蘇華香 王張英 王志新

[摘要] 比較提取異葉茴芹總黃酮的三種方法：超聲輔助提取法、微波輔助提取法、乙醇浸泡提取法的總黃酮提取率，針對超聲輔助提取異葉茴芹總黃酮方法，進一步探究其最佳提取工藝。實驗結(jié)果表明，異葉茴芹總黃酮提取率為：超聲波輔助提取>微波輔助提取>乙醇浸泡提取。通過正交試驗對超聲波輔助提取進行優(yōu)化，得到超聲波輔助提取法最佳提取條件為：料液比1：30，乙醇體積分數(shù)60%，超聲波處理40min。在此提取條件下，異葉茴芹總黃酮的提取率達到16.98%。

[關(guān)鍵詞] 異葉茴芹；總黃酮；提??；正交試驗

[中圖分類號]S567.239 [文獻標識碼]A

異葉茴芹（Pimpinella diversifolia DC.）又名山當歸、苦爹菜、蛇倒退，是傘形科茴芹屬多年生草本植物。異葉茴芹是常用民間草藥，可用于活血散淤、解毒消腫，在民間是藥食兼用的野菜。異葉茴芹含有黃酮類化合物等多種有效成分。研究表明，黃酮類化合物藥用價值豐富，作用廣泛且臨床研究表明無明顯毒副反應，可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，具有抗氧化、抗炎、抗菌及提高免疫功能的作用。近年來，對不同植物中總黃酮的提取研究多有報道，但少見對異葉茴芹總黃酮提取方法及提取工藝研究。

本研究通過比較3種提取方法提取異葉茴芹總黃酮的提取率，選出最佳提取方法，進一步設(shè)計單因素正交試驗，優(yōu)化出提取異葉茴芹總黃酮的最佳提取條件，為今后異葉茴芹總黃酮資源的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗儀器

FA1204B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）；SB-5200D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；EG823LC9-NRH美的微波爐（廣東美的微波電器制造有限公司）；KC-100高速粉碎機（北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司）；722SP14116可見光分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；DHG-9040A電熱恒溫鼓風干箱（寧波江南儀器廠）；TDL-40B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 實驗材料

實驗材料購于福建省寧德市，經(jīng)衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院王志新講師鑒定，確為異葉茴芹植株。異葉茴芹干燥粉碎后過60目篩，以無水乙醚為有機溶劑，60℃水浴，冷凝回流脫葉綠素，存放在干燥避光處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

蘆丁標準品（國藥集團化學試劑有限公司，20130528）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醚、均為分析純、體積分數(shù)為95%的乙醇、蒸餾水。

2 方法

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

精確稱取蘆丁標準品13mg，用60%乙醇溶液溶解（水浴加熱），冷卻至室溫，定容至100 mL的容量瓶中，搖勻，則配制得到濃度為130μg·mL-1的蘆丁對照品標準溶液。精密量取蘆丁對照品標準溶液0mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL，分別置于6支10mL容量瓶中，依次加入體積分數(shù)為60%乙醇溶液5.0mL，4.0mL，3.0mL，2.0mL，1.0mL，0 mL，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置5min后，分別加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置5min后，各加入4%氫氧化鈉溶液4mL，搖勻，最后用60%乙醇溶液定容。靜置10min后于510nm處測量吸光度A值，繪制標準曲線。得直線回歸方程為：Y=0.0112X-0.004，X為質(zhì)量濃度（μg·mL-1），Y為吸光度，R?=0.9998。

2.2 樣品溶液的制備

精密稱取異葉茴芹粉末0.5g，加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，用保鮮膜密封，分別置于超聲波清洗器，微波爐，常溫浸泡提取，離心，收集上清液，放置待測。

2.3 總黃酮含量測定

精密吸取上述各提取溶液0.05mL，置于10mL容量瓶中，依次加入60%乙醇溶液5.0mL、5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置5min后，加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置5min后，加入4%氫氧化鈉溶液4mL，搖勻，最后用60%乙醇溶液定容。靜置10min后于510nm處測量吸光度，每種提取液平行測定3次，根據(jù)蘆丁對照品標準溶液濃度與吸光度標準曲線回歸方程計算各提取液中總黃酮濃度（μg·mL-1），取平均值。

總黃酮的提取率=×10-6×100%

C為查標準曲線得到的總黃酮的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；V為乙醇體積（mL）；M為稱取異葉茴芹的質(zhì)量（g）。

3 結(jié)果與分析

3.1 三種提取方法比較

精密稱取異葉茴芹粉末0.5g，加入15mL60%乙醇溶液至50mL錐形瓶，用保鮮膜密封，分別置于超聲波清洗器中室溫超聲提取10min，微波爐中加熱3min，常溫浸泡提取4h，4000r·min-1離心10min，收集上清液，按照2.3項方法計算總黃酮提取率。結(jié)果表明超聲波輔助提取、微波輔助提取、乙醇浸泡提取所得總黃酮提取率依次降低，分別為15.53%，15.43%和12.70%。實驗可知，超聲波輔助提取法效果最佳，因此，選取超聲波輔助提取異葉茴芹總黃酮。

