溫肖會(huì)　魏文康　丘婷　翟少倫　周秀蓉　呂殿紅

摘要[目的]了解廣東省不同地區(qū)禽源大腸桿菌的耐藥情況。[方法]采用紙片擴(kuò)散法對(duì)不同養(yǎng)禽場(chǎng)分離的229株大腸桿菌進(jìn)行28種抗菌藥物的耐藥性試驗(yàn)。[結(jié)果]229株大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、阿莫西林和氨芐西林的耐藥率較高，分別為89.1%、80.0%、76.9%和75.5%，其次是多西環(huán)素和鏈霉素（74.7%和68.6%），但阿米卡星耐藥率最低（8.3%）。229株大腸桿菌存在多重耐藥性，其中6株大腸桿菌可耐26種藥物。[結(jié)論]廣東省禽源大腸桿菌分離株耐藥情況嚴(yán)重，存在多重耐藥現(xiàn)象。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)合理使用藥物，加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)，研究結(jié)果為養(yǎng)殖場(chǎng)選用合適藥物、控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散提供了有效的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 禽；大腸桿菌；藥敏試驗(yàn)；耐藥性

中圖分類號(hào) S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）11-0074-04

大腸桿菌是大腸埃希氏菌（Escherichiacoli，Ecoli）的簡(jiǎn)稱，隸屬腸桿菌科埃希氏菌屬。大腸桿菌在自然界中廣泛存在，是人和動(dòng)物的腸道共生菌和條件致病菌。不同動(dòng)物感染后具有不同的臨床癥狀和病理變化，且常與其他病原并發(fā)或混合感染，發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌血清型復(fù)雜，目前尚無理想的疫苗來預(yù)防，主要依靠抗生素進(jìn)行治療?？股氐膹V泛使用造成動(dòng)物源大腸桿菌的耐藥菌株不斷增加，耐藥機(jī)制日趨復(fù)雜，多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。動(dòng)物源耐藥菌株和耐藥基因可通過食物鏈傳給人類，危害人類健康，將來可能造成人類無藥可用的嚴(yán)峻局面。筆者通過對(duì)廣東省10個(gè)市（縣）養(yǎng)殖場(chǎng)不同動(dòng)物來源樣品分離到的大腸桿菌進(jìn)行了28種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)，以期為養(yǎng)殖業(yè)合理有效地使用抗菌藥提供參考，并為大腸桿菌的防制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。

（1）受試菌株。2012年采集來自廣州、花都、增城、東莞、四會(huì)、中山、臺(tái)山、翁源、博羅、江門10個(gè)市（縣）養(yǎng)殖場(chǎng)不同動(dòng)物來源的樣品，動(dòng)物品種包括雞、鴨、鵝和鴿子等。樣品來源于病、死動(dòng)物的肝臟、心血、卵黃、腸道、糞便和健康動(dòng)物的泄殖腔棉拭子以及發(fā)病、健康家禽場(chǎng)的墊紙、水源、土壤等，經(jīng)分離鑒定獲得的229株大腸桿菌。其中56株來自鴨場(chǎng)，17株來自鵝場(chǎng)，134株來自雞場(chǎng)，22株來自鴿場(chǎng)；分離自心血、肝、肺、腎等內(nèi)臟70株，肛門拭子、墊紙、腸道及糞便139株，環(huán)境樣品5株，鴨場(chǎng)水樣15株；來源于健康動(dòng)物及其養(yǎng)殖場(chǎng)119株，來源于病死動(dòng)物及其養(yǎng)殖場(chǎng)110株。

（2）質(zhì)控菌株。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所動(dòng)物疫病診斷中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2藥敏紙片。共選用7類28種抗菌藥物的藥敏紙片，分別為β-內(nèi)酰胺類[氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢哌酮、氨曲南（單酰胺環(huán)類）]、氨基糖苷類（阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、新霉素和奈替米星）、氯霉素類（氯霉素和氟苯尼考）、四環(huán)素類（四環(huán)素和多西環(huán)素）、磺胺類[復(fù)方磺胺甲噁唑（磺胺甲嗯唑/甲氧芐啶）]、硝基呋喃類（呋喃唑酮）、氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星），均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基等均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4主要儀器與設(shè)備。立式滅菌器，購(gòu)自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱和電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；精密電子天平購(gòu)自梅特勒一托利多儀器有限公司；游標(biāo)卡尺購(gòu)自上海臺(tái)海工量具有限公司。

