豬的日增重，并可在體外降低大豆蛋白的抗原性。為了進(jìn)一步了解20世紀(jì)90年代已發(fā)表的有關(guān)蛋白酶在降低大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子作用的論文，Thorpe和Beal（2001）很好地進(jìn)行了總結(jié)。

20世紀(jì)90年代后期到21世紀(jì)初，研究人員對(duì)用蛋白酶特異降解蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的興趣似乎出現(xiàn)下降，重點(diǎn)轉(zhuǎn)向更經(jīng)典的對(duì)營養(yǎng)和生產(chǎn)指標(biāo)的影響上。Marsman等（1997）使用肉雞來探討商用中性蛋白酶對(duì)提高半合成大豆型日糧營養(yǎng)價(jià)值的能力，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶不會(huì)改善雛雞的日增重或FCR，不過氮的表觀回腸消化率系數(shù)顯著提高（由0.837增至0.852），NSP的消失率增加（由0.145增至0.206）。O'doherty和Forde（1999）觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)日糧添加外源性中性蛋白酶時(shí)，生長和肥育豬喂給含有400 g/kg大豆的日糧，它們的日增重由0.862 kg/d增至0.887 kg/d，F(xiàn)CR由2.62降至2.50。Ghazi等（2002）利用幼齡和成年肉雞評(píng)估了各種蛋白酶在提高豆粕營養(yǎng)價(jià)值方面的能力。試驗(yàn)采用了兩種蛋白酶，一種是來自芽孢桿菌屬的堿性蛋白酶，另一種是來自曲霉屬的酸性蛋白酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然這兩種蛋白酶在第27天能夠減少雞血清中的抗大豆抗體水平，但僅分離自曲霉屬的蛋白酶可提高肉雞的日增重（由36 g/d增至41 g/d）和氮的回腸表觀消化率（由0.78增至0.83）。有趣的是，當(dāng)使用精確的飼喂法時(shí)，來自曲霉的酸性蛋白酶在一個(gè)試驗(yàn)中將真代謝能從11.4 MJ/kg提高到13.1 MJ/kg，并且在一秒鐘內(nèi)從11.0 MJ/kg增加到12.6 MJ/kg，而來自芽孢桿菌的蛋白酶沒有這種效果。

各種外源性蛋白酶在功效上的差異在多種情況下得到證實(shí)，但鑒于所用蛋白酶的詳細(xì)情況有限而不容易解釋。例如，Simbaya等（1996）觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肉雞飼喂菜籽粕半合成日糧時(shí)，5種不同的蛋白酶在提高動(dòng)物生產(chǎn)性能方面的效力差異顯著。遺憾的是，此研究所用的5種蛋白酶僅用G、D、M、N和O表示，沒有關(guān)于它們來源的微生物、蛋白質(zhì)特性等方面進(jìn)一步的信息。然而，G蛋白酶能將雛雞的FCR從1.52降低到1.42，而D蛋白酶對(duì)FCR沒有效果（1.52對(duì)1.53）。有趣的是，第2個(gè)試驗(yàn)證實(shí)了G蛋白酶對(duì)含220 g/kg而非170 g/kg粗蛋白的日糧有作用，這表明蛋白酶對(duì)雛雞生產(chǎn)性能有不同作用的部分原因可能與對(duì)照日糧中粗蛋白濃度有關(guān)。最后，Simbaya等（1996）發(fā)現(xiàn)，G蛋白酶（在幾個(gè)試驗(yàn)中均產(chǎn)生最有應(yīng)用前景效應(yīng)的蛋白酶）成功降低了采食小麥/豆粕基礎(chǔ)日糧的雛雞的FCR（由1.41降至1.35），但對(duì)采食小麥/油菜籽基礎(chǔ)日糧的雛雞沒有效果（1.42對(duì)1.43）。

Odetallah等（2003）指出，當(dāng)玉米/大豆型日糧添加來自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的角蛋白酶時(shí)，肉雞開食料的性能有所改善，但是該效應(yīng)在所報(bào)道的三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中改善程度不一致。此外，添加角蛋白酶的有益作用似乎偏向于雛雞，其有益效果并沒有持續(xù)到出欄，這一觀察結(jié)果隨后得到Odetallah等（2005）的證實(shí)。Angel等（2010）評(píng)估了分離自Nocardiopsis prasina的單一組分蛋白酶在幼齡肉仔雞的玉米/大豆日糧中的劑量敏感性變化（正對(duì)照為22.5%，負(fù)對(duì)照為20.5%，氨基酸減少量與這些粗蛋白的變化成正比）。從第7天至第22天，正對(duì)照組肉雞增重711 g，負(fù)對(duì)照組肉雞為661 g。按劑量依賴性方法添加單一組分蛋白酶，可以將體重從661 g增加至708 g，增重和FCR應(yīng)答最佳時(shí)的添加劑量約為200 g/t飼料。Freitas等（2011）在一項(xiàng)利用相同外源性蛋白酶的試驗(yàn)中觀察到了肉雞生產(chǎn)性能上的類似改善。這些作者在第1天至第40天給肉雞飼喂?fàn)I養(yǎng)含量充足的玉米/大豆型日糧或粗蛋白和氨基酸水平稍微減少的相同日糧。單一組分蛋白酶對(duì)肉雞的增重沒有影響，但是可以將采食蛋白質(zhì)和易消化氨基酸稍微減少的日糧的肉雞FCR從1.75降低到1.72，具體下降程度取決于蛋白酶的添加劑量（觀察到一個(gè)二次方程式的應(yīng)答效應(yīng)）。

Wang等（2008）探討了日糧的蛋白質(zhì)源（豆粕或棉籽粕）與外源性蛋白酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的相互作用?？傮w而言，蛋白酶的作用是正向的。不過，就增重的提高幅度而言，開食階段的提高程度要高于育肥階段的。Barekatain等（2013）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向以玉米/豆粕為基礎(chǔ)日糧并含有不同濃度梯度的高粱干酒糟及其可溶物的飼料中添加外源性蛋白酶后，肉雞的增重提高。此外，在日糧含有較高濃度的高粱干酒糟及其可溶物時(shí)效果更顯著，特別是FCR的改善程度更大。O'Shea等（2014）利用生長—育肥豬評(píng)估了木聚糖酶和蛋白酶在以菜籽粕為基礎(chǔ)日糧并添加了小麥干酒糟粕及其可溶物的飼料中的相互作用，發(fā)現(xiàn)蛋白酶對(duì)豬的生產(chǎn)性能影響有限，但能夠顯著提高能量的回腸表觀消化率。最近，Zuo等（2015）發(fā)現(xiàn)，向斷奶仔豬的日糧添加蛋白酶，可使平均日增重從258 g增加到293 g，使FCR從1.21降低到1.17。

（未完，待續(xù)見2018年第5期）

原題名：Toward optimal value creation through the application of exogenous mono-component protease in the diets of non-ruminants（英文）

原作者：Aaron J. Cowieson、Franz F. Roos（DSM公司）