3.2 超聲波輔助提取單因素試驗

3.2.1 料液比對異葉茴芹總黃酮提取率的影響 精密稱取0.5g異葉茴芹粉末于50mL錐形瓶中，分別加入體積分數(shù)60%乙醇溶液5mL，10mL，15mL，20mL，25mL，用保鮮膜密封，置超聲波清洗器中室溫超聲提取10min，4000r·min-1離心10min，收集上清液，用分光光度法測定吸光度，按照2.3項方法計算總黃酮提取率，結(jié)果見表1。在料液比從1：10到1：20范圍內(nèi)，總黃酮提取率升高，異葉茴芹總黃酮充分溶于乙醇中。在料液比為1：20到1：50處，提取率逐漸減低?？赡苁且驗殡S著料液比增大，總黃酮提取液濃度降低，異葉茴芹中其他成分溶于乙醇，使總黃酮濃度相對降低?？梢娏弦罕?：20是異葉茴芹總黃酮提取的最佳料液比。

3.2.2 乙醇體積分數(shù)對異葉茴芹總黃酮提取率的影響 精密稱取0.5g異葉茴芹粉末于50mL錐形瓶中，分別體積分數(shù)為30%，40%，50%，60%，70%的乙醇溶液10mL。用保鮮膜密封，置超聲波清洗器中室溫超聲提取10min，4000r·min-1離心10min，收集上清液，用分光光度法測定吸光度，按照2.3項方法計算總黃酮提取率，結(jié)果見表2。乙醇溶液體積分數(shù)低于60%時，總黃酮提取率隨著乙醇體積分數(shù)升高而提高，乙醇溶液體積分數(shù)高于60%時，總黃酮提取率降低，在60%乙醇處有最佳提取率?？傸S酮的溶解與有機溶劑性質(zhì)相似性有關(guān)，相似性越大，溶解率越高，所得總黃酮提速率越大。乙醇體積分數(shù)高于60%時，一些醇溶性物質(zhì)競爭性與乙醇結(jié)合，降低了提取液中總黃酮的含量，提取率減小。

3.2.3 提取時間對異葉茴芹總黃酮提取率的影響 精密稱取0.5g異葉茴芹粉末于50mL錐形瓶中，加入體積分數(shù)60%乙醇溶液10 mL，用保鮮膜密封，分別置超聲波清洗器中處理10min，20min，30min，40min，50min，4000r·min-1離心10min，收集上清液，用分光光度法測定吸光度，按照2.3項方法計算總黃酮提取率，結(jié)果見表3。超聲波輔助提取異葉茴芹總黃酮40min是最佳的提取時間。超聲波處理時間在10～40min以內(nèi)，處理時間越長，乙醇和異葉茴芹粉末接觸更加充分，提取的黃酮量越大，提取率也越高。繼續(xù)延長浸泡時間至50min時，提取率反而比40 min時的提取率小。由于長時間震蕩，使一些不穩(wěn)定的黃酮類物質(zhì)開始分解，提取液中的黃酮類化合物含量降低，提取率減小。

3.3 超聲波輔助提取正交試驗

根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，按照L9（33）設(shè)計正交試驗，見表4，正交試驗結(jié)果及方差分析見表5，表6。

由表5可知，極差RA>RC>RB，即超聲波輔助提取影響總黃酮提取率的大小為：料液比>提取時間>乙醇體積分數(shù)。直觀分析超聲波輔助提取最佳提取工藝組合為A3B2C2。由表6可知，料液比、乙醇體積分數(shù)及提取時間都對總黃酮提取率具有極顯著影響，其中料液比對總黃酮提取率影響最大，三個實驗因素之間相互作用顯著。因最佳提取工藝組合不在正交表，設(shè)計試驗提取條件為料液比1：30，乙醇體積分數(shù)60%，超聲波處理40min，提取率為16.98%，驗證A3B2C2為最佳提取工藝。

4 討論

黃酮類化合物具有多種生物活性，現(xiàn)已有諸多利用不同植物提取總黃酮的研究，是國內(nèi)外天然藥物研發(fā)的熱點。本實驗以乙醇為提取劑從異葉茴芹全草提取總黃酮，對超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、乙醇浸泡提取三種方法提取效果進行比較，并進一步對超聲波輔助提取工藝進行探究。實驗結(jié)果表明總黃酮提取率為：超聲波輔助提取>微波輔助提取>乙醇浸泡提取。異葉茴芹總黃酮含量較高，三種方法提取率均高于12%，與乙醇浸泡提取相比，超聲波輔助提取法和微波輔助提取法能縮短提取時間，所得異葉茴芹中總黃酮提取率高。微波輔助提取法處理時間比超聲波輔助提取法更短，但難以操作，如：微波處理時因溫度高，提取液易揮發(fā)或噴瓶。超聲波輔助提取法易于操作，且提取率高，最適合用于提取異葉茴芹總黃酮。采用正交試驗優(yōu)選出超聲波輔助提取法最佳提取條件為料液比為1：30，乙醇體積分數(shù)60%，超聲波處理40min，提取率達16.98%。本研究為今后提取異葉茴芹總黃酮提供了一定的數(shù)據(jù)參考。

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