1.2方法采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）推薦的K-B（Kirby-Bauer）紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，同時(shí)以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922作為質(zhì)控菌株。將229株大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板上劃線、培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于3mLMH肉湯內(nèi)，37℃下培養(yǎng)16～18h，用MH肉湯將菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛取Ｓ脺缇藓灲刚{(diào)配的菌液，在試管壁上旋轉(zhuǎn)，擠去多余液體，均勻涂抹于MH瓊脂平板上，每次旋轉(zhuǎn)60°，最后用棉簽沿平板周邊瓊脂涂抹2圈，使整個(gè)平板涂布均勻。涂好后放置3～5min，待培養(yǎng)基表面水分吸干后，用無菌眼科鑷子將藥敏紙片貼在平板上，紙片間距不小于24mm，紙片中心距平皿邊緣不小于15mm。37℃下培養(yǎng)16～18h后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2012M100-S22標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)抑菌圈直徑判斷受試大腸桿菌對(duì)28種抗菌藥物的耐藥性，個(gè)別CLSI沒有列出但我國(guó)獸醫(yī)中有應(yīng)用的藥物參照杭州天和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)作為判定依據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1229株大腸桿菌分離株的總體耐藥情況 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，廣東省家禽養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌對(duì)28種抗菌藥物的耐荮情況十分嚴(yán)重，其中對(duì)四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、阿莫西林和氨芐西林的耐藥率較高，分別為89.1%、80.0%、76.9%、和75.5%；其次為多西環(huán)素和鏈霉素，耐藥率分別為74.7%和68.6%；受試菌株對(duì)阿米卡星的耐藥率最低，僅為8.3%；受試菌株對(duì)硝基呋喃類藥物呋喃唑酮的耐藥率也較低，為12.7%；臨床分離的大腸桿菌對(duì)頭孢西丁、奈替米星的耐藥率均在10.0%以下；對(duì)頭孢類藥物的耐藥率為9.2%～43.2%，其中對(duì)一代頭孢類藥物頭孢唑啉的耐藥率最高，為43.2%；所有菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥性，耐藥率為34.5%-47.6%；受試菌株對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥性在不同藥物間存在很大差異，對(duì)鏈霉素和卡那霉素的耐藥率較高，分別為68.6%和41.5%；對(duì)新霉素和慶大霉素的耐藥率為32.8%和32.3%（表1）。

2.2患病動(dòng)物場(chǎng)與健康動(dòng)物場(chǎng)大腸桿菌分離株的耐藥率比較 對(duì)來源于患病動(dòng)物場(chǎng)與健康動(dòng)物場(chǎng)大腸桿菌對(duì)28種抗菌藥物進(jìn)行敏感性分析，發(fā)現(xiàn)無論是患病動(dòng)物場(chǎng)還是健康動(dòng)物場(chǎng)大腸桿菌分離株都對(duì)四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、多西環(huán)素、氨芐西林和阿莫西林表現(xiàn)出較高的耐藥性，耐藥率在65.0%以上；患病動(dòng)物場(chǎng)大腸桿菌分離株除對(duì)頭孢西丁、阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦和奈替米星的耐藥率低于20.0%以外，其他藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性?；疾?dòng)物場(chǎng)大腸桿菌分離株對(duì)大部分藥物的耐藥率均極顯著高于健康動(dòng)物場(chǎng)（P<0.01）。健康動(dòng)物場(chǎng)大腸桿菌分離株除對(duì)奈替米星、阿米卡星、呋喃唑酮、氨芐西林/舒巴坦和頭孢西丁比較敏感（耐藥率分別為1.7%、2.5%、3.3%、5.0%、6.7%）外，其他藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，除上述高度耐藥的5種藥物和較為敏感的5種藥物以外，對(duì)其余18種藥物的耐藥率為12.6%～57.1%；對(duì)于頭孢類藥物，229株大腸桿菌都對(duì)一代頭孢類具有較高的耐藥率，均在39.5%以上；229株大腸桿菌對(duì)二代頭孢類的耐藥率較低，特別是頭孢西丁，耐藥率低于11.8%；在氨基糖苷類藥物中，健康動(dòng)物場(chǎng)大腸桿菌分離株對(duì)鏈霉素有較強(qiáng)的耐藥性，耐藥率達(dá)57.1%；在氟喹諾酮類藥物中，大腸桿菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率最高，為38.7%；健康動(dòng)物場(chǎng)大腸桿菌分離株對(duì)氯霉素和氟苯尼考也表現(xiàn)出較高的耐藥性，耐藥率分別為45.4%和42.0%（表2）。

2.3229株大腸桿菌分離株多重耐藥性分析 從圖1可以看出，229株分離大腸桿菌分離株多重耐藥情況嚴(yán)重而復(fù)雜，其中9耐的菌株數(shù)最多，有23株，占總菌株數(shù)的10.0%；每種多重耐藥類型均有菌株分布，特別是2～16和18耐，均有8株以上菌株分布，共有173株，占總菌株數(shù)的75.5%；有1株大腸桿菌對(duì)28種藥物均耐藥，27、26、25耐也各有1株；有13株分離菌只對(duì)1種藥物敏感，只有1株健康動(dòng)物場(chǎng)的大腸桿菌分離株對(duì)28種藥物敏感。

從圖2可以看出，患病動(dòng)物（場(chǎng)）110株大腸桿菌分離株的多重耐藥性主要分布在9、12、14、18、19耐，共40株，占總分離株的36.4%；健康動(dòng)物（場(chǎng)）119株大腸桿菌分離株的多重耐藥性主要分布在3～10耐，共61株，占總分離株的51.3%。18耐以上的分離株，患病動(dòng)物場(chǎng)有38株，占比34.5%；健康動(dòng)物場(chǎng)有9株，占比7.6%。大腸桿菌耐藥性與飼養(yǎng)管理和用藥情況有關(guān)，抗生素用量越多、種類越復(fù)雜，其耐藥性越嚴(yán)重，多重耐藥現(xiàn)象也就越嚴(yán)重。在實(shí)際生產(chǎn)中，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，采取綜合措施來預(yù)防疾病，少用抗菌藥物，是控制細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性與多重耐藥情況的必要方法。

3討論與結(jié)論

隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)集約化的發(fā)展、抗生素的出現(xiàn)和科技的進(jìn)步，養(yǎng)殖業(yè)細(xì)菌性疾病得到了一定控制，但由于抗菌藥物的不合理使用和抗生素濫用，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，特別是大腸桿菌耐藥性問題尤為嚴(yán)重。20世紀(jì)50～60年代分離的大腸桿菌對(duì)獸醫(yī)常用藥物非常敏感，20世紀(jì)70年代分離菌產(chǎn)生了耐藥性，20世紀(jì)80年代至90年代初分離菌對(duì)抗菌藥的耐藥性十分普遍，多重耐藥性呈上升趨勢(shì)。近年來，大腸桿菌病已成為畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)主要細(xì)菌性疾病，給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

該研究通過對(duì)2012年1-11月廣東地區(qū)10個(gè)市（縣）229株家禽養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌分離株對(duì)28種抗菌藥物的耐藥情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)229株大腸桿菌分離株對(duì)四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲嗯唑、氨芐西林和阿莫西林高度耐藥，可能與這4種藥物通常作為家禽飼料藥物添加劑使用有關(guān)。由于患病動(dòng)物場(chǎng)用藥量大、用藥次數(shù)較多且長(zhǎng)期使用氟喹諾酮類、氨基糖苷類、氯霉素類等藥物，因此患病動(dòng)物場(chǎng)大腸桿菌分離株對(duì)這幾種藥物的耐藥性顯著高于健康動(dòng)物場(chǎng)。氯霉素在被禁用后仍然表現(xiàn)出很高的耐藥率（55.5%），同類藥物氟苯尼考也表現(xiàn)出較高的耐藥率（51.5%）。此外，229株大腸桿菌分離株對(duì)氨芐西林的耐藥率為75.5%，而對(duì)氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為10.5%，這2種藥物聯(lián)合使用后耐藥率明顯下降，提示養(yǎng)殖場(chǎng)在臨床抗菌藥物的選擇上應(yīng)盡量采用聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式，充分發(fā)揮抗生素間的協(xié)同作用，避免細(xì)菌與某單一藥物長(zhǎng)期接觸。各養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)該嚴(yán)格控制在飼料和飲水中添加抗菌藥物，應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，采取預(yù)防措施，重視疾病的前期預(yù)防，少用抗菌藥物，控制并逐漸降低細(xì)菌耐藥性和多重耐藥現(xiàn)象。

抗菌藥物的廣泛使用、連續(xù)使用及使用方法不當(dāng)，對(duì)細(xì)菌的生存環(huán)境產(chǎn)生了壓力，這種環(huán)境壓力因素可能通過多種機(jī)制導(dǎo)致病原菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。229株大腸桿菌分離株對(duì)頭孢菌素類藥物也表現(xiàn)出較高的耐藥率，特別是對(duì)一代頭孢菌素的耐藥率達(dá)39.5%；二代頭孢菌素藥物中，患病養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌分離株對(duì)頭孢西丁的耐藥率為11.8%，健康養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌分離株對(duì)頭孢西丁的耐藥率為6.8%；健康養(yǎng)殖場(chǎng)和患病養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌分離株對(duì)頭孢呋辛的耐藥率分別為37.2%和32.0%。這可能是因?yàn)榧仪蒺B(yǎng)殖場(chǎng)頭孢菌素類藥物的廣泛使用，增加了耐頭孢菌素類菌株的出現(xiàn)。該類藥物還存在交叉耐藥現(xiàn)象，一旦耐藥菌傳播擴(kuò)散到人群中，將會(huì)造成人類臨床治療的困難，因此獸醫(yī)臨床要慎重使用此類藥物。